黃芪多糖對人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤Wnt基因轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

邱艷麗，丁　妍， 陳德森

(1. 湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)，湖北 十堰 442000；2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000)

子宮內(nèi)膜癌(EC)是婦科三大惡性腫瘤之一，占婦科惡性腫瘤的70%以上，病死率僅次于卵巢癌，其發(fā)病率呈持續(xù)增高趨勢，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康[1-2]。Wnt基因轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)因子β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及其基因表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生密切相關(guān)，Wnt通路能通過β-catenin或E-cadherin蛋白與胞膜受體特異性結(jié)合而引發(fā)一連串級聯(lián)反應(yīng)，最終引起細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)改變，Wnt通路異常調(diào)控與子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生有重要相關(guān)性[3-4]。目前抗腫瘤的中醫(yī)藥研究熱點較多，如黃芪、當(dāng)歸等。黃芪多糖是中藥黃芪的主要有效成分，具有抗腫瘤的藥理作用[5]，但其在抗子宮內(nèi)膜癌方面鮮有研究。本研究通過觀察黃芪多糖對人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤Wnt基因轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)因子β-catenin和E-cadherin表達(dá)的影響，探討了黃芪多糖抗子宮內(nèi)膜癌的作用及可能機制，旨在為其臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1　實驗資料

1.1實驗動物SPF級雌性BALB/c品系裸小鼠30只，鼠齡4～5周，體質(zhì)量(17.5±2.5)g，購自湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SCXK(鄂)2016-0008。采用隨機數(shù)字表編號后隨機分為對照組、模型組、黃芪多糖組，每組10只。

1.2藥物和試劑黃芪多糖注射液(北京維德爾生物科技有限公司)，按小鼠體表面積換算黃芪多糖注射液用量為0.2 mL/(kg·d)；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；β-catenin和E-cadherin兩步法免疫組化檢測試劑盒(北京博凌科為生物科技有限公司)；β-catenin和E-cadherin引物(南京建成生物工程研究所)；人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa腫瘤細(xì)胞(十堰市太和醫(yī)院生物科學(xué)研究所提供)。

1.3人子宮內(nèi)膜癌裸鼠皮下移植瘤模型建立及干預(yù)先將人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系Ishikawa腫瘤細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃孵育箱培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。待Ishikawa腫瘤細(xì)胞呈對數(shù)生長期時，可觀察到Ishikawa腫瘤細(xì)胞沿培養(yǎng)瓶底生長，當(dāng)生長達(dá)培養(yǎng)瓶底75%～85%時，棄掉培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次，再用0.25%胰蛋白酶消化，收集腫瘤細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，用PBS重懸腫瘤細(xì)胞，然后制成 5×105mL-1Ishikawa細(xì)胞懸液備用。接種時在無菌條件下抽取Ishikawa瘤細(xì)胞懸液，按0.2 mL/鼠的劑量皮下注射于裸鼠右側(cè)肩胛背部。接種后繼續(xù)在SPF級層流室內(nèi)飼養(yǎng)，每天觀察其右側(cè)肩胛背部是否有腫瘤生長，以接種部位出現(xiàn)腫瘤小結(jié)節(jié)或觸及有小結(jié)節(jié)為成瘤標(biāo)準(zhǔn)，一般4周后即可成瘤，如第1次接種失敗，可酌情再次接種Ishikawa瘤細(xì)胞直到成瘤[6]。本實驗4周后所有造模裸小鼠均成瘤。 成瘤后，黃芪多糖組給予黃芪多糖注射液0.2 mL/(kg·d)肌肉注射，對照組、模型組肌肉注射等量生理鹽水，均連續(xù)14 d。

1.4檢測指標(biāo)和方法

1.4.1移植瘤抑瘤率檢測實驗結(jié)束后處死所有大鼠，摘取瘤體，分離包膜，稱質(zhì)量，用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確測量瘤體長、短徑各3次，取其均值計算瘤體積。瘤體積=腫瘤長徑×腫瘤短徑/2。抑瘤率= (模型組平均瘤質(zhì)量-黃芪多糖組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

1.4.2β-catenin和E-cadherin蛋白表達(dá)檢測取瘤組織(對照組取子宮內(nèi)膜組織)，采用二步法行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測β-catenin和E-cadherin蛋白表達(dá)情況。E-cadherin和β-catenin陽性判定：細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)棕黃色。在高倍視野下，每張切片均隨機選取6個視野進行結(jié)果判定。記分采用3個參數(shù)的半定量分析：即陽性細(xì)胞數(shù)、染色強度及兩者記分的乘積。判定標(biāo)準(zhǔn)：棕褐色3分，棕黃色2分，淡黃色1分，無著色0分；陽性細(xì)胞數(shù)量分級和記分標(biāo)準(zhǔn)：1個視野內(nèi)陽性著色細(xì)胞>75%為4分，>50%～75%為3分，>10%～50%計 2分，1%～10%計1分；無陽性細(xì)胞為陰性，計0分。將染色強度和陽性細(xì)胞數(shù)量兩項積分相加，結(jié)果判定：0～3分為陰性，4～7分為陽性[7]。

1.4.3β-catenin和E-cadherin mRNA表達(dá)檢測采用半定量RT-PCR檢測。取瘤體組織(對照組取子宮組織)約50 mg，勻漿，采用Trizol法提取組織中的總RNA，取1 μg 總RNA，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參， PCR擴增用 pfimer5 軟件設(shè)計引物。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min 變性，95 ℃、52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。以目的基因灰度值/GAPDH灰度值之比值表示β-catenin和E-cadherin mRNA的相對值[8]。β-catenin上游引物序列為5’-AGGCACTGGGGCTTCATCTGAC-3，下游引物序列為5’-GCCTTCCATCCCTTTGCTTAG-3，擴增產(chǎn)物長度為201 kDa；E-cadherin上游引物序列為5’-CCATGTCCAAAAGTGGTGTAAT-3，下游引物序列為5’-ATGGATGCATTGAGTGAAGTA-3，擴增產(chǎn)物長度為134 kDa；GAPDH上游引物序列為5’-GGAGAAACCTGCCAAGTATGAT-3，下游引物序列為5’-GAGTTGCTGTTGAAGTCG-3，擴增產(chǎn)物長度為125 kDa。

2　結(jié)　　果

2.1各組瘤質(zhì)量、瘤體積及抑瘤率比較對照組無腫瘤形成；黃芪多糖組瘤質(zhì)量、瘤體積均明顯低于模型組(P均<0.05)，抑瘤率明顯高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1　模型組和黃芪多糖組瘤質(zhì)量、瘤體積及抑瘤率比較

注：①與模型組比較，P<0.05。

2.2各組β-catenin和E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)情況對照組子宮組織中僅有少量β-catenin陽性表達(dá)，E-cadherin高表達(dá)。模型組瘤組織中β-catenin蛋白和β-catenin mRNA表達(dá)水平均明顯高于對照組(P均 <0.05)，而黃芪多糖組均明顯低于模型組(P均<0.05)；模型組瘤組織中E-cadherin蛋白和E-cadherin mRNA表達(dá)水平均明顯低于對照組(P均<0.05)，而黃芪多糖組均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組β-catenin和E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)情況

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3　討　　論

子宮內(nèi)膜癌早期發(fā)現(xiàn)后可采用手術(shù)和輔助放化療治療，但大多數(shù)患者臨床確診時已到中晚期，單純采用西醫(yī)治療難以獲得理想的療效。中醫(yī)藥在延緩病情進展、提高患者生存質(zhì)量等方面有其獨特優(yōu)勢，故更多患者在手術(shù)和輔助放化后或治療無望時求助于中醫(yī)治療[3]。中草藥黃芪富含多種微量元素，如皂苷、葉酸、黃芪多糖、氨基酸等，其中黃芪多糖具有抗菌、抗炎、抗氧化、利尿、護肝、抗應(yīng)激等作用[9-10]，可增強自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞等的活性，并通過促進免疫因子釋放強化機體免疫功能，促進細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖而產(chǎn)生抑癌抗癌作用[11-12]。目前對黃芪的研究比較深入，臨床應(yīng)用也比較廣泛，但黃芪多糖的抗腫瘤作用機制比較復(fù)雜，為此筆者進行了相關(guān)研究。

Wnt信號通路在胚胎的發(fā)育過程及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的啟動作用—Wnt通路被異常激活，而β-catenin是Wnt通路異常激活的關(guān)鍵因子。β-catenin作為癌基因，其與子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[13]。Wnt信號通路分經(jīng)典型和非經(jīng)典型途徑，經(jīng)典Wnt信號通路蛋白與膜受體卷曲蛋白結(jié)合，通過β-catenin核易位來激活靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，故經(jīng)典Wnt信號通路與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。研究表明，β-catenin如不能被糖原合成酶激酶3β磷酸化，可導(dǎo)致β-catenin不能被胞內(nèi)泛素識別，不能被蛋白酶復(fù)合體降解，這造成的后果是β-catenin大量游離聚集于胞質(zhì)中，當(dāng)β-catenin進入胞核與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強因子等結(jié)合后會刺激一系列靶基因表達(dá)，包括發(fā)育控制基因、腫瘤發(fā)生相關(guān)基因和細(xì)胞增殖調(diào)控基因，引起細(xì)胞增殖異常并最終導(dǎo)致細(xì)胞癌變[15]。E-cadherin蛋白是鈣依賴性黏附蛋白，廣泛分布于上皮細(xì)胞膜黏附區(qū)，故正常上皮組織中E-cadherin蛋白陽性表達(dá)，其介導(dǎo)同嗜性細(xì)胞黏附及細(xì)胞與細(xì)胞間的粘連，與β-catenin介導(dǎo)細(xì)胞與基質(zhì)連接，共同調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[16]。E-cadherin 蛋白在腫瘤組織中低表達(dá)或不表達(dá)，E-cadherin缺失或低表達(dá)可導(dǎo)致同型細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)及功能異常，使介導(dǎo)細(xì)胞的黏附功能降低或喪失而造成細(xì)胞無限制增生，導(dǎo)致腫瘤浸潤和擴散甚至轉(zhuǎn)移[17-18]。因此，研究黃芪多糖對Wnt通路相關(guān)因子β-catenin和E-cadherin蛋白及基因調(diào)控的影響具有重要意義。

在本實驗中，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖組E-cadherin蛋白表達(dá)增強、β-catenin表達(dá)減弱，RT-PCR結(jié)果顯示黃芪多糖組E-cadherin mRNA表達(dá)增強、β-catenin mRNA表達(dá)減弱，提示黃芪多糖是通過干預(yù)Wnt通路相關(guān)因子β-catenin和E-cadherin蛋白及基因調(diào)控達(dá)到抗癌作用的。在腫瘤分化增殖過程中，E-cadherin蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織中高表達(dá)，說明E-cadherin蛋白對維持子宮內(nèi)膜上皮完整性具有重要意義，當(dāng)E-cadherin蛋白表達(dá)陽性率降低時，細(xì)胞間的黏附功能降低，腫瘤細(xì)胞間會喪失接觸性抑制，使其更容易分離、增生、增殖、脫落和擴散。黃芪多糖可能作用于這一環(huán)節(jié)，通過提高E-cadherin蛋白及其基因表達(dá)，提高細(xì)胞間的黏附功能，使細(xì)胞分化增殖趨于正常，達(dá)到抑癌的目的。另一方面，黃芪多糖還可能通過抑制β-catenin蛋白，通過抑制Wnt基因轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮抗腫瘤作用。歐陽小明等[19]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可通過作用于β-catenin和E-cadherin等抑制Wnt基因轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活而起到抗腫瘤作用。細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性依賴E-cadherin和β-catenin形成E-cadherin/β-catenin 復(fù)合體來維持，在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及惡化過程中，E-cadherin表達(dá)降低會導(dǎo)致β-catenin從 E-cadherin/catenin 復(fù)合體中游離出來，Wnt 通路異常激活，β-catenin在胞漿中大量集聚并進入到細(xì)胞核，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與惡化[20]。在本研究中，黃芪多糖組β-catenin蛋白及其基因表達(dá)減弱，這可能是黃芪多糖通過提高E-cadherin蛋白及其基因表達(dá)來提高細(xì)胞間的黏附功能，并通過抑制β-catenin在胞漿中集聚，避免Wnt通路被異常激活而達(dá)到抗癌作用。另外黃芪多糖組瘤體積和瘤質(zhì)量均低于模型組，提示黃芪多糖具有抑制腫瘤生長的作用。

總之，黃芪多糖可促進E-cadherin蛋白和基因表達(dá)，抑制β-catenin蛋白和基因表達(dá)，通過調(diào)控Wnt基因轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮抗腫瘤作用。但黃芪抗腫瘤作用機制復(fù)雜，關(guān)于其防治子宮內(nèi)膜癌的其他作用機制還需進一步研究，以提高其臨床應(yīng)用范圍。

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