口蹄疫病毒O型抗體液相阻斷ELISA試驗(yàn)的測(cè)量不確定度評(píng)估

杜　鵑

（北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京　102629）

測(cè)量不確定度是與測(cè)量結(jié)果關(guān)聯(lián)的一個(gè)參數(shù)，用于表征合理賦予被測(cè)量值的分散性。測(cè)量結(jié)果的可信程度在很大程度上取決其不確定度的大小。1993 年由 ISO、IEC 和 IFCC 等 7個(gè)國(guó)際組織批準(zhǔn)發(fā)布了《測(cè)量不確定度表示指南》（GUM），并于2008年最新修訂[1]。1999年我國(guó)在等同采用GUM 的基礎(chǔ)上，也發(fā)布實(shí)施了《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，并于2012年最新修訂[2]。近年來，不確定度概念逐漸引入獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)領(lǐng)域。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》[3]中也對(duì)測(cè)量不確定度提出了要求。

ELISA 具有快速、靈敏和高通量等特點(diǎn)，且無需昂貴儀器，是目前基層獸醫(yī)檢測(cè)部門應(yīng)用的主要方法。本文對(duì)口蹄疫病毒O型抗體液相阻斷ELISA試驗(yàn)的測(cè)量不確定度進(jìn)行研究，希望能探索一種較為合理的ELISA檢測(cè)結(jié)果不確定度評(píng)估模式，并為獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開展相關(guān)工作提供借鑒。

1　材料和方法

1.1　樣品

口蹄疫病毒O型抗體陽(yáng)性、陰性血清：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.2　試劑

口蹄疫病毒O型抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒：批準(zhǔn)文號(hào)為（2006）新獸藥證字42號(hào)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，有效期內(nèi)使用。

1.3　儀器

酶標(biāo)儀：型號(hào)sunrise，瑞士Tecan公司產(chǎn)品；移液器：?jiǎn)瓮ǖ馈⒍嗤ǖ栏髁砍虜?shù)把，Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.4　檢測(cè)方法

應(yīng)用液相阻斷ELISA技術(shù)，檢測(cè)牛、羊或豬等偶蹄動(dòng)物血清中口蹄疫病毒O型抗體。

2　結(jié)果與分析

2.1　數(shù)學(xué)模型

根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫病毒O型抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒說明書提供的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算及判定方法，建立數(shù)學(xué)模型：

其中，B為cutoff臨界值與樣品判定濃度的OD450mm值的比值（影響結(jié)果判定的樣品稀釋倍數(shù)為1:64和1:128，故樣品判定濃度為1:64和1:128）；C.O.為cutoff臨界值；S為樣品判定濃度的OD450mm值。

其中，ˉAg為抗原對(duì)照的OD450mm均值（4孔陽(yáng)性對(duì)照，棄去最高和最低的OD450mm值，剩余2孔的平均OD450mm值）。

合并以上公式得：

2.2　不確定度來源分析

測(cè)量不確定度評(píng)定分為：A類評(píng)定，即重復(fù)樣本檢測(cè)引入的不確定度（uA）；B類評(píng)定，即所有可能影響測(cè)量結(jié)果的因素，從人員、設(shè)備、材料、方法、環(huán)境及被測(cè)量對(duì)象等幾個(gè)方面全面考慮，不可遺漏，也不可重復(fù)。根據(jù)檢測(cè)方法原理發(fā)現(xiàn)，影響cutoff 臨界值與樣品判定濃度的OD450mm值比值（B）的因素有：試劑盒的穩(wěn)定性，移液器加樣量，各步驟反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度，洗板的清洗程度和酶標(biāo)儀的測(cè)量等。但本實(shí)驗(yàn)室使用同批次試劑盒，嚴(yán)格控制各步驟反應(yīng)時(shí)間在±2 min 范圍內(nèi)，反應(yīng)溫度在±1 ℃范圍內(nèi)，并嚴(yán)格使用同型號(hào)、同參數(shù)設(shè)定的洗板機(jī)洗板，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)嚴(yán)格控制這些因素后，其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響較小，故本文不考慮其引入的不確定度。綜合上述不確定度來源的分析和建立的數(shù)學(xué)模型，認(rèn)為cutoff 臨界值與樣品判定濃度的OD450mm值的比值的不確定度來源主要包括：（1）抗原對(duì)照的OD450mm均值（ˉAg）的不確定度uAg；（2）檢測(cè)樣品判定濃度的OD450mm值（S）的不確定度us。

2.2.1抗原對(duì)照OD450mm均值（ˉAg）的不確定度（uAg）來源 根據(jù)檢測(cè)原理、試劑盒說明書和試劑確認(rèn)試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)抗原對(duì)照OD450mm均值（ˉAg）的不確定度主要由以下分量貢獻(xiàn)：（a）抗原對(duì)照的A類不確定度（uA1）；（b）抗原工作濃度引入的不確定度（uC1）；（c）抗原加樣量引入的不確定度（uV1）；（d）口蹄疫病毒O型豚鼠抗體工作液加樣量引入的不確定度（uV3）；（e）兔抗豚鼠IgG-HRP工作液加樣量引入的不確定度（uV4）；（f）酶標(biāo)儀的測(cè)量不確定度（uE）。

2.2.2檢測(cè)樣品判定濃度的OD450mm值（S）的不確定度（uS）來源 根據(jù)檢測(cè)原理、試劑盒說明書和試劑確認(rèn)試驗(yàn)分析，檢測(cè)樣品判定濃度的OD450mm值（S）的不確定度主要由以下分量貢獻(xiàn)：（a）檢測(cè)樣品的A類不確定度（uA2）；（b）抗原工作濃度引入的不確定度（uC1）；（c）樣品判定濃度引入的不確定度（uC2）；（d）抗原抗體混合液加樣量引入的不確定度（uV2）；（e）口蹄疫O型豚鼠抗體工作液加樣量引入的不確定度（uV3）；（f）兔抗豚鼠IgG-HRP工作液加樣量引入的不確定度（uV4）；（g）酶標(biāo)儀的測(cè)量不確定度（uE）。

2.3　測(cè)量不確定度評(píng)定

2.3.1抗原對(duì)照OD450mm均值的A類不確定度評(píng)定uA1是由抗原對(duì)照的重復(fù)檢測(cè)引入的不確定度。5個(gè)工作濃度抗原對(duì)照，根據(jù)《測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南》（CNAS—GL05:2011）[4]，按公式（4）計(jì)算重復(fù)測(cè)試引起的uA1。其中，S（xi）為樣品重復(fù)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)差；xi為每次重復(fù)的測(cè)量值；ˉX為重復(fù)測(cè)量值的平均值；n為重復(fù)次數(shù)。uA1計(jì)算結(jié)果見表1。

表1　抗原對(duì)照OD450mm均值的A類不確定度評(píng)定

2.3.2檢測(cè)樣品判定濃度的OD450mm值的A類不確定度評(píng)定uA2是由樣品重復(fù)檢測(cè)引入的不確定度。對(duì)5個(gè)重復(fù)樣品血清，分別進(jìn)行倍比稀釋，取1:64/1:128稀釋倍數(shù)下的5個(gè)重復(fù)測(cè)量數(shù)值，根據(jù)CNAS—GL05:2011，由公式（4）計(jì)算重復(fù)測(cè)試引起的uA2。計(jì)算結(jié)果見表2。

表2　檢測(cè)樣品判定濃度的A類不確定度評(píng)定

2.3.3移液器加樣引入的不確定度（uV）

2.3.3.1移液器容量誤差引入的不確定度 《移液器檢定規(guī)程》[5-6]要求：50 μL 移液器在25、50 μL檢定點(diǎn)的容量允許誤差a分別為±4.0%、±3.0%；1 000 μL移液器在500、1 000 μL檢定點(diǎn)的容量允許誤差a均為±1.0%。按矩形分布計(jì)算，根據(jù)公式（5）計(jì)算得出：uV25-P=0.023 094（μL）；uV50-P=0.017 321（mL）；uV500-P=uV1000-P=0.005 773（μL）。

2.3.3.2環(huán)境溫度對(duì)水體積效應(yīng)引入的不確定度 移液器在20 ℃下檢定，假設(shè)實(shí)驗(yàn)室溫度在20 ℃±4 ℃之間波動(dòng)（a=4），水的膨脹系數(shù)（r）為2.1×10-4/℃，按矩形分布計(jì)算，根據(jù)公式（6）計(jì)算得出：uV25-T=0.012 124（μL）；uV50-T=0.024 249（μL）；uV500-T=0.242487（μL）；uV1000-T=0.484 974（μL）。

容量誤差和溫度-體積效應(yīng)引入的不確定度相互獨(dú)立，故移液器加樣引入的不確定度根據(jù)公式（7）計(jì)算得出：=0.485 008（μL）。根據(jù)試劑盒說明書：抗原對(duì)照轉(zhuǎn)板加樣量、抗原抗體混合液轉(zhuǎn)板加樣量、口蹄疫O型豚鼠抗體工作液加樣量、兔抗豚鼠IgG-HRP工作液加樣量均為50 μL /孔，故uV1=uV2=uV3=uV4=uV50=0.029 803（μL）。

2.3.4抗原工作濃度引入的不確定度uC1抗原工作濃度（1:15）配制過程為：500 μL抗原中加7 000 μL PBST（分7次，1 000 μL/次）?？乖ぷ鳚舛龋–1）根據(jù)公式（8）計(jì)算；抗原工作濃度的不確定度根據(jù)公式（9）計(jì)算：

2.3.5樣品判定濃度（抗原抗體混合液）引入的不確定度uC2檢測(cè)樣品稀釋過程：25 μL待檢血清中加75 μL PBST（分25、50 μL加），混勻取50 μL混合液、50 μL PBST（判定濃度1:64時(shí)此步驟重復(fù)3次；判定濃度1:128時(shí)此步驟重復(fù)4次），取50 μL混合液，然后加入50 μL抗原工作液。樣品判定濃度根據(jù)公式（10、11）計(jì)算；樣品判定濃度引入的不確定度可由公式（9）計(jì)算：

2.3.6酶標(biāo)儀的測(cè)量不確定度uE酶標(biāo)儀（SUNRISE）的校準(zhǔn)證書給出，示值穩(wěn)定性為0.001，吸光度重復(fù)性為0.1%（標(biāo)準(zhǔn)為1.0），通道差異為0.006。依據(jù)經(jīng)驗(yàn)假設(shè)酶標(biāo)儀測(cè)量的吸光度值、吸光度重復(fù)性、通道差異等均勻地落在其區(qū)間內(nèi)，按矩形分布計(jì)算，示值穩(wěn)定性引入的不確定度=0.000 289；吸光度重復(fù)性引入的不確定度：uE2==0.000 289；通道差異引入的不確定度：uE3=酶標(biāo)儀（SUNRISE）的校準(zhǔn)證書給出，吸光度示值誤差0.2～0.5：U=0.018（k=2）；1.0～1.5：U=0.020（k=2）；檢定用濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)吸光度（0.2～1.5）：U=0.010×A（k=2），則吸光度示值誤差引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度檢定用濾光片標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度uE6=由于各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量互不相關(guān)，故酶標(biāo)儀的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)不確定度（uE）為：

2.3.7評(píng)定合成抗原對(duì)照OD450mm均值測(cè)算引入的不確定度（uAg） 評(píng)定合成抗原對(duì)照OD450mm均值的測(cè)量不確定度，各不確定度分量的靈敏系數(shù)通過實(shí)驗(yàn)確定。結(jié)果見表3。由于各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量互不相關(guān)，抗原對(duì)照OD450mm均值測(cè)算引入的測(cè)量不確定度

表3　uAg的各不確定度分量的靈敏系數(shù)

2.3.8評(píng)定合成樣品判定濃度的OD450mm值檢測(cè)引入的測(cè)量不確定度（uS） 評(píng)定合成檢測(cè)樣品判定濃度的OD450mm值的測(cè)量不確定度，各不確定度分量的靈敏系數(shù)通過實(shí)驗(yàn)確定。結(jié)果見表4。由于各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量互不相關(guān)，故待檢樣品判定濃度的OD450mm值檢測(cè)引入的測(cè)量不確定度為：待檢樣品判定濃度為1:64時(shí)

待檢樣品判定濃度為1:128時(shí)

表4　uS的各不確定度分量的靈敏系數(shù)

2.3.9評(píng)定合成cutoff 臨界值與樣品判定濃度的OD450mm值的比值（B）的不確定度 根據(jù)公式（3），cutoff 臨界值與樣品判定濃度的OD450mm值的比值（B）的不確定度可由公式（12）計(jì)算。本次檢測(cè)抗原對(duì)照（棄去最高和最低孔后）的OD450mm均值為1.582，cutoff臨界值為0.791，樣品稀釋倍數(shù)1:64的OD450mm值為0.156，稀釋倍數(shù)1:128的OD450mm值為0.569，故本例樣品判定濃度為1:128，cutoff臨界值與樣品判定濃度的OD450mm值的比值為1.390 158。將檢測(cè)數(shù)據(jù)和各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量代入公式（12），得到cutoff 臨界值與樣品判定濃度的OD450mm值的比值（B）的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4　擴(kuò)展不確定度評(píng)定

擴(kuò)展不確定度按照公式（13）計(jì)算。取k=2，則本例樣品cutoff 臨界值與樣品判定濃度的OD450mm值的比值的擴(kuò)展不確定度為：U=kuB=2×0.110 490=0.220 980，進(jìn)行數(shù)字修正后U=0.221。

2.5　測(cè)量結(jié)果表示

本例樣品cutoff 臨界值與樣品判定濃度的OD450mm值的比值的檢測(cè)結(jié)果和擴(kuò)展不確定度為：B=1.390；U=0.221；k=2。

3　討論

3.1　檢測(cè)結(jié)果的判定

根據(jù)試劑盒說明書中血清抗體效價(jià)及結(jié)果判定：被檢血清OD450mm值大于臨界值的孔為陰性孔，小于等于臨界值的孔為陽(yáng)性孔。若臨界值與稀釋倍數(shù)最高陽(yáng)性孔的OD450mm值相同，則以被檢血清陽(yáng)性孔的最高稀釋倍數(shù)作為該份血清的抗體效價(jià)；若臨界值處于兩個(gè)稀釋孔OD450mm值之間，抗體效價(jià)取相鄰陽(yáng)性孔和陰性孔稀釋倍數(shù)的反對(duì)數(shù)值中間值?？贵w效價(jià)大于或等于1:128判為口蹄疫O型抗體陽(yáng)性；1:64～1:128時(shí)，判為可疑；小于1:64，判定為陰性。對(duì)可疑血清樣品，可以重測(cè)。重測(cè)抗體效價(jià)大于或等于1:128，判為陽(yáng)性，小于1:128，判為陰性。

即臨界值大于等于被檢血清稀釋倍數(shù)1:128的OD450mm值時(shí)判定為陽(yáng)性；臨界值在被檢血清稀釋倍數(shù)1:64與1:128的OD450mm值之間時(shí)判為可疑；臨界值小于被檢血清稀釋倍數(shù)1:64的OD450mm值時(shí)判定為陰性。對(duì)可疑樣品可以重測(cè)。臨界值大于等于被檢血清稀釋倍數(shù)1:128的OD450mm值時(shí)判定為陽(yáng)性；臨界值小于被檢血清稀釋倍數(shù)1:128的OD450mm值時(shí)判定為陰性。因此建立數(shù)學(xué)模型公式（1）。結(jié)果判定為：臨界值更接近樣品稀釋倍數(shù)1:128的OD450mm值時(shí)，樣品判定濃度為1:128，cutoff臨界值與樣品稀釋倍數(shù)1:128的OD450mm值的比值（B）≥1判定結(jié)果為陽(yáng)性；臨界值更接近樣品稀釋倍數(shù)1:64的OD450mm值時(shí)，樣品判定濃度為1:64，cutoff臨界值與樣品稀釋倍數(shù)1:64的OD450mm值的比值（B1）＜1判定結(jié)果為陰性，其他為可疑，可疑樣品可以重測(cè)，并以1:128為判定濃度，cutoff臨界值與樣品稀釋倍數(shù)1:128的OD450mm值的比值（B）≥1判定結(jié)果為陽(yáng)性，cutoff臨界值與樣品稀釋倍數(shù)1:128的OD450mm值的比值（B）＜1判定結(jié)果為陰性。

若考慮其測(cè)量不確定度對(duì)結(jié)果的影響，則有：樣品判定濃度為1:128時(shí)，（B±U）≥1判定結(jié)果為陽(yáng)性；樣品判定濃度為1:64時(shí)，（B±U）＜1判定結(jié)果為陰性，其他為可疑，可疑樣品可以重測(cè)。檢測(cè)結(jié)果落在B±U區(qū)間內(nèi)，若此區(qū)間與1有交叉，應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待并考慮重復(fù)檢測(cè)，可有效降低假陽(yáng)性、假陰性出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。

可疑樣品重復(fù)檢測(cè)時(shí)，以1:128為判定濃度，（B±U）≥1判定結(jié)果為陽(yáng)性，（B±U）＜1判定結(jié)果為陰性。若重復(fù)檢測(cè)時(shí)B±U區(qū)間與1有交叉，結(jié)合首次檢測(cè)結(jié)果考慮，首次結(jié)果以1:128為判定濃度，（B±U）＜1的判定結(jié)果為陰性，（B±U）與1仍有交叉的，考慮兩次接近陽(yáng)性判定值的可疑判為陽(yáng)性。

3.2　各分量的相對(duì)貢獻(xiàn)

通過分析各分量對(duì)檢測(cè)結(jié)果的不確定度的相對(duì)貢獻(xiàn)大小，可以看出影響檢測(cè)質(zhì)量的主要因素，并有針對(duì)性地改善或控制某些條件后，能有效提高檢測(cè)質(zhì)量，有利于實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制。在各主要分量的研究過程中發(fā)現(xiàn)，酶標(biāo)儀的測(cè)量對(duì)不確定度結(jié)果的影響最大，其次是1:128稀釋倍數(shù)下的樣品濃度（1:128判定濃度）。

酶標(biāo)儀的測(cè)量引入的不確定度很難通過一次檢測(cè)過程改善，可以通過良好的儀器使用習(xí)慣、嚴(yán)格按照儀器的期間核查規(guī)程、維護(hù)規(guī)程核查和維護(hù)，并合理利用檢定校準(zhǔn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步減小酶標(biāo)儀的測(cè)量引入的不確定度。1:128判定濃度引入的不確定度改善，主要是在倍比稀釋過程中提高警惕，每步吹打混勻的次數(shù)要達(dá)到7～9次，使每步稀釋過程充分混勻，提高判定濃度的穩(wěn)定性，從而減小其引入的不確定度，提高檢測(cè)質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] BIPM，IEC，IFCC，ISO，IUPAC，IUPAP，OIML.Guide to the expression of uncertainty in measurement（GUM）[S]. Geneva：The International Organization for standardization，2008.

[2] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示：JJF1059.1—2012[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[3] World Organization for Animal Health（OIE）. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals[M].6th ed. Paris：OIE，2008.

[4] 中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì). 測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南：CNAS-GL05:2011[S]. 北京：中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，2011.

[5] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 移液器檢定規(guī)程：JJG646－2006[S]. 北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2006.

[6] 史喜菊，馬貴平，李冰玲，等. 牛布魯菌病補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)測(cè)量不確定度評(píng)估[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，2013，49（5）：65-69

[7] 謝軍，殷錦堂，王然，等. ELISA 法檢測(cè)血清 HIV 抗原抗體的測(cè)量不確定度評(píng)定[J]. 甘肅醫(yī)藥，2012，31（1）：24-28