豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒一步法雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，山東濱州　256600）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種高度接觸性、致死性豬傳染病，臨床上以高熱稽留、皮膚和黏膜出現(xiàn)大量出血點(diǎn)和高死亡率為主要特征。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為法定通報傳染病之一[1]，我國將其列為一類動物疫病。近年來，我國豬CSF的流行特點(diǎn)發(fā)生了改變，出現(xiàn)了所謂的“非典型豬瘟”“溫和型豬瘟”和“帶毒母豬綜合征”[2]，臨床癥狀與剖檢病變均不典型[3]，同時存在著與其它病原的混合感染。這對CSF的臨床診斷帶來了很大困難。

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的一種接觸性豬傳染病，臨床上主要表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙，以及各年齡段豬群，特別是仔豬的嚴(yán)重呼吸道癥狀[4]。

PRRS在臨床上很難與其它病原鑒別，且常與CSF混合感染，只能通過實(shí)驗(yàn)室確診。傳統(tǒng)的CSF、PRRS診斷方法主要包括病毒分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、膠體金試紙條、熒光抗體試驗(yàn)、常規(guī)RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)、橫向流動試紙條技術(shù)、膠體檢測法等。這些方法在敏感性、特異性、時效性等方面都存在各自的不足，尤其不適于病毒感染的早期快速診斷。比如：病毒分離鑒定耗時長；血清學(xué)方法可能會出現(xiàn)一定的交叉反應(yīng)，且敏感性低，不能用于早期檢測；常規(guī)RT-PCR技術(shù)不能對病毒進(jìn)行定量；環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；橫向流動試紙條技術(shù)目前還不太成熟，沒有大規(guī)模推廣應(yīng)用；膠體金檢測雖然方便，適合基層應(yīng)用，但敏感性太低，有時特異性不好，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

熒光定量PCR技術(shù)經(jīng)過20多年發(fā)展已經(jīng)成熟，同時由于便攜式熒光定量PCR儀的研發(fā)成功，使其檢測成本大幅度降低，是當(dāng)前最適用的臨床檢測技術(shù)。本研究根據(jù)CSFV和PRRSV基因序列，分別設(shè)計(jì)引物和探針，通過優(yōu)化熒光RT-PCR檢測條件，建立的適合現(xiàn)場檢測的TaqMan一步法熒光RT-PCR檢測方法，可對CSF和PRRS進(jìn)行快速診斷，為這兩種疾病的早期快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查、防控和凈化奠定了基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　病毒株與病料

CSFV、PRRSV、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）由本實(shí)驗(yàn)室保存；臨床檢測病料為2017年1月至2017年11月采自山東省各地豬場臨床診斷為疑似CSFV和PRRSV感染的豬扁桃體、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)等。

1.2　試劑和試劑盒

Taq DNA聚合酶、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTPs、pMD18-T載體、DL2000 Marker、PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2：購自寶生物工程（大連）有限公司；AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒：購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.3　引物和探針

應(yīng)用DNAStar軟件，對GenBank中收錄的CSFV基因組序列進(jìn)行比對分析；應(yīng)用生物學(xué)軟件，分別設(shè)計(jì)2對引物及相應(yīng)TaqMan探針。其中，一對引物及相應(yīng)的探針擴(kuò)增CSFV。引物序列為CSFV-F1：5′-AGTAGTTCGACGTGAGCA-3′；CSFV-R1：5′-CCCATCACATGGTGTGATTTCACC-3′；特異性探針為P 1：5′-F A MTGAGCAGGAGCCCACCTCGAGATGCT -3′。另一對引物及相應(yīng)的探針擴(kuò)增PRRSV。引物序列為PRRSV-F1：5′-GGTTGGCTTTTGCTGTTGGT-3′；PRRSV-R1：5′-GGTCCCAAGGTTTGAGAAGCT-3′；特異性探針為P 2：5′-H E XCCCAGTCGGCAATGCTTGTGAGT -3′。

1.4　病毒核酸提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書，提取CSFV和PRRSV的RNA，及PPV、JEV、PRV、PCV2等的核酸，并將其作為模板。

1.5　熒光RT-PCR檢測方法的建立和優(yōu)化

按照PrimeScript? OneStep RT-PCR Kit Ver.2說明配置反應(yīng)體系。體系總體積為25μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，CSFV-F1、CSFV-R1和P1、PRRSV-F2、PRRSV-R2和P2若干，PrimeScript?1 step Enzyme Mix 1.0 μL，模板RNA 2 μL，其余用RNase free dH2O補(bǔ)齊。離心數(shù)秒后，放入MyGo mini實(shí)時熒光定量PCR儀，進(jìn)行實(shí)時PCR擴(kuò)增，對熒光RT-PCR程序進(jìn)行優(yōu)化，同時對反應(yīng)體系中的引物和探針濃度進(jìn)行篩選，以獲得最低CT值和較高的熒光強(qiáng)度增加值。

1.6　熒光RT-PCR靈敏度檢測

參照文獻(xiàn)[5-6]測定CSFV和PRRSV 的TCID50。將病毒培養(yǎng)液進(jìn)行10倍系列稀釋，各取100 μL病毒稀釋液，經(jīng)AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒抽提核酸后，進(jìn)行熒光RT-PCR檢測，重復(fù)3次，確定最低檢測靈敏度。

1.7　熒光RT-PCR特異性、重復(fù)性試驗(yàn)

利用建立起的熒光RT-PCR法，分別對CSFV、PRRSV、CSFV和PRRSV混合毒，以及PPV、JEV、PRV、PCV2進(jìn)行檢測，以驗(yàn)證其特異性。對CSFV和PRRSV的細(xì)胞培養(yǎng)液分別做10倍系列稀釋，每個梯度同時重復(fù)檢測3次，記錄CT值，然后分別計(jì)算CSFV和PRRSV組內(nèi)檢測變異系數(shù)。

1.8　臨床樣品檢測

用建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR法，對從山東省各地收集的173份臨床疑似病料進(jìn)行CSFV和PRRSV檢測，同時用常規(guī)RT-PCR法及單重?zé)晒舛縍T-PCR法進(jìn)行檢測，比較三者的檢測結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1　熒光RT–PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

優(yōu)化結(jié)果表明，在25 μL反應(yīng)體系中，擴(kuò)增效果最佳的引物和探針濃度分別為：1 μL CSFV-F1（15 μmol/L），1.2 μLCSFV-R1（15 μmol/L），0.8 μLP1（5 μmol/L），1 μLPRRSV-F2（15 μmol/L），1.4 μLPRRSV-R2（15 μmol/L），1 μL P2（5 μmol/L）。優(yōu)化后的反應(yīng)程序?yàn)椋?0 ℃反轉(zhuǎn)錄10 min，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s（此時收集熒光）。

2.2　熒光RT-PCR靈敏度

CSFV和PRRSV細(xì)胞培養(yǎng)液病毒滴度分別為105.4和106.3TCID50/100 μL。當(dāng)CSFV等比稀釋到10-6，即病毒滴度稀釋到0.25TCID50/100 μL時，熒光RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果仍為陽性；當(dāng)PRRSV等比稀釋到10-6，即病毒滴度稀釋到1.99TCID50/100 μL時，熒光RTPCR擴(kuò)增結(jié)果仍為陽性。

2.3　特異性檢驗(yàn)

按建立的方法，對CSFV、PRRSV、CSFV和PRRSV混合毒，以及PPV、JEV、PRV、PCV2的陽性樣品進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測。結(jié)果顯示：CSFV樣品孔FAM熒光檢測出現(xiàn)了單一的S型擴(kuò)增曲線，說明CSFV疫苗毒株陽性；PRRSV樣品孔HEX熒光檢測出現(xiàn)了單一的S型擴(kuò)增曲線，說明PRRSV陽性；CSFV和PRRSV混合毒樣品孔FAM和HEX熒光檢測均出現(xiàn)了單一的S型擴(kuò)增曲線，說明CSFV和PRRSV均為陽性；其余樣品孔FAM和HEX熒光檢測均沒有S型擴(kuò)增曲線，表明建立的熒光RT-PCR檢測方法特異性良好。

2.4　熒光RT-PCR重復(fù)性試驗(yàn)

利用建立的熒光RT-PCR法，對CSFV和PRRSV細(xì)胞培養(yǎng)液分別進(jìn)行10倍系列稀釋，每個梯度同時重復(fù)檢測3次，記錄CT值，然后分別計(jì)算CSFV和PRRSV組內(nèi)、組間檢測的變異系數(shù)，發(fā)現(xiàn)樣品CT值、批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)CV值均小于2.0%，批間重復(fù)性試驗(yàn)CV值均小于1.0%，表明本方法的重復(fù)性好（表1）。

表1　實(shí)時熒光RT-PCR的組內(nèi)和組間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5　臨床樣品檢測

分別用建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR和普通RT-PCR方法，對臨床收集的172份疑似CSFV樣品進(jìn)行檢測，并與常規(guī)RT-PCR檢測方法進(jìn)行比較。雙重?zé)晒舛縍T-PCR結(jié)果顯示：172份病料中，35份為CSFV陽性，檢出率為20.2%；68份PRRSV陽性，檢出率為39.5%；7份CSFV和PRRSV均陽性。常規(guī)RT-PCR結(jié)果顯示：172份病料中，28份為CSFV陽性，檢出率為16.2%；57份PRRSV陽性，檢出率為32.9%；6份CSFV和PRRSV均陽性（表2）。雙重?zé)晒舛縍TPCR與常規(guī)RT-PCR符合率為82.6%。雙重?zé)晒舛縍T-PCR與單重?zé)晒舛縍T-PCR的結(jié)果相同，二者符合率為100%。從臨床檢測結(jié)果看出，雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢出率高于普通RT-PCR。

3　討論

馬超英等[7]建立了可以同時鑒別檢測CSFV和PRRSV的雙重RT-PCR方法。該方法能從CSFV和PRRSV分別擴(kuò)增出310和161 bp的特異性片段，對2種病毒混合基因組同時擴(kuò)增出310 bp和161 bp的特異性片段；該方法對JEV、豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、PPV、PCV2、PRV的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；該方法最低可以檢出0.2 pg病毒RNA含量。成丹等[8]應(yīng)用CSFV及北美洲型PRRSV特異性引物和TaqMan水解探針，建立一種同時檢測CSFV和PRRSV的復(fù)合熒光定量RT-PCR方法。該方法可檢測到3.2TCID50的CSFV和1.8TCID50的北美洲型PRRSV，比常規(guī)PCR方法敏感性高50倍以上。

表2　三種方法臨床樣品檢測陽性率 單位：%

核酸提取是PCR檢測的重要步驟。核酸提取的時間和質(zhì)量對PCR檢測的總時間和檢測效果均有重要的影響。本研究采用商品化核酸試劑提取核酸，主要采用吸附柱式，操作簡單、快速，提取時配合小型高速離心機(jī)，0.5 h即能完成提取。將經(jīng)典Triol法與該法進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果一致，說明提取的RNA質(zhì)量能完全滿足檢測要求。最重要的是該法的核酸提取時間遠(yuǎn)少于傳統(tǒng)Triol法。與磁株法相比的優(yōu)勢是所需要試劑少，操作簡單，試劑常溫保存即可，貯存和運(yùn)輸不需要低溫，適合現(xiàn)場檢測。

本研究建立的CSFV和PRRSV一步法雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法，只需在PCR反應(yīng)中加入反轉(zhuǎn)錄試劑即可，無需單獨(dú)反轉(zhuǎn)錄時間，可大幅縮減反應(yīng)所需時間，可在50 min內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)，得出檢測結(jié)果，不需特定實(shí)驗(yàn)室，無需電泳，比其他方法至少可節(jié)省1/2的時間和費(fèi)用。該法操作簡單，避免了由于多次操作及電泳而造成的污染問題，可檢測微量病毒，并可將人為因素對結(jié)果的影響降到最低。試驗(yàn)所用的熒光定量PCR儀尺寸小、重量輕、便于攜帶，適合用于現(xiàn)場快速檢測，從而節(jié)省送樣時間和樣品運(yùn)送途中的損耗，進(jìn)一步提高了檢測準(zhǔn)確性。為更加適用現(xiàn)場檢測需求，本試驗(yàn)將對檢測試劑的保存方式進(jìn)行了優(yōu)化。將所用檢測試劑配制完成后，加入凍干保護(hù)劑，并分裝到8聯(lián)管中凍干保存，實(shí)現(xiàn)了常溫保存和運(yùn)輸，使用時，只需要加入滅菌純化水和模板，即能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。這樣既簡化加樣步驟，又避免了操作過程的污染。

4　結(jié)論

本試驗(yàn)建立的CSFV和PRRSV一步法雙重?zé)晒釸T-PCR檢測方法，特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好，配合AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒，從核酸提取到報告檢測結(jié)果僅需1.5 h，檢測速度快，操作簡便，適合現(xiàn)場快速檢測。下一步利用該技術(shù)開發(fā)組裝成試劑盒。該試劑盒市場預(yù)期較好，適合基層CSF和PRRS的臨床快速診斷，可為制定相應(yīng)的防治措施，以及精準(zhǔn)評估和診斷母豬帶毒排毒、仔豬潛在感染，檢測母豬唾液、臍帶血中CSFV、PRRSV含量等提供技術(shù)支持，從而為CSF和PRRS的預(yù)警、疫苗免疫效果評估及防控凈化提供技術(shù)條件。

參考文獻(xiàn)：

[1] 仇華吉，童光志，沈榮顯. 豬瘟兔化弱毒疫苗——半個世紀(jì)的回顧[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（8）：1675-1685.

[2] 于新友，李天芝，苗立中，等. 分子生物學(xué)技術(shù)在豬瘟野毒與兔化弱毒鑒別診斷方法中的研究進(jìn)展[J]. 豬業(yè)科學(xué)，2015，32（1）：76-78.

[3] 涂長春. 豬瘟國際流行態(tài)勢、我國現(xiàn)狀及防制對策[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（8）：955-960.

[4] 蘇曉鷗，李玉榮，喬俊文，等. 豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）檢測方法的建立[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，32（1）：82-85.

[5] 戴志紅，蔣卉，李翠，等. 用間接免疫熒光檢測方法評價豬瘟兔化弱毒活疫苗效力的研究[J]. 中國獸藥雜志，2014，48（1）：34-37.

[6] 孟日增，劉金華，孟慶峰，等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒ZB株的分離與鑒定[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（17）：171-173.

[7] 馬超英，李宗文. 豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙重RT-PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（9）：71-75.

[8] 成丹，趙建軍，李娜，等. 同時檢測豬瘟病毒和北美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的復(fù)合熒光定量RTPCR方法的建立[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40（1）：72-77.