基于SSR標(biāo)記的海帶、裙帶菜的遺傳構(gòu)成分析

彭捷 崔翠菊 梁廣津 李言 武瑞娜 劉延嶺 田萍萍 李曉捷

（山東東方海洋科技股份有限公司 國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心 山東省海藻遺傳育種與栽培技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，煙臺 264003）

海帶（Saccharina japonica）是具異型世代交替的重要經(jīng)濟(jì)海藻。在食品、醫(yī)藥、工業(yè)及能源等方面都有巨大的應(yīng)用價值［1-3］。經(jīng)過半個多世紀(jì)的發(fā)展，我國的海帶養(yǎng)殖體系已經(jīng)較為成熟，養(yǎng)殖規(guī)模日趨壯大。創(chuàng)立于20世紀(jì)50年代的夏苗培育法，曾經(jīng)使我國的海帶養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生了一次巨大飛躍。但隨著海藻生物技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的育苗方法存在以下幾點(diǎn)不足：（1）培育時間長，成本較高，風(fēng)險大。（2）難以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定和高度一致的良種化養(yǎng)殖。種海帶混合采孢子使得栽培苗種容易混雜，難于保持品系的純度［4-6］。（3）種苗易發(fā)生病害并且能源消耗高［7］。近年來，利用海帶配子體克隆，將育種和育苗相結(jié)合的新方法，利用海帶雜種優(yōu)勢，克服了傳統(tǒng)育種和育苗技術(shù)的缺點(diǎn)和不足，工藝簡單、品種純度高、育苗時間短、不受季節(jié)限制、成本低［8-11］，既可延長優(yōu)良品種的壽命，又可作為雜交海帶育苗的保證。因此，配子體克隆成為海帶種質(zhì)資源保存和利用的主要手段，對海帶育種、育苗、生理及遺傳學(xué)研究越來越重要。

培育海帶高產(chǎn)新品種，為養(yǎng)殖業(yè)提供優(yōu)良苗種才能保障養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。近年來，作為海水養(yǎng)殖生物遺傳改良和品種培育高新技術(shù)之一，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速，目前主要用于海帶群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系分析、種質(zhì)鑒定等方面。如李言等［12-18］應(yīng)用RAPD、ISSR、SSR、AFLP和ITS標(biāo)記技術(shù)對海帶及長海帶進(jìn)行了遺傳多樣性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析。其中，微衛(wèi)星標(biāo)記（Simple sequence repeats，SSR）是一種常用的分子生物學(xué)標(biāo)記，由于它的共顯性特征，廣泛應(yīng)用于非模式生物的基因多樣性及親緣關(guān)系的分析［19-20］。已有報道表明，在海帶中可以用多態(tài)性高的微衛(wèi)星引物確定雜交品種的親緣關(guān)系［21］，以此了解種質(zhì)材料的遺傳信息。本研究采用不同物種微衛(wèi)星標(biāo)記（包括海帶SSR、裙帶菜SSR）以及海帶與裙帶菜的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）通用引物，在獲得可區(qū)分親本♀與親本♂配子體的數(shù)對微衛(wèi)星引物的基礎(chǔ)上，對不同試驗(yàn)組合子代樣品和其親本進(jìn)行遺傳構(gòu)成的分析，為育種材料的選擇提供準(zhǔn)確的參考信息，通過對配子體克隆和孢子體幼苗的初代篩選，使得培育出純度更高，性狀更優(yōu)良的海帶與裙帶菜品種。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料親本均為山東東方海洋科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)室保存的海帶及裙帶配子體克隆，子代樣品均為山東東方海洋科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)海區(qū)栽培的海帶孢子體（表1）。

表1 本研究中所用到的試驗(yàn)材料

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采用天根DNA植物基因組提取試劑盒提取所有親本和子代樣品DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度，根據(jù)所測樣品的質(zhì)量濃度，將樣品稀釋至50 ng/μL，置于4℃暫存待用。

1.2.2 引物的篩選和優(yōu)化 首先選取數(shù)對海帶SSR引物、裙帶菜SSR引物、海帶與裙帶菜通用的SSR引物對不同組合的親本進(jìn)行初篩，從中得到能夠區(qū)分不同組合父本與母本的SSR標(biāo)記，利用這些有效的標(biāo)記對不同組合子代樣品進(jìn)行檢測，獲得不同組合的遺傳構(gòu)成分析結(jié)果，共篩選出13對能區(qū)分親本的微衛(wèi)星標(biāo)記，海帶SSR引物為zspj28、zspj38、zspj49、zpsjE10、zpsjE37、zpsjE41和 zpsjE43；裙帶菜SSR引物為1C1、1C9和1B5；海帶與裙帶菜通用引物為SSR33、SSR93和SSR112。同時，使用海帶與裙帶菜通用的ITS引物進(jìn)行物種間的鑒定。在某些引物擴(kuò)增結(jié)果不理想的情況下，對其退火溫度和Mg2+濃度進(jìn)行摸索。

1.2.3 PCR的擴(kuò)增 共選用30對多態(tài)性高的微衛(wèi)星引物，其中12對海帶中的引物為國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心開發(fā)所得，7對海帶與裙帶菜的通用引物來自徐靜娟等［22］報道，9對裙帶菜的引物參考Claire等［23］報道合成，還有2對海帶與裙帶菜通用的ITS引物是國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心根據(jù)海帶與裙帶菜序列設(shè)計（篩選出的13對微衛(wèi)星引物與2對海帶與裙帶菜通用的ITS引物相關(guān)信息見表2）。PCR擴(kuò)增體系為2×PCR supermix 10 μL、10 μmol/L 上下游引物各 1 μL、50 ng/μL DNA 模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件為 95℃5 min；95℃ 30 s，58-63℃ 30 s，72℃ 60 s，循環(huán) 30 次；72℃ 5 min，4℃保溫。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果，6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 通過得到的瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠上的基因帶型，比較所有組合的子代個體與其親本的條帶分布情況，若子代在所用微衛(wèi)星標(biāo)記中具有與親本相同的等位基因位點(diǎn)，基本可以確定親本和子代的親緣關(guān)系。若子代與親本位點(diǎn)不符，則認(rèn)為無親緣關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 2013年育苗的48號組合與49號組合

2.1.1 區(qū)分親本引物的初篩 共選取4對海帶中的微衛(wèi)星引物zspj19、zspj28、zspj38和zspj49對48號組合親本連雜♀×早熟♂、以及49號組合飛機(jī)菜♀×早熟♂進(jìn)行擴(kuò)增，篩選得到zspj38和zspj49可以區(qū)分48號組合的父本與母本，zspj28、zspj38和zspj49可以區(qū)分49號組合的父本與母本。

2.1.2 48號組合與49號組合的子代與親本的遺傳構(gòu)成 經(jīng)過以上3對微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定（圖1）得到，48號組合3個子代個體全部與其親本遺傳構(gòu)成一致；49號組合3個子代個體只有1個與親本遺傳構(gòu)成一致，即48號組合中所有個體都是其親本的后代，49號組合中只有1個個體是其親本的后代。

2.2 2014年育苗的22號組合

2.2.1 區(qū)分親本引物的初篩 共選取9對海帶中的微 衛(wèi) 星 引 物 zspjE10、zspjE37、zspjE41、zspjE43、zspjE44、zspjE45、zspjE55、zpsj49和zpsj81對其親本連雜♀×早熟♂進(jìn)行擴(kuò)增，篩選得到zspjE10、zspjE37、zspjE41、zspjE43和zpsj49可以區(qū)分其父本與母本。

2.2.2 22號組合的子代與親本的遺傳構(gòu)成分析 經(jīng)過以上5對微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定得到：22號組合4個子代個體全部與其親本遺傳構(gòu)成一致，即22號組合中所有個體都是其親本的后代（圖2）。

2.3 2015年育苗的海帶與裙帶菜雜交組合

2.3.1 區(qū)分親本引物的篩選

2.3.1.1 裙帶菜SSR引物的篩選 由于2015年的海帶與裙帶菜雜交試驗(yàn)中用到的裙帶菜親本只有UDL♀×UDL♂，因此選取這兩個親本作為模板，用 引 物 1B2、1B5、1C1、1C9、1G2、1H4、1H5、2A2、2A8、2B2、2B4和2C1進(jìn)行篩選。篩選得到 1G2、2A2、2B2、1B5、1C1、1C9、1H4、2A8和2C1在2個親本中都能得到有效條帶，其中只有1C9引物可區(qū)分所用裙帶的2個親本。

2.3.1.2 海帶與裙帶菜通用SSR引物的篩選 選取了此次雜交試驗(yàn)中的2個裙帶菜親本UDL♀×UDL♂、2個海帶親本奔牛♀×奔?！嶙?為 模 板， 用 SSR23、SSR33、SSR93、SSR112、SSR134、SSR142、SSR147、SSR253和 SSR259進(jìn)行篩選。篩選得到（1）SSR23、SSR33、SSR93、SSR112、SSR142、SSR147、SSR253在海帶中擴(kuò)增結(jié)果較好，出現(xiàn)特異條帶，其中只有SSR93能區(qū)分2個海帶親本。（2）SSR33、SSR93和SSR112在海帶與裙帶菜中條帶較特異且差異較明顯，可以用作海帶與裙帶菜的區(qū)分鑒定引物。

2.3.1.3 海帶與裙帶菜通用的ITS引物的鑒定 選取此次雜交試驗(yàn)中的2個裙帶親本UDL♀×UDL♂、2個海帶親本奔?！狻帘寂！嶙鳛槟０?，運(yùn)用海帶與裙帶菜的通用引物H&QITS1和H&QITS2進(jìn)行檢測，結(jié)果（表3）得到2對ITS引物都能區(qū)分海帶與裙帶菜。

表2 15個微衛(wèi)星DNA（或簡單序列重復(fù)）標(biāo)記的特征

圖1 2013年育苗48組合、49組合的親緣關(guān)系鑒定

圖2 2014年育苗22號組合的親緣關(guān)系鑒定結(jié)果

2.3.2 海帶與裙帶菜雜交組合的遺傳構(gòu)成分析 用篩選出的海帶微衛(wèi)星引物ssr93對雜交試驗(yàn)中的所有組合進(jìn)行擴(kuò)增，除37組合與41組合擴(kuò)增不出條帶，即檢測不出海帶成分外，其余均含有海帶成分；且因?yàn)閟sr93能夠區(qū)分出海帶♀×海帶♂，因此，可以檢測出34、35、36、38、39組合所有樣品均與親

本所具有的等位基因吻合（圖3、圖4和表4）。

表3 海帶與裙帶菜通用的ITS引物鑒定結(jié)果

用篩選出的裙帶微衛(wèi)星引物1c9對雜交試驗(yàn)中的所有組合進(jìn)行擴(kuò)增，只有37組合與41組合能擴(kuò)增出條帶，即可以檢出裙帶菜成分，說明其他組合均沒有裙帶菜雜交。其中1c9檢測出37組合只有裙帶菜♀的成分，41組合只有裙帶菜♂的成分（圖5和表 4）。

圖3 SSR93引物在No.34、No.35、No.36組合中的鑒定

圖4 SSR93引物在No.38和No.39組合中的鑒定

由于H&QIts1與H&QIts2可以區(qū)別海帶♀♂與裙帶菜♀♂，所以試驗(yàn)中又采用這兩對引物鑒定了34組合與35組合，結(jié)果（圖6、圖7和表4）顯示2個組合都只存在海帶成分，無裙帶菜成分。因此，34與35組合裙帶菜雜交不成功。

圖5 1C9引物在No.37和No.41組合中的鑒定結(jié)果

圖6 H&QIts1檢測No.34組合和No.35組合的子代與其海帶親本的遺傳構(gòu)成

圖7 H&QIts2檢測34組合和35組合的子代與其海帶親本的遺傳構(gòu)成

2.4 2016年育苗的59號組合

2.4.1 裙帶菜引物的分析 由于59號組合的親本為裙帶菜雌雄混合克隆，因此選擇3對常用的裙帶菜引物進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖8）顯示，59號組合19個個體中，59-4、59-6、59-15、59-16、59-17、59-18、59-19與親本（裙帶菜雌雄混）帶型不一致。

表4 海帶和裙帶菜雜交組合鑒定結(jié)果

2.4.2 ITS引物的鑒定結(jié)果 將這些樣品用褐藻的ITS引物擴(kuò)增后進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)有polyG結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了其雙峰的出現(xiàn)，測序正常的前420 bp與Undaria pinnatifida的“ITS1+5.8S+ITS2（部分）”的同源性達(dá)99%，可知這些個體均為裙帶菜。但從SSR親緣關(guān)系鑒定來看，本次取的20個個體有7個與當(dāng)時育苗用的混克隆沒有親緣關(guān)系。

圖8 2016年育苗的No.59組合的遺傳構(gòu)成分析鑒定

3 討論

海帶分子標(biāo)記輔助選擇育種主要用于育種群體材料的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析、親緣關(guān)系分析和種質(zhì)鑒定上，這些可對育種親本材料的選擇提供參考信息［24］。其中，最常用的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記是進(jìn)行物種親緣關(guān)系研究及遺傳多樣性分析的有效工具。之前的研究中，不同物種不同群體都是利用微衛(wèi)星標(biāo)記通過試驗(yàn)方法和后期數(shù)據(jù)統(tǒng)計以及指標(biāo)（等位基因數(shù)、香農(nóng)信息指數(shù)等）的分析來進(jìn)行群體的遺傳多樣性檢測、親緣關(guān)系分析、雜種優(yōu)勢預(yù)測等生物學(xué)研究［25-27］。而本研究中所有的親本均為配子體材料，配子體是單倍性的，無需通過后期各項指標(biāo)的數(shù)據(jù)分析來得到組合中子代與親本的關(guān)系，而是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳得到的子代與親本的基因型帶型，直接確定其家系遺傳構(gòu)成組成，是海帶與裙帶菜育種試驗(yàn)中最簡單快速有效的鑒定方法。

試驗(yàn)中的每個組合都要先進(jìn)行區(qū)分親本引物的篩選，因?yàn)椴煌腟SR標(biāo)記在不同親本中擴(kuò)增位點(diǎn)不同，只有先篩選出能夠區(qū)分親本的SSR引物，才能準(zhǔn)確地得到子代的分析結(jié)果。在親本中擴(kuò)增沒有差別的引物，也無法區(qū)分出子代的差異。其次，對于2015年海帶與裙帶菜雜交試驗(yàn)的每個組合，都利用海帶與裙帶菜的引物進(jìn)行了雙重驗(yàn)證，因?yàn)楸仨毐ＷC該組合的子代中有并且只有該親本的成分，尤其是孤雌、孤雄的組合，一旦混有其他的親本，雜交必然失敗，只有這樣才能保證遺傳構(gòu)成分析結(jié)果準(zhǔn)確有效。另外，59號組合分析的結(jié)果顯示有幾個子代與親本不吻合，因此在此試驗(yàn)的基礎(chǔ)上又用褐藻的引物進(jìn)行了測序分析，但是這些非子代個體的真實(shí)信息有待深入研究。

將分子育種與常規(guī)育種的緊密結(jié)合，通過整合資源、優(yōu)勢互補(bǔ)，是未來藻類遺傳育種的發(fā)展方向。分析家系遺傳構(gòu)成的前提是需要有足夠多的多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)。國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心已經(jīng)開發(fā)出大量可用于鑒定海帶的微衛(wèi)星標(biāo)記［28-30］，而對于裙帶菜等其他褐藻，可用標(biāo)記并不多，因此在未來的研究中，開發(fā)特定品種的分子標(biāo)記也很必要。

4 結(jié)論

利用30對微衛(wèi)星引物對11個海帶與裙帶菜的克隆育苗組合的子代與親本進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析，有11對引物能夠區(qū)別出各組合的親本♀與親本♂，經(jīng)過這11對引物的分析后，部分個體是其親本的后代，部分個體遺傳構(gòu)成與親本不一致。

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