植酸酶YiAPPA與生淀粉結(jié)合域SBD融合酶的構(gòu)建及酶學性質(zhì)分析

袁林 黃朝 曾靜 郭建軍 張婷 呂珺

（江西省科學院微生物研究所，南昌 330096）

植酸酶又稱肌醇六磷酸酶，是能夠?qū)⒅菜岱纸鉃榧〈己蜔o機磷的一類磷酸酯酶，廣泛地存在于動物、植物、微生物中［1-3］。植酸酶在飼料工業(yè)具有廣闊的應用前景和巨大的商業(yè)價值。植酸酶作為飼料添加劑能夠提高磷的利用率，減輕植酸磷對環(huán)境的污染；解除飼料中植酸的抗營養(yǎng)作用，提高機體對多種微量元素及蛋白質(zhì)的利用率、促進動物生長發(fā)育和提高其生產(chǎn)性能、減少動物糞便中磷的排放［1-3］。目前，約75%的單胃動物飼料中含有植酸酶，植酸酶的全球市場總銷售額高達3.5億美元，并以每年10%的速度增長［4］。

植酸酶作為一種單胃動物飼料添加劑，其飼喂效果已經(jīng)在世界范圍內(nèi)得到確認［5］。但是，目前我國植酸酶在飼料中的推廣和應用還相當有限，究其原因主要是：天然材料中植酸酶含量太低導致植酸酶生產(chǎn)成本過高；當前商業(yè)化植酸酶的熱穩(wěn)定性、活性、pH作用范圍以及蛋白酶抗性等酶學性質(zhì)難以完全滿足飼料工業(yè)的要求［6-7］。近年來利用基因工程技術提高植酸酶的表達量，以及隨著對植酸酶晶體結(jié)構(gòu)的揭示，利用基因工程技術和蛋白質(zhì)工程技術在分子水平上改造植酸酶基因，從而改變植酸酶的酶學性質(zhì)，提高其在飼料中使用的有效性已成為國內(nèi)外學者研究的熱點［8-9］。

耶爾森氏菌屬Yersinia來源的植酸酶具有酸性條件下的高穩(wěn)定性和高酶活、較強的蛋白酶抗性和熱穩(wěn)定性等突出性質(zhì)［10-15］。因此，來源于Yersinia的植酸酶在飼料工業(yè)具有巨大的應用潛力，目前德國BASF公司正在對來源于Yersinia的植酸酶進行商業(yè)化生產(chǎn)［5］。來源于Yersinia intermedia的植酸酶YiAPPA是目前已知的植酸酶活性最高的植酸酶，其酶活高達3 960 U/mg（37℃、pH4.5），是目前應用最廣泛的植酸酶Aspergillus nigerPhyA酶活的40倍［10］。YiAPPA屬于組氨酸酸性磷酸酶（Histidine acid phosphatase，HAP，EC 3.1.3.2）， 具 有 HAP分子結(jié)構(gòu)和催化機制上的共同特征［10］。其最適反應條件為55℃、pH4.5；于pH2.0-5.5條件下具有50%以上的相對酶活；于pH1.0-8.0條件下具有80%以上的穩(wěn)定性；于80℃保溫15 min后，YiAPPA的剩余酶活約為54%；對于胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有較強的抗性。YiAPPA的酶學性質(zhì)使其在飼料工業(yè)中具有巨大的應用潛力，但是YiAPPA的酶學性質(zhì)（特別是熱穩(wěn)定性）難以完全滿足飼料工業(yè)的要求。以YiAPPA的熱穩(wěn)定性為例，飼用酶在飼料的造粒過程中一般需要經(jīng)過一個75-93℃的短暫高溫，而YiAPPA于80℃的半衰期僅為15 min，尚難以達到飼料工業(yè)的要求。本研究擬將YiAPPA與來源于嗜熱菌Geobacillus thermoleovorans的嗜熱酸性α-淀粉酶GTamy的生淀粉結(jié)合域SBD進行融合，獲得酶學性質(zhì)改良的融合酶，從而提高植酸酶YiAPPA在飼料工業(yè)中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌Escherichia coliJM109、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisWB600、枯草芽孢桿菌表達載體pSTOP1622、重組質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhds均由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸桿菌E. coliJM109和枯草芽孢桿菌B. subtilisWB600的培養(yǎng)均采用LB培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑 KOD-Plus-neo DNA聚合酶購自日本Toyobo公司；DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker購自美國Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒E.Z.N.A.購自美國Omega Bio-tek公司；Chelating SepharoseTMFast Flow購自美國GE Healthcare公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)或進口分析純；基因合成由上海博益生物科技有限公司完成，聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）引物合成和測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆技術和表達產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析 分子克隆技術和表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析參照文獻［16］進行。

1.2.2 重組質(zhì)粒pSTOP1622-yiappah和pSTOP1622-yiappa-sbdh的構(gòu)建及鑒定 由上海博益生物科技有限公司合成包含編碼來源于Bacillus subtilisUS417的植酸酶的信號肽［17］、不含信號肽的YiAPPA以及連接肽（G4S）2的核苷酸序列。根據(jù)人工合成的基因序列設計PCR引物P1、P2及P3，如表1所示。以合成基因為模板，以P1、P2為引物，進行PCR擴增。PCR 擴增條件為：98℃ 5 min；98℃ 20 s，60℃ 20 s，74℃ 2 min，30個循環(huán)；74℃，10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)SpeI和SacI雙酶切，連接至載體pSTOP1622，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTOP1622-yiappa。以合成基因為模板，以P1、P3為引物，進行PCR擴增，PCR擴增條件同上。擴增產(chǎn)物經(jīng)SpeI和SacI雙酶切，連接至載體pSTOP1622，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTOP1622-yiappah。采用SpeI和SacI雙酶切重組質(zhì)粒鑒定是否有外源基因的插入。根據(jù)嗜熱酸性α-淀粉酶GTamy的基因序列設計PCR擴增其淀粉結(jié)合域SBD所需的引物P4和P5（表1）。以重組質(zhì)粒pSTOP1622-AbnA-gtamyhds為模板，以P4、P5為引物，進行PCR擴增。PCR擴增條件為：98℃ 5 min；98℃ 20 s，60℃20 s，74℃ 30 s，30個循環(huán)；74℃，10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)SacI和KpnI雙酶切，連接至經(jīng)同樣雙酶切處理后的重組質(zhì)粒pSTOP1622-yiappa，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSTOP1622-yiappa-sbdh。采用SpeI和KpnI雙酶切重組質(zhì)粒鑒定是否有外源基因的插入。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒所用引物

1.2.3 枯草芽孢桿菌B. subtilisWB600感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化 枯草芽孢桿菌B. subtilisWB600感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化采用改進的 Spizizen 法［18］進行。

1.2.4 重組酶的誘導表達和純化 接種重組枯草芽孢桿菌單克隆到LB液體培養(yǎng)基中，用250 mL三角瓶進行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基的裝液量為20 mL，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min，培養(yǎng)時間為10 h。然后轉(zhuǎn)接該培養(yǎng)物于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，用250 mL三角瓶進行培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基裝液量為25 mL，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min。當培養(yǎng)至菌體OD600nm達到1時，添加終濃度為0.5%的木糖，誘導細胞表達重組蛋白質(zhì)，誘導時間為36 h。

采用Ni2+親和層析柱對發(fā)酵上清液中目的蛋白質(zhì)進行純化，用200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，即得到純化后的重組酶。利用SDS-PAGE檢測重組蛋白質(zhì)的純度，并采用Bradford法［19］測定重組蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.5 植酸酶的酶活力測定 取250 μL酶液于離心管中，加入750 μL 0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5），混勻。向?qū)嶒灲M管中加入2 mL 1.5 mmol/L 植酸鈉溶液（0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液，pH4.5），對照組中加入2 mL顏色/終點混合液（鉬酸銨/釩酸銨/硝酸），搖勻。于37℃反應30 min后，立即向?qū)嶒灲M中加入2 mL顏色/終點混合液，對照組中加入2 mL 1.5 mmol/L植酸鈉溶液，并混勻，于415 nm處測定光吸收值。植酸酶活力單位（U）定義為：在37℃、pH4.5的條件下，每分鐘從1.5 mmol/L植酸鈉溶液中釋放出1 μmol/L無機磷所需要的植酸酶量為一個酶活力單位（U）。

1.2.6 植酸酶的酶學性質(zhì) 植酸酶的最適反應pH：將酶液于不同pH（1.0-8.0）條件下測定植酸酶活性。所使用的緩沖液如下：0.25 mol/L 甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH1.0-3.5；0.25 mol/L 醋酸鈉-醋酸緩沖液，pH3.5-6.0；0.25 mol/L Tris-鹽酸緩沖液，pH6.0-8.5。

植酸酶的pH穩(wěn)定性：將酶液用不同pH（1.0-12.0）緩沖液稀釋，使其在不同pH條件下于37℃處理2 h，然后用最適pH緩沖液稀釋，并根據(jù)如上反應體系測定樣品的酶活力。所使用的緩沖液如下：0.25 mol/L 甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH1.0-3.5；0.25 mol/L 醋酸鈉-醋酸緩沖液，pH3.5-6.0；0.25 mol/L Tris-鹽酸緩沖液，pH6.0-8.5；0.25 mol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，pH8.5-12.0。

為此,本文以光伏直流模塊的防孤島控制為研究對象。首先,以Boost+FB-LLC(Full Bridge LLC,FB-LLC)作為本文的直流模塊拓撲結(jié)構(gòu),并對該電路拓撲進行了工作原理分析。其次,本文分析了光伏直流模塊的孤島效應,并提出了一種基于注入電流擾動法的新型防孤島控制策略。最后,本文研制了一臺1 000 W的光伏直流模塊樣機,并完成了孤島保護實驗。

植酸酶的最適反應溫度：按照如上反應體系測定樣品的酶活力，分別于30-90℃反應30 min，測定不同溫度條件下樣品的酶活力，并以相對酶活對溫度作圖，確定其最適反應溫度。

植酸酶的動力學參數(shù)：用0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5）配制不同濃度的植酸鈉溶液（0.0625%、0.1%、0.125%、0.2%、0.25%、0.5%、1.0%和1.5%），分別向植酸鈉溶液中加入等量的酶液，按照1.2.5方法測定酶活。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標，以比酶活力的倒數(shù)為縱坐標作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax，計算以醋酸鈉為底物時的米氏常數(shù)Km、最大反應速度Vmax和反應常數(shù)kcat。

植酸酶的熱穩(wěn)定性：取250 μL酶液于離心管中，加入750 μL 0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5），混勻。酶液于80℃保溫0-40 min后，根據(jù)如上反應體系測定樣品的酶活力。

植酸酶的蛋白酶抗性：分別用0.25 mol/L Gly-HCl緩沖液（pH 2.0）和0.25 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0）配制0.1 mg/mL的胃蛋白酶和胰蛋白酶。按照蛋白酶與植酸酶質(zhì)量比為1∶10的比例在植酸酶中分別加入胃蛋白酶和胰蛋白酶，于37℃分別保溫2 h后，向其中加入蛋白酶抑制劑終止反應，然后對蛋白酶處理的樣品用最適pH緩沖液（0.25 mol/L醋酸鈉緩沖液，pH 4.5）進行100倍稀釋，再根據(jù)如上反應體系測定樣品的酶活力。1.2.7 重組酶的生玉米淀粉結(jié)合率 向0.1 mg/mL酶液中加入生玉米淀粉至其終濃度為0-10%，混合體系在20℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱孵育3 h，振蕩速率為180 r/min。反應結(jié)束后，測定上清中的殘余植酸酶活性。結(jié)合率AR計算公式如下：AR%=（O-R）/O×100。R：上清殘余酶活力；O：初始酶活力。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 以上酶學性質(zhì)研究實驗中，每個實驗做3 個平行。運用軟件SigmaPlot 11.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并作圖，數(shù)據(jù)均以x-±s表示。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

采用限制性內(nèi)切酶SpeI和SacI酶切質(zhì)粒pSTOP1622-yiappah，采用限制性內(nèi)切酶SpeI和KpnI酶切質(zhì)粒pSTOP1622-yiappa-sbdh，得到大小分別約為1.3 kb和1.6 kb的兩個片段（圖1），大小與理論值相符。同時將以上重組質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司進行插入片段測序，并將測序結(jié)果（結(jié)果未顯示）與對應的基因序列進行了比對確認，證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

2.2 重組植酸酶的誘導表達與純化

圖2 重組植酸酶的SDS-PAGE檢測結(jié)果

2.3 YiAPPA-SBD和YiAPPA的酶學性質(zhì)比較

圖3 pH對酶活的影響

2.3.1 pH值對重組植酸酶相對酶活的影響 將酶液于不同pH（1.0-8.0）條件下測定重組植酸酶的相對酶活，結(jié)果如圖3所示。重組植酸酶YiAPPA和YiAPPA-SBD的最適反應pH值均為4.5，并且重組植酸酶YiAPPA和YiAPPA-SBD在pH1.0-8.0范圍內(nèi)具有相似的相對酶活。

2.3.2 重組植酸酶的pH穩(wěn)定性 由圖4可知，重組植酸酶YiAPPA和YiAPPA-SBD在pH1.0-12.0范圍內(nèi)具有相似的穩(wěn)定性。其中，在pH1.0-3.0范圍內(nèi)，重組植酸酶具有80%以上的相對酶活；在pH4.0-10.0范圍內(nèi)，重組植酸酶具有90%以上的相對酶活；在pH11.0-12.0范圍內(nèi)，重組植酸酶均不穩(wěn)定，很快喪失活性。

圖4 pH對穩(wěn)定性的影響

2.3.3 溫度對重組植酸酶相對酶活的影響 按照植酸酶的酶活力測定反應體系，于30-90℃下測定重組植酸酶的酶活力，以樣品的相對酶活對溫度作圖的結(jié)果如圖5所示。重組植酸酶YiAPPA和YiAPPASBD的最適反應溫度均為55℃。在30-55℃范圍內(nèi)，兩者具有相似的相對酶活；在55-90℃范圍內(nèi)，YiAPPA-SBD的相對酶活均高于YiAPPA的相對酶活。以上結(jié)果表明，融合酶YiAPPA-SBD的高溫活性得到提高。

2.3.4 重組植酸酶的比活力和動力學參數(shù) 重組植酸酶以植酸鈉為底物時的比活力、米氏常數(shù)Km和反應常數(shù)kcat如表2所示。與YiAPPA相比，融合酶YiAPPA-SBD的比活力、Km及kcat值均未明顯改變。即SBD在YiAPPA的C末端的融合表達未影響YiAPPA的底物結(jié)合能力和底物催化能力。

圖5 溫度對酶活的影響

2.3.5 重組植酸酶的熱穩(wěn)定性 將重組植酸酶YiAPPA和YiAPPA-SBD于80℃分別保溫不同時間，測定其相對酶活，比較兩者的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖6所示。在80℃下，融合酶YiAPPA-SBD的熱穩(wěn)定性明顯高于YiAPPA的熱穩(wěn)定性。其中YiAPPA于80℃的半衰期約為15 min，YiAPPA-SBD于80℃的半衰期約為30 min，提高了2倍。

圖6 80℃重組植酸酶的熱穩(wěn)定性

表2 37℃重組植酸酶的比活力及動力學參數(shù)

2.3.6 重組植酸酶對蛋白酶的抗性 向重組植酸酶樣品中分別加入胃蛋白酶和胰蛋白酶，于37℃分別保溫2 h后，測定樣品的剩余酶活力。表3中結(jié)果顯示，重組植酸酶YiAPPA和YiAPPA-SBD對蛋白酶具有相近的抗性。重組植酸酶經(jīng)胃蛋白酶處理后仍保留有84%以上的相對酶活；重組植酸酶經(jīng)胰蛋白酶處理后仍保留有82%以上的相對酶活。

表3 重組植酸酶對蛋白酶的抗性

2.3.7 重組植酸酶對生玉米淀粉的結(jié)合率 向重組植酸酶樣品中加入不同濃度的生玉米淀粉，待孵育結(jié)束后測定重組植酸酶對生玉米淀粉的結(jié)合率，結(jié)果如圖7所示。在生玉米淀粉濃度為0-10%的條件下，重組植酸酶YiAPPA對生玉米淀粉的結(jié)合率為0；融合酶YiAPPA-SBD對生玉米淀粉的結(jié)合率隨著生玉米淀粉濃度的增加而提高。當生玉米淀粉濃度大于8%時，YiAPPA-SBD對其結(jié)合率達到80%以上。

圖7 重組植酸酶對生玉米淀粉的結(jié)合率

2.3.8 生玉米淀粉對重組植酸酶相對酶活的影響 向0.1 mg/mL重組植酸酶中加入生玉米淀粉至其濃度為0、15%、30%、45%和60%，混合體系在20℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱孵育3 h，然后取1 mL酶液樣品直接加入底物進行植酸酶的酶活力測定，以樣品的相對酶活對反應體系中生玉米淀粉終濃度作圖的結(jié)果如圖8所示。在生玉米淀粉存在的條件下，未結(jié)合生玉米淀粉的YiAPPA與結(jié)合了生玉米淀粉的YiAPPA-SBD的相對酶活基本一致，這表明生玉米淀粉的結(jié)合不影響融合酶的植酸酶活性。

圖8 生玉米淀粉對重組植酸酶相對酶活的影響

3 討論

目前商業(yè)化植酸酶主要是來源于真菌和細菌，如來源于黑曲霉A. niger的植酸酶PhyA、來源于大腸桿菌Escherichia coli的植酸酶AppA和AppA2、來源于Citrobacter braakii的植酸酶 CbAppA［5］。但是這些商業(yè)化植酸酶具有熱穩(wěn)定性差、酶活低、pH作用范圍窄等缺點。例如，飼用酶在飼料的造粒過程中一般需要經(jīng)過一個75-93℃的短暫高溫。A.nigerPhyA經(jīng)70℃處理20 min后僅殘留30%的活性，在此溫度范圍內(nèi)易失活，酶活性大大降低；添加在飼料中的植酸酶，最終的作用場所是動物的胃腸道，主要場所是胃，降解時的pH為1.8-3.5。A.nigerPhyA的最適pH值分別是pH 2.5 和5.5，在兩個峰值之間的酶活相對偏低。商業(yè)化植酸酶的這些缺點不利于植酸酶在飼料工業(yè)的推廣與應用。研究者已致力于采用分子生物學手段改造這些植酸酶的酶學性質(zhì)，并取得了較好的研究結(jié)果。Zhang等［20］對比分析了A. nigerPhyA和具有優(yōu)良熱穩(wěn)定性的A.fumigatusAfp的三級結(jié)構(gòu)，采用定點突變向PhyA中引入Afp中對應的氨基酸殘基，獲得了變性溫度提高7℃的突變體A58E/P65S/Q191R/T271R。Kim等［21］采用易錯PCR來提高E.ColiAppA2的熱穩(wěn)定性，獲得了熱變性溫度提高6-7℃的兩個突變體K64E和 K65E/K97M/S209G。Sanchez-Romero等 向來源于Citrobacter braakii的植酸酶CbAppA中引入3對二硫鍵，使其變性溫度提高了12.1℃［22］。Tian等［23］對比了多種不同植酸酶的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)第53位和第91位氨基酸殘基具有較強可變性。來源于A. niger113的植酸酶PhyI 1s與來源于A. nigerNRRL 3135的植酸酶PhyA的氨基酸序列的相似性高達98%，但PhyI 1s的活性僅為PhyA的1/10。他們將PhyI 1s中第53位和第91位氨基酸殘基突變?yōu)镻hyA中對應的氨基酸殘基，獲得了催化效率（kcat/Km）分別提高了4.08倍的突變體Q53R和2.84倍的突變體 K91R。Ushasree等［24］對來源于A. nigerNII 08121的植酸酶進行定點突變，獲得了最適pH為3.2的突變體P212H。

嗜熱酸性生淀粉α-淀粉酶GTamy具有優(yōu)良的高溫活性和熱穩(wěn)定性，其最適反應溫度為80℃，于80℃的半衰期為184 min，其活性和熱穩(wěn)定性均不依賴于Ca2+［25］。GTamy屬于糖苷水解酶類的第13家族，具有第13家族酶分子結(jié)構(gòu)和催化機制上的共同特征，如保守區(qū)域、保守的催化活性中心、金屬離子結(jié)合位點和3個結(jié)構(gòu)域等［25］。GTamy的結(jié)構(gòu)域C作為生淀粉結(jié)合域SBD，是其直接水解未經(jīng)糊化處理的玉米淀粉的關鍵［25］。SBD作為淀粉酶的天然部分主要有以下作用：使淀粉酶分子可以在溶液中與不溶性底物（淀粉顆粒）結(jié)合，將底物運送到催化結(jié)構(gòu)域的活性位點以及使淀粉顆粒表面破裂［26-29］。除此之外，SBD還具有一些特殊功能。例如，Gt-amyⅡ的SBD還與其熱穩(wěn)定性相關［30］；AmyP的SBD與其可溶性淀粉酶活相關［31］。已有研究表明SBD與異源蛋白質(zhì)的融合表達會對異源蛋白質(zhì)的酶學性質(zhì)產(chǎn)生影響。例如，Hua等［32］將來源于Bacillus stearothermophilus的亮氨酸氨肽酶LAPII與來源于Bacillussp. TS-23的α-淀粉酶的生淀粉結(jié)合域SBD進行融合表達，獲得了高溫活性和熱穩(wěn)定性均得到提高的融合酶LAPsbd。

本研究通過在植酸酶YiAPPA的C末端融合嗜熱酸性α-淀粉酶GTamy的生淀粉結(jié)合域SBD，獲得了熱穩(wěn)定性和高溫活性均得到提高的融合酶YiAPPA-SBD。這表明將GTamy-SBD與YiAPPA進行融合表達，有利于維持YiAPPA高溫條件下的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。并且融合酶YiAPPA-SBD仍保留YiAPPA的其它優(yōu)良酶學性質(zhì)，如其最適反應條件為55℃、pH4.5，37℃的絕對酶活約為3 900 U/mg，并具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定性和蛋白酶抗性。熱穩(wěn)定性和高溫活性均得到提高的融合酶YiAPPA-SBD較YiAPPA更適于飼料工業(yè)的應用。此外，融合酶YiAPPA-SBD具有玉米淀粉結(jié)合能力，而且生玉米淀粉的結(jié)合不影響融合酶的植酸酶活性，這表明植酸酶YiAPPA和生淀粉結(jié)合域SBD均能獨立發(fā)揮功能。接下來我們將根據(jù)這一特點，探索利用玉米淀粉吸附法一步純化發(fā)酵上清液中融合酶YiAPPA-SBD的條件，從而簡化融合酶YiAPPA-SBD的生產(chǎn)工藝。

4 結(jié)論

本研究獲得了高溫活性和熱穩(wěn)定性均得到提高的融合酶YiAPPA-SBD，其于55-90℃范圍內(nèi)的相對酶活均高于YiAPPA的相對酶活，于80℃的半衰期提高約2倍。并且融合酶YiAPPA-SBD獲得了對生玉米淀粉的結(jié)合能力，在生玉米淀粉濃度＞8%的條件下，YiAPPA-SBD對其結(jié)合率達到80%以上。此外，融合酶YiAPPA-SBD保留有YiAPPA的其他優(yōu)良酶學性質(zhì)，最適反應pH為4.5，37℃的絕對酶活高達3 900 U/mg，并具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定性和蛋白酶抗性。

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