碳氮比對固氮菌株WN-F合成胞外多糖的影響

鄧超 杜秀娟 黃濤 郭英 李炳學 卜寧

（1. 沈陽師范大學生命科學學院，沈陽 110034；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學土地與環(huán)境學院，沈陽 110866）

生物固氮是自然生態(tài)系統(tǒng)中氮的主要來源，陸地生態(tài)系統(tǒng)中通過生物固氮輸入的氮約110 Tg/a，對全球生態(tài)系統(tǒng)氮素循環(huán)平衡起著關(guān)鍵作用［1］。固氮菌在自然界分布十分廣泛，可固定空氣中的游離氮轉(zhuǎn)變?yōu)樯锟梢岳玫牡兀痰磻堑厍蛏系氐闹匾獊碓?。有些固氮菌分泌一些植物激素，促進植物根系生長和對水分及礦物質(zhì)的吸收［2-4］。過量氮肥的施用抑制土壤中固氮菌的固氮作用，減弱了固氮菌的氮素營養(yǎng)競爭優(yōu)勢，固氮種群呈下降趨勢。在減施氮肥的國家調(diào)控戰(zhàn)略條件下，利用固氮菌資源保持玉米穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)成為重要途徑。本研究以沈陽農(nóng)業(yè)大學棕壤長期定位試驗站玉米栽培土壤為樣品來源，分離目標固氮菌。

固氮菌為保障固氮酶在低氧條件發(fā)揮作用，經(jīng)常依靠分泌胞外多糖控制進入細胞的氧濃度。胞外多糖還有助于固氮菌抵抗營養(yǎng)、干燥、不良環(huán)境等脅迫，有利于菌體定值在植物根部，所以本研究將高產(chǎn)胞外多糖作為篩選固氮菌的一個重要指標，以期達到獲得利于固氮菌體，使減施氮肥土壤補充保持玉米等作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)需求的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 供試土壤采集于沈陽農(nóng)業(yè)大學棕壤長期定位試驗站（北緯40°48'，東經(jīng)123°33'）。1.1.2 培養(yǎng)基 阿須貝（Ashby）培養(yǎng)基：KH2PO4（0.2g），NaCl（0.2g），CaCO3（5.0g），CaSO4·2H2O（0.1g），MgSO4·7H20（0.2g），葡萄糖（10.0g），瓊脂粉（20.0g）溶于1 000 mL蒸餾水中，pH7.2。LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蛋白胨 10.0 g，瓊脂粉20.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH7.0。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 20.0 g，pH 6.0。優(yōu)化培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g，牛肉膏 2.0 g，KH2PO40.4 g、MgSO4·7H2O 0.4 g、NaCl 0.4 g、CaSO4·2H2O 0.4 g 和 CaCO32.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH7.0。

生理生化試驗用培養(yǎng)基。淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，可溶性淀粉2.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH7.0。

葡萄糖蛋白胨水溶液培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖5.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，pH7.0-7.2。M.R.反應中，所用試劑為甲基紅（甲基紅0.1 g，95%乙醇300 mL，蒸餾水200 mL）。

檸檬酸鹽培養(yǎng)基：NH4H2PO40.5 g，檸檬酸鈉2.0 g，MgSO4

.7H2O 0.2 g，NaCl 1.0 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，0.04% 酚紅液溶液20 mL，pH6.8。將上述營養(yǎng)物質(zhì)溶解后，將pH調(diào)節(jié)至6.8，加入指示劑制成黃綠色溶液后，分裝到試管中，121℃濕熱滅菌30 min。

糖發(fā)酵培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.2 g，（NH4）2-HPO41.0 g，KCl 0.2 g，碳水化合物（葡萄糖和蔗糖）10.0 g，酵母浸粉0.2 g，溶于1 000 mL蒸餾水中，0.04%溴甲酚紫15 mL，pH7.0-7.2。

1.2 方法

1.2.1 土樣的采集 土壤樣品采集時去掉土壤表層的作物殘茬，采集深度為0-20 cm。從試驗站取得的新鮮土壤樣品分別標記并放入已滅菌的塑封袋中，封口，于4℃冰箱中保存。

1.2.2 固氮菌的分離篩選 取采集的新鮮土壤樣品10 g，放入盛有90 mL無菌水并帶有少量小玻璃珠的三角瓶中，180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，制成10-1懸濁液，并依次稀釋到10-6。選取10-3、10-4和10-5三個稀釋梯度的懸濁液，分別吸取0.1 mL稀釋液在分離用阿須貝（Ashby）培養(yǎng)基上均勻涂布，置于30℃恒溫培養(yǎng)5-7 d，每個梯度設(shè)置3次重復。待平板上微生物菌落長出后，挑取單菌落，劃線轉(zhuǎn)接于分離用選擇性培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)5-7 d。依此方法連續(xù)劃線純化培養(yǎng)，直至獲得純撇楊，劃線于試管斜面，于4℃冰箱保藏備用。

1.2.3 粗多糖的提取 得到的純化菌株轉(zhuǎn)接至裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min，37℃活化24 h。吸取1 mL已活化的菌株接入裝有50 mL新鮮的液體LB培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r/min，37℃培養(yǎng)48 h，得發(fā)酵液。取10 mL發(fā)酵液，5 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，加入兩倍體積95%無水乙醇，用玻璃棒均勻攪拌至出現(xiàn)絮狀沉淀，靜置于4℃冰箱中沉淀24 h；10 000 r/min離心15 min得多糖沉淀，自然風干，稱重。

1.2.4 菌株鑒定 形態(tài)學鑒定：將菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進行劃線，30℃培養(yǎng)48 d后，對菌落的生長情況、菌落形狀、大小、透明度、顏色、光滑度、邊緣特征、凹凸度、是否隆起等生物學形狀進行觀察，并挑取少量已活化的菌落于載玻片上進行涂片，固定。對菌株進行簡單染色后用光學顯微鏡觀察，對細胞大小、形狀等特征進行觀察和記錄。生理生化鑒定：參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版）的方法，對菌株進行部分生理生化鑒定。分子生物學鑒定：用細菌基因組快速提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。以菌株的基因組為模板，以27F和1492R為引物，采用50 μL PCR反應體系進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行同源性序列分析與比對。根據(jù)測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 生長條件優(yōu)化 WN-F菌株生長曲線的測定：將活化后的菌液接入50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，180 r/min，37℃條件下培養(yǎng)。每隔2 h測定菌液OD600值，直至OD值趨于穩(wěn)定，作3組對照。

碳、氮源對WN-F菌株生長的影響：在無機鹽培養(yǎng)基中分別加入2%的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，再分別加入0.1%（NH4）2SO4、磷酸二氫銨、牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉，以不加碳源為對照，接種0.5 mL母液，37℃，180 r/min培養(yǎng)24 h，測定菌體濃度，每組處理設(shè)3個重復，以篩選最佳碳氮源組合。

正交試驗設(shè)計：以最佳碳氮源組合（蔗糖和牛 肉 膏 ）、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、CaSO4·2H2O和CaCO3共7個因素，設(shè)計7因素3水平正交試驗，測定WN-F菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件；多糖的提取采用乙醇沉淀法。

1.2.6 菌株固氮與產(chǎn)糖關(guān)系 配置優(yōu)化培養(yǎng)基，氮源（牛肉膏）分別加入0%、0.5%、1%、1.5%和2%濃度，接種1%活化菌液，37℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。每組作3個重復，以空白培養(yǎng)基為對照。分別測定菌體OD600值及產(chǎn)糖量。

2 結(jié)果

2.1 固氮菌篩選結(jié)果

通過分離純化得到2株在不同土樣中均大量存在的菌株WN-E、WN-F。對2菌株產(chǎn)糖能力測定分析表明，相同條件下培養(yǎng)24 h，10 mL發(fā)酵液WN-E產(chǎn)糖量為0.06 g，WN-F產(chǎn)糖量為0.08 g，由此，以產(chǎn)糖相對較高的WN-F菌株開展后續(xù)研究。

2.2 WN-F菌株的鑒定

2.2.1 WN-F菌株形態(tài)學觀察 WN-F菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長良好，菌落較大，菌苔較厚，菌落濕潤光滑，透明，圓形或近似圓形，邊緣整齊且清晰，濕潤有光澤，菌落中央凸起，呈乳白色（圖1-A）。WN-F菌體呈長桿狀，兩端圓形，多排列成長短不一的鏈狀，也有單個分散排列（圖1-B）。

圖1 WN-F菌落形態(tài)（A）WN-F菌體形態(tài)放大1600倍（B）

2.2.2 WN-F菌株生理生化特性 WN-F菌株部分生理生化特性試驗結(jié)果見表1。

表1 WN-F生理生化特性

2.2.3 WN-F菌株分子生物學鑒定 WN-F菌株測序長度為1 496 bp，經(jīng)BLAST比對，該菌株與芽孢桿菌屬的16S rDNA的同源性高達99%，結(jié)合生理生化及生物學特性試驗結(jié)果，判定WN-F為芽孢桿菌屬，命名為Bacillussp. WN-F。利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)樹，如圖2所示。

2.3 WN-F菌株生長條件優(yōu)化

2.3.1 WN-F菌株生長曲線 如圖3所示，菌株在接種0-4 h內(nèi)處于遲緩期，之后進入對數(shù)期，此階段菌株生長較快，12 h開始生長緩慢，到32 h趨于穩(wěn)定。

2.3.2 碳、氮源對WN-F菌株生長的影響 利用酶標儀測定菌體在不同碳、氮源條件下生長OD600值，結(jié)果（表2）顯示，該菌株在以蔗糖為碳源、以牛肉膏為氮源的情況下生長情況最好。

2.3.3 WN-F菌株培養(yǎng)基優(yōu)化 設(shè)計的7因素3試驗結(jié)果見表3。根據(jù)R值大小可得各因素作用的主次順序為磷酸二氫鉀＞碳酸鈣＞二水硫酸鈣＞氯化鈉＞牛肉膏＞七水硫酸鎂＞蔗糖。

圖2 WN-F菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 WN-F菌株生長曲線

表2 不同碳、氮源條件下生長OD600 值

由上述無機鹽培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果中的各列K值可知：碳源蔗糖的最適濃度為A2，氮源牛肉膏的最適濃度為B3，磷酸二氫鉀的最適濃度為C3，七水硫酸鎂的最適濃度為D2，氯化鈉的最適濃度為E3，二水硫酸鈣的最適濃度為F3，碳酸鈣的最適濃度為G3。

由測定結(jié)果可知，WN-F菌株最佳培養(yǎng)基的配方為（L-1）：蔗糖20.0 g，牛肉膏 2.0 g，KH2PO40.4 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，NaCl 0.4 g，CaSO4·2H2O 0.4 g和 CaCO32.0 g。

2.4 WN-F菌株固氮與產(chǎn)糖關(guān)系測定

阿氏芽孢桿菌WN-F在24 h時，不同初始濃度氮源的產(chǎn)糖量成拋物線形（圖4）。在無氮條件下，菌株生長繁殖需要固氮，消耗能量大，積累少量多糖；WN-F在適宜碳氮比（葡萄糖20 g/牛肉膏1 g）條件下，有利于胞外多糖合成；當牛肉膏氮源含量2%時，菌體生長繁殖速度快，產(chǎn)糖量急劇下降。

3 討論

目前發(fā)現(xiàn)的幾種產(chǎn)多糖微生物及其多糖如出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans），主要產(chǎn)普魯蘭糖［5］，黃單胞菌（Xanthomonas campestris）經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生黃原膠［6］，土壤桿菌（Agrobacteriumsp.）經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多糖叫做熱凝膠［7］，鏈球菌屬（Streptococcusspp.）能產(chǎn)透明質(zhì)酸（即玻尿酸），伊樂假單胞菌（Pseudomonas elodea）能產(chǎn)生結(jié)冷膠［8-9］，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）經(jīng)過發(fā)酵合成右旋糖酐［10］，芽孢桿菌屬（Bacillussp.）經(jīng)過發(fā)酵產(chǎn)生生物絮凝劑。常見的產(chǎn)多糖土壤微生物有土壤桿菌屬、醋酸桿菌屬、固氮菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬及根瘤菌屬等。

表3 WN-F菌株的正交試驗

圖4 WN-F不同初始氮濃度產(chǎn)糖

許多研究表明，植物中多糖含量不僅與植株本身有關(guān)，與固氮菌接種量，氮施用等均有關(guān)系［11-13］。施肥對固氮微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)有顯著的影響，高氮水平會降低生態(tài)系統(tǒng)對固氮菌的依賴性，抑制固氮效果。如 Silva等［14］發(fā)現(xiàn)增加銨態(tài)氮和硝態(tài)氮會降低荷蘭地區(qū)不同質(zhì)地的農(nóng)耕土壤中nifH基因的拷貝數(shù)。在澳大利亞放牧林地土壤中，固氮酶活性和nifH基因豐度與總氮量呈負相關(guān)［15］。在巴西種植高粱的土壤中，非共生固氮菌的豐度在低氮水平下比高氮水平下高30%［16］。對長江三角洲平原典型水稻土壤研究也發(fā)現(xiàn)，固氮微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)與速效 N 含量呈負相關(guān)，氮肥會抑制固氮微生物的生長，顯著降低水田 α 變形菌綱固氮微生物的相對豐度［17］。糖類積累的主要過程是碳代謝過程，而碳代謝與氮代謝相互依存和限制。兩種生理過程之間的聯(lián)系是α-酮戊二酸與NH4+在谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶的聯(lián)合催化。因此，氮供應在調(diào)節(jié)糖類積累中起重要作用［18-19］。

本研究結(jié)果表明，固氮阿氏芽孢桿菌 WN-F在適宜碳氮比條件下，有利于胞外多糖合成。合成胞外多糖有利于菌體固氮，說明該菌株有望在1%-1.5%氮源存在下固氮，使其在適量施用氮肥的土壤中保持固氮活性，將為減施氮肥土壤補充保持玉米等作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)需求的氮素。

4 結(jié)論

在沈陽農(nóng)業(yè)大學棕壤長期定位試驗站采集的土樣中，篩選出1株產(chǎn)糖較高的固氮菌WN-F。經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定，命名為阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）WN-F。該菌株在12 h時達到最佳生長點，在24 h時產(chǎn)糖量趨于平穩(wěn)，產(chǎn)糖量隨著初始氮濃度的增加呈現(xiàn)拋物線形變化。

［1］徐鵬霞, 韓麗麗, 賀紀正, 等. 非共生生物固氮微生物分子生態(tài)學研究進展［J］. 應用生態(tài)學報：2017, 28（10）：3440-3450.

［2］ 謝達平, 雷女孝, 彭道林, 等. 微生物菌肥的作用機理研究［J］.湖南文理學院學報：自然科學版, 2002, 14（1）：48-50.

［3］ 蔣先軍, 黃昭賢, 等. 硅酸鹽細菌代謝產(chǎn)物對植物生長的促進作用［J］. 西南大學學報：自然科學版, 2000, 22（2）：116-119.

［4］姚拓, 蒲小鵬, 張德罡, 等. 高寒地區(qū)燕麥根際聯(lián)合固氮菌研究——Ⅲ固氮菌對燕麥生長的影響及其固氮量測定［J］. 草業(yè)學報 , 2004, 13（5）：101-105.

［5］Cheng KC, Demirci A, Catchmark JM. Pullulan：biosynthesis,production, and applications［J］. Applied Microbiology &Biotechnology, 2011, 92（1）：29-44.

［6］Saehun M, Young-Lim K, Choon-Gil K. Development of reducedfat mayonnaise using 4α GTase-modified rice starch and xanthan gum［J］. International Journal of Biological Macromolecules,2009, 44（5）：400-407.

［7］Moon CJ, Lee JH. Use of curdlan and activated carbon composed adsorbents for heavy metal removal［J］. Process Biochemistry,2005, 40（3-4）：1279-1283.

［8］ 聶凌鴻, 彭華松. 微生物胞外多糖-結(jié)冷膠的生產(chǎn)與應用前景［J］. 生命的化學 , 2002, 22（2）：178-181.

［9］Fialho AM, Martins LO. Structures and properties of gellan polymers produced byATCC 31461 from lactose compared with those produced from glucose and from Cheese Whey［J］. Journal of Composite Materials, 2013, 48（25）：3083-3090.

［10］Hemme D, Foucaud-Scheunemann C. Leuconostoc, characteristics,use in dairy technology and prospects in functional foods［J］.International Dairy Journal, 2004, 14（6）：467-494.

［11］Xiao YH, Ting-Ting L, Tang XQ, et al. Effects of topdressing nitrogen on apparent quality, dry matter accumulation and contents of active components in the root ofIsatis indigoticaFort［J］.Journal of Plant Nutrition & Fertilizer, 2014, 20（2）：437-444.

［12］Liu XH, Ou HP, Yang RZ, et al. Change of polysaccharide content and its relation with nitrogen level in sugarcane leaves under nitrogen-fixing bacteria inoculation and nitrogen supply［J］.Sugar Tech, 2016, 18（1）：87-92.

［13］Tang J, Wan N, Zheng-Yu HU. Effect of Nitrogen on the Growth and polysaccharide content ofNostoc flagelliforme［J］. Food Science, 2010, 36（19）：92-95.

［14］Silva MCPE, Schloter-Hai B, Schloter M, et al. Temporal dynamics of abundance and composition of nitrogen-fixing communities across agricultural soils［J］. PLoS One, 2013, 8（9）：e74500.

［15］Reed SC, Cleveland CC, Townsend AR. Functional ecology of freeliving nitrogen fixation：A contemporary perspective［J］. Annual Review of Ecology Evolution and Systematics, 2011, 42：489-512.［16］Coelho MRR, de Vos M, Carneiro NP, et al. Diversity of nif H gene pools in the rhizosphere of two cultivars of sorghum（Sorghum bicolor）treated with contrasting levels of nitrogen fertilizer［J］.FEMS Microbiology Letters, 2008, 279：15-22.

［17］侯海軍, 秦紅玲, 陳春蘭, 等. 土壤氮循環(huán)微生物過程分子生態(tài)學進展［J］. 農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究, 2014, 35（5）：588-594.

［18］Crété P, Caboche M, Meyer C. Nitrite reductase expression is regulated at the post-transcriptional level by the nitrogen source inNicotiana plumbaginifoliaandArabidopsis thaliana［J］. Plant Journal, 2010, 11（4）：625-634.

［19］Sun HY, Guo W, Center T. Effects of different nitrogen level on carbon-nitrogen metabolic balance in kidney bean（Phaseolus vulgariL. ）［J］. Agricultural Research in the Arid Areas, 2013,81（5）：AB465-AB466.