無(wú)刺構(gòu)骨種子的休眠與萌發(fā)研究

況紅玲 杜丹 張欣 喻峰 王昆 楊玉潔 胡津鑫

摘 要： 冬青科植物種子在自然條件下，需要隔年甚至3年才能實(shí)現(xiàn)萌發(fā)，本文以無(wú)刺構(gòu)骨種子為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)無(wú)刺構(gòu)骨種子種皮的透性（透氣性和透水性）、不同時(shí)間的酸蝕處理、不同濃度的GA3溶液以及層積處理等多方面的試驗(yàn)，尋找阻礙種子萌發(fā)的因素，了解無(wú)刺構(gòu)骨種子的休眠原因，初步了解無(wú)刺構(gòu)骨種子的萌發(fā)生理。試驗(yàn)結(jié)果表明：無(wú)刺構(gòu)骨種子經(jīng)先暖溫后低溫及層積處理更有利于種子的生理后熟和萌發(fā)。

關(guān)鍵詞： 無(wú)刺構(gòu)骨；種子萌發(fā)；酸蝕處理；層積處理；GA3處理

中圖分類號(hào)：S792 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1004-3020（2018）01-0014-05

Study on Dormancy and Germination of Seeds with Ilex cornuta var.fortunei

Kuang Hongling（1） Du Dan（1） Zhang Xin（1） Yu Feng（1） Wang Kun（1） Yang Yujie（2） Hu Jinxin（2）

（1. Faye Ecological Environment Group Co.， LTD Wuhan 430206；2. Yangtze University Jingzhou 434100）

Abstract： The seed of Pinus elliottii seeds under the natural conditions is necessary for the next year or even three years to achieve germination. In this paper， the seeds of the seeds without acupuncture are used to study the permeability （permeability and permeability） Time agglutination treatment， different concentrations of GA3 solution and chromatography treatment and other aspects of the experiment to find the factors that impede the seed germination， to understand the seeds of the seeds without acupuncture， and to understand the germination and physiology of seeds without acupuncture. The results showed that the low temperature and stratification treatment of the seeds without the first warm temperature was more favorable to the physiological maturation and germination of the seeds.

Key words： Ilex cornuta var. fortunei；seed germination；acid etching treatment；lamination treatment； GA3 treatment

無(wú)刺枸骨（Ilex cornuta var.fortunei）是冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬枸骨（I. cornuta）的自然變種，常綠灌木或小喬木，樹(shù)種枝繁葉茂，葉形奇特，樹(shù)葉濃綠有光澤。樹(shù)冠圓整，4～5月開(kāi)黃綠色小花，花序?yàn)榫蹅慊ㄐ蚧騻阈位ㄐ?，雌雄異株，核果球形，初為綠色，入秋成熟轉(zhuǎn)紅，滿枝累累碩果，鮮艷奪目，經(jīng)冬不凋直至來(lái)年春季，經(jīng)修枝整形可制作成大樹(shù)形，球形及樹(shù)狀盆景，是良好的觀花、觀果、觀葉、觀形的樹(shù)種，多應(yīng)用于庭園觀賞和城市綠化。

由于無(wú)刺枸骨種子的休眠周期一般長(zhǎng)達(dá)3年，極大影響了生產(chǎn)上的繁殖效率。如何快速打破種子休眠，提高種子的發(fā)芽率，是目前無(wú)刺枸骨播種繁殖研究的難點(diǎn)。本文通過(guò)對(duì)無(wú)刺構(gòu)骨種子的深入了解，探究影響種子休眠的因素，尋找快速打破種子休眠的合理方法，同時(shí)為冬青屬其它樹(shù)種種子如何打破休眠奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供使用的無(wú)刺構(gòu)骨種子為2016年11月從市場(chǎng)購(gòu)入的當(dāng)年新鮮種子，核果用水浸漬2～3 d，待果肉充分軟熟后揉搓，淘洗，去除上層漂浮種子，沉在下層的飽滿種子為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

（1）種子千粒重、形態(tài)及生活力的測(cè)定。

種子的千粒重及形態(tài)測(cè)定：使用種子百粒法來(lái)測(cè)定，以100粒為一組，設(shè)五個(gè)重復(fù)。檢測(cè)并記錄種子的長(zhǎng)寬，種殼重以及胚乳的大小。

種子生活力的測(cè)定：隨機(jī)取2×100粒精選種子，浸水48 h，橫向切去種子頂端2/3～3/4；而后將種子置于35 ℃無(wú)光培養(yǎng)箱中，02%四唑溶液染色12 h；染色結(jié)束后流水反復(fù)沖洗，剝除種皮，沿中軸線縱切種子，露出胚等組織，在體視顯微鏡下觀察，并拍照。鑒定標(biāo)準(zhǔn)為：

①有生活力種子：胚和胚乳全部正常染色；胚全部染色，胚乳少量未染色。

②無(wú)生活力種子：胚和胚乳都未染色；胚全部染色，胚乳未染色。

（2）種子吸水性的測(cè)定。

分別取風(fēng)干種子兩份，60粒為一份，第一份為完整的風(fēng)干種子，第二份用針刺破種皮，將兩份種子置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中吸水，分別在2，4，6，8，10，12 h）測(cè)重。取出種子時(shí)，吸水紙徹底吸干種子表面的浮水后靜置10 min稱重，并做好記錄。

（3）濃硫酸處理。

將供試驗(yàn)的種子倒入一定量的濃硫酸（比重1.84）溶液中，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間（1 min，5 min，10 min，30 min，1 h，2 h，3 h）處理后種子再置于流水沖洗16～20 h，再進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，該處理以20粒為一組，三次重復(fù)。

（4）藥劑處理。

將供試驗(yàn)的冬青種子用GA3溶液處理，經(jīng)過(guò)不同濃度的GA3+H2SO4溶液（100，250，500 mg/L）浸種24 h，再行發(fā)芽試驗(yàn)，該處理以20粒為一組，三次重復(fù)。

（5）層積處理。

自然層級(jí)：1月1日， 將種子與濕沙分層堆放（濕沙與種子的比例為3∶1）于花盆內(nèi)，盆口用塑料布扎緊，置于室外干燥避風(fēng)陰涼處、排水良好、深20 cm的土坑中催芽約180 d，7月1日取出種子統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，該處理以100粒為一組，三次重復(fù)。

低溫層級(jí)：1月1日，將種子與濕沙分層堆放（濕沙與種子的比例為3∶1）于花盆內(nèi)，盆口用塑料布扎緊，置于室內(nèi)冰箱內(nèi)，催芽180 d，溫度為4 ℃，7月1日取出，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，該處理以100粒為一組，三次重復(fù)。

變溫層積：1月1日，將種子與濕沙分層堆放（濕沙與種子的比例為3∶1）于花盆內(nèi)，盆口用塑料布扎緊，置于室內(nèi)冰箱內(nèi)，催芽120 d，溫度為4 ℃，5月1日從冰箱中取出，置于室外干燥避風(fēng)陰涼處、排水良好、深20 cm的土坑中催芽60 d，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，該處理以100粒為一組，三次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel、SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

萌發(fā)率（%）=發(fā)芽種子數(shù)/測(cè)定種子數(shù)×100%

吸水率（%）=[吸水后質(zhì)量（g）-吸水前質(zhì)量（g）]/吸水前質(zhì)量（g）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)刺構(gòu)骨種子生物學(xué)特性

（1）無(wú)刺構(gòu)骨種子的基本形態(tài)特征。無(wú)刺構(gòu)骨果實(shí)為漿果狀，通常為球形，成熟的紅果懸掛于枝頭，干后變?yōu)樯罴t色，果肉肥厚多汁，每顆果實(shí)大約有4～5粒種子，種子狹長(zhǎng)披針形，外背面形如溝壑。

通過(guò)對(duì)無(wú)刺構(gòu)骨果實(shí)的揉搓和清洗，得到干凈良好的種子，通過(guò)對(duì)種子的長(zhǎng)度、寬度以及胚乳的測(cè)定和觀察，得到以下數(shù)據(jù)，見(jiàn)圖1。

種子外部形態(tài)統(tǒng)一，長(zhǎng)度（664±035）mm，寬度（386±03）mm，高度（372±025）mm，千粒重為1522 g，種子有仁率7826%，種殼的重量占完整無(wú)刺構(gòu)骨種子的81%，結(jié)果表明，種殼的厚重在一定程度上導(dǎo)致了種子的休眠。

（2）種子生活力測(cè)定。種子生活力是檢驗(yàn)種子生長(zhǎng)發(fā)育好壞的基本標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)也反應(yīng)種子的質(zhì)量問(wèn)題，經(jīng)測(cè)試，用于試驗(yàn)的種子中有生活力的為187粒，無(wú)生活力的為13粒，有生活力的種子占到總種子數(shù)量的93.5%，說(shuō)明供試驗(yàn)的大多數(shù)種子的質(zhì)量良好。

（3）種子的透水性。完整種子和破皮種子的吸水情況，見(jiàn)圖2。

由圖2所示，在浸泡前期，完整枸骨種子與破皮種子的吸水情況基本保持一致，隨著時(shí)間的推移，在浸泡中期，破皮的無(wú)刺構(gòu)骨種子的吸水率高于完整種子，在浸泡后期，兩種種子吸水率達(dá)到飽和一致。結(jié)果表明：由于無(wú)刺構(gòu)骨種子種皮堅(jiān)硬，完整種子的吸水率增長(zhǎng)緩慢，種皮的堅(jiān)硬程度在一定程度上對(duì)種子的吸水率有影響。

2.2 不同酸蝕時(shí)間處理對(duì)種子發(fā)芽率的影響

由于無(wú)刺構(gòu)骨種子種皮木質(zhì)而堅(jiān)硬，阻礙種子的萌發(fā)，但酸蝕處理能夠使種殼減輕，增加它的透性，提高種子的發(fā)芽率。通過(guò)對(duì)無(wú)刺構(gòu)骨種子不同時(shí)間的酸蝕處理，可摸索出最合適的酸蝕時(shí)間，見(jiàn)下表1。

據(jù)表1所知，無(wú)刺構(gòu)骨種子在經(jīng)過(guò)酸蝕處理后，酸蝕時(shí)間越久，種殼的腐蝕比率越多，腐爛率也相對(duì)增加，而發(fā)芽率隨著種殼腐蝕比率和腐爛率的變化而變化，試驗(yàn)結(jié)果表明：無(wú)刺構(gòu)骨種子經(jīng)過(guò)酸蝕處理時(shí)間1 h，更合適地減輕種殼的重量，穩(wěn)定種子的腐爛程度，促進(jìn)無(wú)刺構(gòu)骨種子的萌發(fā)。

2.3 GA3和濃硫酸的綜合處理對(duì)種子發(fā)芽率的影響

據(jù)表2可知，不同濃度GA3溶液與不同酸蝕時(shí)間的綜合處理對(duì)無(wú)刺構(gòu)骨種子發(fā)芽率有著明顯的提升，發(fā)芽率隨著GA3濃度的增加而提高，但不是濃度越高越有利，濃度太高反而降低了無(wú)刺構(gòu)骨種子胚的活性，結(jié)果表明：用濃度為250 ml GA3處理的種子萌發(fā)效果最好。

2.4 層積處理對(duì)種子發(fā)芽率的影響

層積處理是打破種子綜合性休眠的有效方法，層積處理可分為自然層積、低溫層積和變溫層積，通過(guò)對(duì)不同的層積處理（自然層積、低溫層積180 d，變溫層積暖溫60 d+低溫120 d）探討對(duì)無(wú)刺構(gòu)骨種子發(fā)芽率的影響，如圖3所示。

實(shí)驗(yàn)表明：無(wú)刺構(gòu)骨種子經(jīng)過(guò)自然層積、低溫層積180 d后，種子的發(fā)芽率分別為06%、13%，相比較自然層積與低溫層積，變溫層積的萌發(fā)率明顯有優(yōu)勢(shì)，發(fā)芽率達(dá)5.8%，于是可推斷無(wú)刺構(gòu)骨種子經(jīng)過(guò)自然層積，對(duì)無(wú)刺構(gòu)骨種子打破休眠無(wú)明顯的促進(jìn)作用，與自然層積處理相比，低溫層積可使部分種子打破休眠，但發(fā)芽率也是較低，然而，經(jīng)過(guò)變溫層積（先暖溫再低溫）層積處理后的無(wú)刺構(gòu)骨種子，更有利于種子胚的生長(zhǎng)發(fā)育，提高種子的發(fā)芽率。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

（1）種皮對(duì)種子休眠的影響。由于無(wú)刺構(gòu)種子種皮木質(zhì)化，堅(jiān)硬而緊密等一系列的種皮障礙，導(dǎo)致種子進(jìn)行強(qiáng)迫休眠，綜合而言，種皮障礙通常指的是種皮的不透水性、不透氣性和種皮產(chǎn)生的機(jī)械障礙所引起的。堅(jiān)硬的種皮限制了種胚與外界的氣體交換，阻斷氧氣和二氧化碳的的排放，阻礙種胚的呼吸，無(wú)法為種子萌發(fā)提供必需的能量物質(zhì)，很多學(xué)者表明，種子堅(jiān)硬木質(zhì)化、細(xì)胞排列致密的種皮特性是導(dǎo)致種子休眠的主要因素，根據(jù)同對(duì)李近雨對(duì)核桃種子的研究表明，種殼的機(jī)械約束是種子發(fā)芽慢的主要原因[6]，狹葉冬青（Ilex fargesii ）堅(jiān)硬致密的種皮透氣性較差是種子強(qiáng)迫休眠的因素之一[7]，徐本美等的試驗(yàn)指出大果種子的強(qiáng)迫休眠主要是種皮透氣性差所致，此特性與山楂（Crata- egus pinnatifida bunge.）、圓柏（Sabina chinensis）、薔薇（Rosa laevigata）、秤錘樹(shù)（S.xylocarpa）、大葉冬青、膀胱果（S.holocarpa）相近[8-10]等學(xué)說(shuō)進(jìn)行分析和比較，本試驗(yàn)中的無(wú)刺構(gòu)骨種子存在的不透水性、不透氣性和種皮的機(jī)械障礙在很大程度上阻礙種子無(wú)法萌發(fā)，抑制胚的生長(zhǎng)。

酸蝕處理能夠有效的酸蝕種皮外致密組織細(xì)胞，減少種皮障礙和種殼的重量，使胚能夠脫離種皮的束縛，增強(qiáng)胚的透性，促進(jìn)種子胚的萌發(fā)[11]，對(duì)無(wú)刺構(gòu)骨種子經(jīng)過(guò)濃硫酸處理后，種子的發(fā)芽率得到大大地提高，并且把握合適的酸蝕時(shí)間是至關(guān)重要的，若酸蝕時(shí)間不夠，則無(wú)法充分的酸蝕種皮障礙，為種子萌發(fā)達(dá)到預(yù)期的效果，若酸蝕時(shí)間太久，則會(huì)充分酸蝕掉種皮，對(duì)種胚造成不可挽回的損害，容易使種胚腐爛，導(dǎo)致種胚死亡。

（2）胚發(fā)育狀況對(duì)種子休眠的影響。在無(wú)刺構(gòu)骨果實(shí)成熟后進(jìn)行采摘，揉搓果實(shí)，風(fēng)干種子，以便解剖種子，如圖1所示，種胚長(zhǎng)度約0.3～0.4mm，僅為萌發(fā)時(shí)胚長(zhǎng)的1/10，此時(shí)胚尚處于胚原基階段；幼胚從胚乳的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中攝取能量，以促進(jìn)種子萌發(fā)，種子在自然成熟后，種胚還在初級(jí)階段，胚未發(fā)育完全，此時(shí)需要先完成形態(tài)發(fā)育成熟才能打破休眠而促進(jìn)萌發(fā)。

對(duì)于如何加快無(wú)刺構(gòu)骨種子胚生理后熟的過(guò)程，變溫層積處理是最有效的處理方法。暖層積階段時(shí)，種胚才開(kāi)始慢慢地分化，種胚生長(zhǎng)發(fā)育較慢，這與Leonard 等[12]進(jìn)行西洋參種子研究中所獲結(jié)論一致。暖層積過(guò)程中胚可能會(huì)出現(xiàn)一段時(shí)間的靜止期，因此暖層積初期胚乳需要從種胚汲取大量的營(yíng)養(yǎng)，于是種胚生長(zhǎng)緩慢。低溫層積階段種胚開(kāi)始迅速生長(zhǎng)，層積120 d后，大部分的無(wú)刺構(gòu)骨種子已經(jīng)完成生理后熟的過(guò)程，但不同的是，各種胚的質(zhì)量和胚的發(fā)育狀況有所不同，小部分無(wú)刺構(gòu)骨種子仍出現(xiàn)半成熟狀態(tài)，結(jié)果導(dǎo)致無(wú)刺構(gòu)骨種子萌發(fā)齊性不一致。

（3）內(nèi)源抑制物對(duì)種子休眠的影響。許多植物的果實(shí)和種皮中都存在發(fā)芽抑制物，主要包含一些有機(jī)酸、生物堿、脂類、醛類等物質(zhì)具有直接或者間接抑制種子萌發(fā)的作用[13]，其中香豆素、脫落酸是兩種對(duì)種子萌發(fā)較強(qiáng)的抑制物[14]。

GA3處理能夠有效的促進(jìn)種子胚的生長(zhǎng)發(fā)育，它能誘導(dǎo)胚乳產(chǎn)生水解酶，將水中的貯藏物質(zhì)從大分子轉(zhuǎn)化為小分子，如淀粉水解為糖，蛋白質(zhì)水解為氨基酸，來(lái)供胚進(jìn)行吸收，同時(shí)促進(jìn)胚中有機(jī)物和無(wú)機(jī)物間的轉(zhuǎn)換，使胚完成生理后熟過(guò)程，還能促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)，促進(jìn)DNA和RNA淀粉合成[15-16]，能夠抑制ABA在休眠種子中的積累[17]。

3.2 結(jié)論

通過(guò)對(duì)無(wú)刺構(gòu)骨種子一系列的探討和研究，來(lái)找尋影響種子休眠的主要因素，無(wú)刺構(gòu)骨種子具有種皮堅(jiān)硬的特性，種殼占種子重量的87.3%，透氣性極差，影響種子胚和胚乳的物質(zhì)和氣體交換，阻礙種子的萌發(fā)，是導(dǎo)致種子休眠的主要因素之一。酸蝕處理能夠酸蝕種皮，打破種皮障礙，加快種胚的生長(zhǎng)發(fā)育，但并不能使種子提前萌發(fā)，種子的胚和胚乳中存在一定的內(nèi)源抑制物，在一定程度上限制胚的生長(zhǎng)發(fā)育，赤霉素GA3能夠減少胚中的內(nèi)源抑制物，促進(jìn)胚的生長(zhǎng)發(fā)育，另外，因?yàn)闊o(wú)刺構(gòu)骨種子具有隔年發(fā)芽的特性，采摘后的果實(shí)存在未完全發(fā)育的情況，經(jīng)過(guò)生理后熟才能進(jìn)行萌發(fā)，層積處理是一種常用的打破種子休眠的方法，它分為自然層積、低溫層積和變溫層積，由于，無(wú)刺構(gòu)骨種子具有隔年發(fā)芽生理特性和生理后熟的種皮特性，自然層積不能短時(shí)間內(nèi)的打破種子休眠，低溫層積只能打破部分成熟種子的休眠，且發(fā)芽率低，變溫層積（先暖溫后低溫）處理對(duì)打破種子休眠有非常顯著的變化，能夠加快種子生長(zhǎng)發(fā)育，加快種子胚的吸收，促進(jìn)種子萌發(fā)，是最適合作為打破種子休眠的一種層積處理。因此，在了解阻礙無(wú)刺構(gòu)骨種子休眠的種種因素之后，得出最佳的解除種子休眠的方法為：98%濃硫酸1 h+250 mg/L赤霉素溶液浸種24 h+暖層積60 d+低溫層積120 d。

參 考 文 獻(xiàn)

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