大豆分離蛋白對(duì)大鼠阿霉素腎病模型穩(wěn)定性的影響

朱建立，何美霞，汲振余，張　勇，郭　佳，盛譽(yù)妍，郭建成，權(quán)松霞，杜　斌

1)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院 鄭州 450052　2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 鄭州 450052　3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450052

阿霉素(adriamycin,ADR)腎病動(dòng)物模型是當(dāng)今腎病科研領(lǐng)域應(yīng)用較多的經(jīng)典模型[1]，該模型的建立與ADR的劑量，給藥途徑、次數(shù)、間隔時(shí)間，單側(cè)腎切除或一側(cè)腎動(dòng)脈鉗夾等因素密切相關(guān)[2]。本研究中我們通過(guò)在大鼠飼料中添加大豆分離蛋白，復(fù)制出成功率高、一致性好、簡(jiǎn)便易行的ADR腎病動(dòng)物模型，并對(duì)該模型進(jìn)行了長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)觀察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重130～150 g，購(gòu)于河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(豫)2005-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作在鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。室溫22～26 ℃，濕度50%～70%，光照正常，晝夜交替。

1.2實(shí)驗(yàn)方法大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)行尿常規(guī)檢測(cè)。將檢測(cè)結(jié)果正常的70只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=7)、普通飼料組(n=31)和高蛋白飼料組(n=32)。用生理鹽水將ADR (浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)100501)配制為0.2 g/mL的溶液，參考文獻(xiàn)[3]，普通飼料組和高蛋白飼料組第1次按4.0 mg/kg的用量由尾靜脈注射ADR，1周后按3.5 mg/kg的用量再次注射ADR；對(duì)照組注射等量的生理鹽水；高蛋白飼料組大鼠從第1次注射ADR起，給予2周高蛋白飼料喂養(yǎng)，此后改為普通飼料喂養(yǎng)；普通飼料組和對(duì)照組大鼠始終采用大鼠全價(jià)顆粒飼料和無(wú)菌水喂養(yǎng)。全價(jià)顆粒飼料經(jīng)河南省農(nóng)科院質(zhì)標(biāo)中心檢驗(yàn)粗蛋白含量為24.87%，高蛋白飼料是在全價(jià)顆粒飼料中加入占比為20%的大豆分離蛋白(湖北省云夢(mèng)龍?jiān)频鞍资称酚邢薰?，批?hào)：20120321-5)，粗蛋白含量32.68%。

1.3觀察指標(biāo)①記錄3組大鼠造模18 d后的存活率。②24 h尿蛋白總量(24 h Pro)：從首次注射ADR起至第18天每天收集24 h 尿液，測(cè)定尿液體積，采用磺基水楊酸-硫酸鈉法測(cè)定24 h Pro， 24 h Pro>30 mg者計(jì)入ADR腎病模型；并于造模前，造模24、31、38、45和52 d，同法測(cè)定對(duì)照組和高蛋白飼料組大鼠的24 h Pro，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。③后肢足掌厚度：造模24、31、38、45和52 d，測(cè)量對(duì)照組和高蛋白飼料組大鼠左后肢足掌的厚度(mm)，減去造模前的數(shù)值，計(jì)算厚度變化的百分?jǐn)?shù)，作為水腫程度變化的標(biāo)志。④血清白蛋白和腎功能水平：造模前，造模24、31、38、45和52 d，對(duì)照組和高蛋白飼料組大鼠眶后靜脈叢取血，檢測(cè)血清白蛋白和血清尿素氮水平。⑤腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察：造模24 d后，隨機(jī)抽取對(duì)照組和高蛋白飼料組大鼠各1只，處死，取腎臟，切片厚度為3 μm。進(jìn)行碘酸雪夫染色(PAS)，PAS試劑盒由福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供。光鏡下觀察腎小球組織結(jié)構(gòu)。用透射電鏡(TEM)觀察腎小球足突結(jié)構(gòu)和基底膜。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(造模52 d)，取2組動(dòng)物雙側(cè)腎臟，分離包膜后稱重，計(jì)算臟器系數(shù)(雙側(cè)腎臟重量/體重×100%)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理動(dòng)物造模18 d，3組大鼠24 h Pro水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不同時(shí)間點(diǎn)小鼠24 h pro、水腫程度、血清白蛋白和尿素氮的變化采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析；實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組和高蛋白飼料組臟器系數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1造模18d后3組大鼠的存活率和24hpro比較對(duì)照組和高蛋白飼料組大鼠的存活率均為100%；普通飼料組大鼠自注射ADR后第12天死亡4只，第13天死亡4只，第14天死亡3只，第15天死亡1只，第16天死亡4只，至第18天時(shí)累計(jì)死亡16只，存活率為50%，說(shuō)明給予ADR建模飼喂普通飼料大鼠死亡率高，以下著重觀察建模后給予高蛋白飼料的大鼠與正常對(duì)照各指標(biāo)的差異。動(dòng)物造模18 d，對(duì)照組、普通飼料組和高蛋白飼料組大鼠24 h Pro分別為(7.1±1.4)、(115.6±84.0)和(33.5±3.6) mg，3組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.139，P=0.004)；與對(duì)照組相比，普通飼料組和高蛋白飼料組大鼠24 h Pro均升高(P均<0.05)；同時(shí)普通飼料組高于高蛋白飼料組(P<0.01)，且前者24 h Pro所測(cè)得數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)差遠(yuǎn)大于后者。

2.22組大鼠不同時(shí)期24hPro的變化結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，造模24 d高蛋白飼料組大鼠24 h Pro隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，且高于對(duì)照組。

表1　2組大鼠不同時(shí)期24 h Pro的變化　mg

F組間=3 705.105,F時(shí)間=559.219,F交互=549.318,P均<0.001；*：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.32組大鼠不同時(shí)期水腫程度的變化結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，造模24 d，與對(duì)照組相比，高蛋白飼料組大鼠表現(xiàn)出明顯的水腫，且隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)水腫逐漸加重。

表2　2組大鼠不同時(shí)期水腫程度的變化　%

F組間=4 756.500,F時(shí)間=71.890,F交互=49.953,P均<0.001；*：與對(duì)照組比較，P<0.05

2.42組大鼠不同時(shí)期血清白蛋白和尿素氮水平比較結(jié)果見(jiàn)表3、4。與對(duì)照組相比，高蛋白飼料組大鼠在造模24 d后血清白蛋白水平降低，之后持續(xù)降低；與對(duì)照組相比，高蛋白飼料組動(dòng)物大鼠血清尿素氮水平在給藥后39 d開(kāi)始升高。

表3　2組大鼠不同時(shí)期血清白蛋白水平的比較　g/L

F組間=90.749,F時(shí)間=9.081,F交互=11.523,P均<0.001；*：與對(duì)照組比較，P<0.05

表4　2組大鼠不同時(shí)期尿素氮水平的比較　mmol/L

F組間=59.345,F時(shí)間=54.255,F交互=58.265,P均<0.001；*：與對(duì)照組比較，P均<0.05

2.5腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)照組、高蛋白飼料組動(dòng)物的臟器系數(shù)分別是(0.74±0.04)、(1.29±0.18)，后者高于前者(t=7.248，P<0.01)。2組腎組織電鏡結(jié)果如圖1上排所示。造模24 d，對(duì)照組腎小球各結(jié)構(gòu)無(wú)病變，足細(xì)胞足突清晰、明顯，腎小球基底膜完整，均勻一致，高蛋白飼料組足細(xì)胞足突發(fā)生部分融合，基底膜厚度不均一；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組腎小球足細(xì)胞足突正常，腎小球基底膜完整，均勻一致，高蛋白飼料組可見(jiàn)足突廣泛融合、裂隙消失，基底膜顯著增厚。 PAS染色結(jié)果如圖1下排所示。造模24 d，光鏡下對(duì)照組未見(jiàn)異常，高蛋白飼料組腎小球未見(jiàn)病變，但腎小管管腔腫脹，有顆粒變性；實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)光鏡下對(duì)照組腎小球、腎小管和間質(zhì)均未見(jiàn)結(jié)構(gòu)異常，高蛋白飼料組可見(jiàn)腎小球基底膜節(jié)段增厚，球囊粘連，呈現(xiàn)顯著的腎小球節(jié)段性硬化，腎小管上皮細(xì)胞層空泡變性，存在大量蛋白管型。

1：電鏡，標(biāo)尺1 900.00 nm；2：腎臟PAS(×400)；A、B:造模24 d的對(duì)照組和高蛋白飼料組；C、D:實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的對(duì)照組和高蛋白飼料組圖1　各組大鼠腎組織電鏡觀察和PAS結(jié)果

3　討論

ADR是含醌的蒽環(huán)抗生素，在臨床上作為腫瘤化療藥物廣泛應(yīng)用,可在腎臟內(nèi)代謝還原為半醌型自由基。后者與氧反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，誘發(fā)腎小球上皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，破壞濾過(guò)膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致膜濾過(guò)屏障的選擇性變化而引起蛋白尿[4]。ADR的腎毒性及大量蛋白尿的產(chǎn)生進(jìn)一步誘發(fā)腎小球內(nèi)固有細(xì)胞及其他炎性細(xì)胞產(chǎn)生并釋放各種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，刺激腎小球系膜細(xì)胞增殖和系膜基質(zhì)增多，緩慢發(fā)展形成腎小球硬化[5-6]。以上研究結(jié)果提示ADR誘導(dǎo)腎病具有慢性和自我進(jìn)展的特性，這也是人類慢性進(jìn)展性腎病的特征。根據(jù)ADR對(duì)腎臟毒性的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)研究中可分為急性腎病模型和慢性腎病模型。急性腎病模型類似于人微小病變型腎病,而慢性腎病模型類似于人慢性腎小球腎炎和局灶節(jié)段性腎小球硬化。

許多因素會(huì)影響ADR腎病模型的穩(wěn)定性。提高模型成功率和降低動(dòng)物個(gè)體差異是動(dòng)物疾病模型復(fù)制過(guò)程中需要解決的兩個(gè)問(wèn)題。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中曾采用與本研究報(bào)道同批次的ADR第1次尾靜脈注射4.0 mg/kg，間隔1周，注射相同劑量的ADR，雖然在20 d后模型成功率可達(dá)90%，但后期用藥期間，模型大鼠因ADR的嚴(yán)重毒性，一直持續(xù)腹瀉，且經(jīng)常出現(xiàn)口鼻出血現(xiàn)象，死亡率高、動(dòng)物個(gè)體間24 h Pro差別也比較大。即使將第2次注射ADR的劑量減低到3.5 mg/kg，動(dòng)物腹瀉減少，但仍然出現(xiàn)動(dòng)物死亡率高、動(dòng)物個(gè)體間24 h Pro差別大的問(wèn)題。后來(lái)經(jīng)過(guò)多次反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在飼料中添加20%大豆分離蛋白可以顯著提高動(dòng)物的存活率，不僅如此，模型動(dòng)物個(gè)體間24 h Pro的差異亦明顯減少，這對(duì)于后期研究十分有利。據(jù)報(bào)道[7-9]，大豆分離蛋白有減少脂質(zhì)在肝臟中的積累，加強(qiáng)排泄和抑制脂肪吸收，減緩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和受試者的腎損傷進(jìn)展，降低血壓，改善血脂水平的作用。對(duì)于5/6腎臟切除大鼠模型，大豆分離蛋白可以有效降低血壓和膽固醇，并具有減輕腎臟損傷的作用，對(duì)于人的2型糖尿病和腎病也有減輕尿蛋白和改善血脂的作用。此外，據(jù)報(bào)道[10-11]，大豆分離蛋白可以改善血脂異常的胰島素抵抗模型大鼠脂肪組織功能障礙，改善糖尿病大鼠氧化應(yīng)激。而大豆分離蛋白對(duì)腎臟損傷的保護(hù)作用是否與其抗氧化作用有關(guān)，有待進(jìn)一步研究探討。

我們通過(guò)電鏡觀察到高蛋白飼料組自第1次給ADR后24 d，24 h Pro大于30 mg時(shí)，光鏡下可見(jiàn)腎小球正常，電鏡下可見(jiàn)足細(xì)胞足突足發(fā)生部分融合，基底膜厚度不均一，說(shuō)明大鼠有類似臨床患者的微小病變型腎病。在此基礎(chǔ)之上，我們又繼續(xù)動(dòng)態(tài)觀察了4周，發(fā)現(xiàn)高蛋白飼料組大鼠24 h Pro持續(xù)增加，從造模24 d時(shí)的36.7 mg逐漸增至293.5 mg；血清白蛋白則持續(xù)降低，第39天起血清尿素氮顯著升高；水腫也更加明顯，可見(jiàn)隨著觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，各種癥狀逐漸加重， ADR的毒性呈現(xiàn)漸進(jìn)性增加；在實(shí)驗(yàn)結(jié)束，即造模第52天通過(guò)電鏡觀察到足突廣泛融合、消失，基底膜明顯增厚。說(shuō)明動(dòng)物出現(xiàn)了腎小球節(jié)段性硬化的病變。我們也對(duì)該模型進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的觀察，發(fā)現(xiàn)模型動(dòng)物在觀察期間24 h Pro持續(xù)升高，腎小球節(jié)段性硬化的病變更加惡化。當(dāng)然該模型在應(yīng)用中還應(yīng)注意ADR的批次不同，其24 h Pro會(huì)有所差異，所以需要做預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定ADR的劑量，同時(shí)ADR易滲漏到血管外引起組織壞死，也使得進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的ADR的量不準(zhǔn)確，所以熟練掌握大鼠尾靜脈注射也是十分必要的。

總之，本研究通過(guò)兩次給予ADR后在動(dòng)物飼料中添加大豆分離蛋白構(gòu)建大鼠ADR腎病模型，操作簡(jiǎn)便，建模時(shí)間短，成功率高；模型大鼠間24 h Pro等指標(biāo)變異小，重復(fù)性和穩(wěn)定性好；該模型大鼠的病變時(shí)間長(zhǎng)，病情持續(xù)加重，有利于動(dòng)態(tài)觀察慢性腎病的進(jìn)展和變化，為腎病研究以及新藥作用觀察提供了基礎(chǔ)。

致謝：感謝鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院代麗萍教授在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方面給予的指導(dǎo)。

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