CAR-NK治療腫瘤的研究與臨床進展

劉兵 周美齡 劉韜

腫瘤治療是現(xiàn)代醫(yī)學面臨的一項重大挑戰(zhàn)。腫瘤免疫細胞治療是一種新興的特異性強、副作用小并具有廣闊發(fā)展前景的治療方法。2017年7月，諾華嵌合抗原受體 T（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）細胞產(chǎn)品被美國FDA正式批準上市，并在之前的臨床研究中展現(xiàn)出對血液瘤良好的治療效果。相較于CAR-T療法，自然殺傷細胞（natural killer cells，NK細胞）作為效應細胞具有很多優(yōu)良特性。首先，不會像T細胞一樣產(chǎn)生移植物抗宿主反應（graft- versus- host disease，GVHD）現(xiàn)象，有望成為通用型細胞治療手段；其次，NK細胞不受抗原特異性組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）限制，具有更強的殺傷能力；再次，NK細胞表面CD16低親和力分子可與靶細胞表面IgG 抗體復合物介導ADCC作用；NK細胞也可通過Fas/ FasL途徑介導細胞凋亡，釋放細胞因子[1]。綜合上述優(yōu)點，使用NK細胞改造的嵌合抗原受體NK（chimeric antigen receptor NK-cell，CAR-NK）細胞將更有應用前景。本文對CAR-NK目前研究的進展及臨床初步應用成果進行了總結(jié)，為下一步在實體瘤應用提供依據(jù)。

一、CAR-NK體系的構(gòu)建

CAR-NK構(gòu)建是通過基因修飾手段，人為的構(gòu)建一條NK細胞活化通路從而特異性增強NK細胞抗腫瘤效果。目前為止，在CAR-T構(gòu)建基礎上，根據(jù)NK細胞特性設計出了較為完善的CAR構(gòu)建途徑。

（一）CAR結(jié)構(gòu)

CAR主要包括抗原結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)信號區(qū)三大基本構(gòu)造。根據(jù)胞內(nèi)區(qū)域的不同，CAR結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)展到目前的第三代[2]（圖 1）。

1.抗原結(jié)合區(qū)及跨膜區(qū)：抗原結(jié)合區(qū)決定CAR-NK的特異性和靶向性，該部分由單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)scFv構(gòu)成，與靶細胞表面的特異性抗原結(jié)合，從而識別腫瘤細胞。目前為止，已有多種靶點展開臨床試驗，如CD19[3]，CD20[4]，CS1[5]，EGFR/EGFR Ⅷ[6]，ErBb2/HER2-[7]，CD3[8]，CD138[9]等（表1）?？缒^(qū)的作用是將胞外的信息傳遞到胞內(nèi)，現(xiàn)在最常見的為CD3ζ跨膜序列，HLA-A2以及CD8也越來越多的作為跨膜序列應用[10]。

2.胞內(nèi)信號區(qū)：胞內(nèi)信號區(qū)結(jié)構(gòu)至關重要。該區(qū)域決定著活化信號的強弱，直接影響殺傷效果。第一代CAR結(jié)構(gòu)使用CD3ζ做為胞內(nèi)段。它由3個免疫受體酪氨酸激活基序構(gòu)成[11]。在第一代的基礎上串聯(lián)入1個或2個激活結(jié)構(gòu)域，如：CD28，CD137，41BB等，形成第二代和第三代CAR結(jié)構(gòu)（圖1）。靶向CD19的第一代CAR-T與第二代對比，加入CD28信號分子的第二代CAR-T性能要更加穩(wěn)定[12]。CD28/CD3ζ共刺激信號，對NK細胞同樣有效。有研究顯示，具有CD28/CD3ζ共刺激信號的CAR-NK注射入多發(fā)性骨髓瘤荷瘤小鼠模型體內(nèi)，可以檢測到NK細胞的活化并能抑制腫瘤的生長，延長荷瘤小鼠的生存周期[5]。

圖1 嵌合抗原受體結(jié)構(gòu)

表1 用于NK細胞基因修飾的CAR結(jié)構(gòu)

雖然由CAR-T的設計思路演化而來的二代CAR激活信號在CAR-NK的構(gòu)建早期得到延用，但是DAP12，F(xiàn)cεRLγ是NK細胞特有的活化受體，其效率更高。在最新的研究中，將僅有一個免疫受體酪氨酸激活基序的DAP12[13]作為胞內(nèi)域，融合PSCAscFv抗原區(qū)修飾NK細胞系YTS后，可以增加IFN-γ的分泌，在動物實驗中也起到抗腫瘤效果[13]。因此利用NK細胞自身相關激活元件設計的CAR預計能更好地在體內(nèi)激活NK細胞。

NK92是廣泛應用的NK穩(wěn)定細胞系，該細胞系相比于原代NK細胞缺乏殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer immunoglobulin-like receptor，KIR）抑制受體，一直處于活化狀態(tài)，因此構(gòu)建CAR結(jié)構(gòu)的時候引入“開關”裝置，是降低其潛在副作用的一個優(yōu)化策略[14]。

（二）載體選擇

CAR-NK的特異性殺傷取決于抗原結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)以及胞內(nèi)信號域的相互作用，當CAR基因在細胞的增殖以及生長過程中可以持續(xù)穩(wěn)定表達才能保證上述功能有序的進行。因此表達載體在CAR-NK的構(gòu)建中顯得尤為重要。

CAR-NK在構(gòu)建過程中需要克服轉(zhuǎn)染這一技術(shù)難關。傳統(tǒng)構(gòu)建方法有電轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、鈣轉(zhuǎn)染法以及病毒轉(zhuǎn)染法。病毒載體具備傳送其攜帶的基因組進入其他細胞并進行感染的分子機制，具有感染及表達率高的優(yōu)點。目前常見的可以用來轉(zhuǎn)染NK細胞的病毒基因載體主要包括：逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus，Rv）、腺病毒（adenovirus，Adv）、慢病毒（lentivirus，Lv）、腺相關病毒（adeno associated virus，AAV）、仙臺病毒（sendaivirus，SeV）等（表 2）。逆轉(zhuǎn)錄病毒以及慢病毒是CAR-NK構(gòu)建過程中比較常用的載體。Imai等[28]在研究中發(fā)現(xiàn)，用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染原代NK的效率為43﹪～ 93﹪。電轉(zhuǎn)染法相比于慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建的CD19/ CD20 CAR-NK，電轉(zhuǎn)染的效率＜ 10﹪，慢病毒轉(zhuǎn)染外周血來源的NK的效率為8﹪～ 16﹪，對于臍帶血來源的NK效率為12﹪～ 73﹪[10]。仙臺病毒在CAR-NK 的臨床級研究還未見報道。

二、NK效應細胞的來源

NK細胞可以有多種來源（表3）：外周血，臍帶血，人胚胎干細胞（human embryonic stem cell，hESC）以及誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）。

（一）干性細胞來源的NK細胞

人胚胎干細胞以及誘導多能干細胞分化而來的NK細胞已經(jīng)開始廣泛研究。臍帶血在體外分化擴增的NK細胞已經(jīng)向臨床轉(zhuǎn)化[29]。2017年6月份，MD Anderson癌癥中心利用臍帶血誘導分化出NK細胞，并進行嵌合抗原受體改造，用于治療復發(fā)或者耐藥性慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL），急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）或非霍奇金淋巴瘤已經(jīng)進入臨床Ⅰ、Ⅱ期階段。另有研究表明，體外用iPSC以及hESC分化而來的NK細胞用CD4-CAR修飾，在體外有良好的抗HIV感染的功能[30]。加州大學最新研究報道，IPS誘導分化而來的NK細胞在經(jīng)過CAR改造后，可以抑制卵巢癌模型小鼠體內(nèi)腫瘤的生長，并且延長荷瘤小鼠的生存周期[31]。這種方式獲得的NK細胞純度較高，是一種較好的NK來源。

（二）自體外周血來源

過去的十幾年，在外周血中已經(jīng)可以高效分離并擴增臨床級NK細胞。這種方法獲得的NK細胞已經(jīng)用于急性髓細胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的治療試驗[32]。原代NK細胞的表面表達KIR，該受體是維持NK細胞功能的關鍵。因此異體移植的NK細胞與受體患者的HLA-Ⅰ類分子不相符，NK細胞會保持持久的殺傷效果[33]。但是，在外周血中分離得到的細胞需要檢測T細胞以及B細胞的含量，防止GVHD現(xiàn)象以及EB病毒相關的惡性淋巴組織增生性疾病的產(chǎn)生[32]。

表2 常見CAR-NK構(gòu)建使用病毒載體特性

表3 NK細胞來源

（三）NK穩(wěn)定細胞系

相比于以上兩種NK細胞來源，NK細胞系的獲得更為方便快捷?，F(xiàn)有的NK細胞系有NK92，KHYG-1，NKL和YT等。其中NK92細胞系應用最為普遍。NK92細胞系是1992年從1例50歲的非霍奇金氏淋巴瘤男性患者體內(nèi)分離得到。該細胞系的生長呈IL-2依賴性[34]。NK92細胞系的表型為 CD56bright/CD16neg/low，低表達 CD3，CD8，高表達NKG2D活化受體以及天然細胞毒性受體：NKp30和NKp46[35]，以及一系列和細胞毒有關的分子如穿孔素以及顆粒酶B。NK92細胞系的表面缺乏KIR，因此該細胞系可以維持良好的活性。KHYG-1，NKL和YT等細胞系的CD16呈現(xiàn)低表達，是非常理想的治療效應細胞。

NK92細胞系對于血液腫瘤的殺傷效果已經(jīng)證實，相比于T細胞，NK細胞對實體瘤的殺傷效果也非常顯著，如黑色素瘤以及乳腺癌。而且發(fā)現(xiàn)其對健康的外周血單核細胞以及骨髓細胞沒有毒性作用[36]，關于NK92在臨床上的安全性評價也已經(jīng)開展（NCT00990717，NCT00900809，NCT02465957；https://clinicaltrials.gov）。但是，目前 NK92細胞系的體內(nèi)安全性尚未得到廣泛的認可，有學者擔心其在體內(nèi)的成瘤性。

三、CAR-NK的應用

目前為止，CAR-NK在臨床前的研究中對血液系統(tǒng)瘤以及實體瘤的治療中均表現(xiàn)出良好的效果。

（一） CAR-NK在血液瘤中的治療效果

近年來，CAR-T在血液病的治療中取得了不錯的成果。因此人們也首先將CAR-NK的著眼點放在了血液瘤。Romanski等[37]構(gòu)建的 NK-92-scFv（CD19）- CD3ζ可以增強對B細胞惡性腫瘤細胞的殺傷，并且可以克服NK細胞抑制現(xiàn)象。Boissel等[38]構(gòu)建的 CD19/ CD20―CAR- NK，注射入免疫缺陷小鼠創(chuàng)建的CLL病模中，腫瘤細胞得到了有效的清除起到了治療效果，而且進行改造的CAR-NK依然可以發(fā)揮ADCC的作用。這些成果都展現(xiàn)了CAR-NK的良好前景。

（二） CAR-NK在實體瘤中的治療效果

CAR-T細胞在抗擊實體腫瘤的過程中，由于自身程序性死亡受體（programmed cell death protein 1，PD-1）的表達以及腫瘤細胞表面PD-L1的表達，導致出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象。NK細胞表面PD-1表達很低，相對受腫瘤微環(huán)境免疫抑制小，也許是抗擊實體瘤的良好候選者。目前，CAR-NK對于實體瘤的治療逐漸展開。Han等［6］以CD28/CD3ζ為信號域融合EGFR抗原區(qū)構(gòu)建的CAR-NK92細胞系，在體內(nèi)外對膠質(zhì)瘤取得了較強的殺傷效果。并且另有研究發(fā)現(xiàn)ErBb2-CAR修飾的NK92細胞對HER2表達陽性的乳腺癌以及卵巢癌細胞系有較強的殺傷作用，在體內(nèi)也可以抑制腫瘤的生長[39]。用CD28/ CD3ζ融合CS1改造CAR-NK對于CS1+的MM細胞有很強的殺傷能力，并且在體外還能促進IFN-γ的分泌。CS1-CAR-改造的 NK-92細胞抑制 MM腫瘤生長，并且延長荷瘤小鼠的生存周期[5]。關于c-Met，F(xiàn)AB，GD2，WT1，PSMA，NY- ESO-1相關抗原改造的 CARNK也有報道，均表現(xiàn)出不錯的抗腫瘤效果。

（三）臨床應用

近年來，CAR-NK的臨床前研究進展明顯，但是在臨床實驗的研究進程中，則慢于CAR-T的研究。至今已經(jīng)開展多項NK的腫瘤細胞免疫治療，但是僅有兩項CAR-NK項目在臨床上開展。最早展開的是在孟菲斯的圣尤達兒童研究醫(yī)院，在這項研究中，于供體中分離得到NK細胞，將表達IL-15以及41BB的K562細胞輻照以后與NK細胞共培養(yǎng)（滋養(yǎng)層法），然后進行CD19-CAR的改造后回輸回患者體內(nèi)（ClinicalTrails.gov.NCT00995137）。另一項進入臨床階段的項目在新加坡國立大學醫(yī)院進行（ClinicalTrails.gov.NCT01974479），該項目用IL-2與供體NK細胞共培養(yǎng)進行擴增，進而進行CD19-CAR的改造，然后回輸給成年ALL患者進行治療。這兩項臨床研究，代表著CAR-NK項目的巨大進展，也預示著良好的前景。與CAR-T一樣，CAR-NK也率先在血液腫瘤上開展，對于實體瘤治療需要加快研究的腳步。同時，在將此療法推廣入臨床Ⅲ期前，對于質(zhì)量監(jiān)管的問題仍需要進一步的闡明規(guī)范。例如NK體外培養(yǎng)擴增階段的問題，盡管NK細胞的分離技術(shù)，擴增以及轉(zhuǎn)染等技術(shù)已經(jīng)較為熟知，但整個過程還處于科研級，臨床級研究較少。因此對CAR-NK副作用的評價；自體來源NK涉及到KIRs導致的失活問題；異體來源的NK純度問題導致的GVDH現(xiàn)象以及轉(zhuǎn)染過程中載體所引發(fā)的安全問題等仍需進一步的明確。

對于CAR-NK的上述總結(jié)，發(fā)現(xiàn)其與CAR-T項目相比，在許多方面的優(yōu)勢相對突出。對于上述各方面，筆者將兩種療法進行系統(tǒng)性的對比（表4）。

四、CAR-NK療法發(fā)展的挑戰(zhàn)與解決策略

近些年來對NK的細胞生物學，免疫學，以及記憶性NK細胞的研究和認識越來越深入[40-41]，而且對于NK細胞的免疫相關受體的信號通路等也有了新的研究[41]。越來越多的研究為NK細胞在免疫治療中的應用奠定了良好的基礎。在上文中對CAR-NK免疫療法進行了系統(tǒng)性的介紹，但是一些潛在的挑戰(zhàn)也仍需解決。

（一）脫靶效應

CAR-NK雖然是選取特異性強的抗原進行CAR的改造，但是也無法保證選取的抗原完全不在正常組織中表達。因此，理論上存在正常組織被CAR-NK攻擊的風險。 如在CAR-T療法的研究中，CD19-CAR-T在進行淋巴瘤的治療過程中，同時對CD19+的正常B細胞也會存在殺傷作用[42]。但目前為止關于CAR-NK的臨床研究較少，脫靶相關副作用的評價暫時未有報道，而且在相關動物實驗中，也沒有相關副作用的評價。

表4 CAR-T與CAR-NK比較

表5 NK細胞用于腫瘤治療臨床案例

在腫瘤發(fā)生的過程中，腫瘤細胞也會存在新的突變等，但是腫瘤細胞周圍的基質(zhì)細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關鍵性的作用，且基因表達穩(wěn)定，故選擇這類基質(zhì)細胞作為殺傷對象從而間接地對腫瘤產(chǎn)生影響，以應對腫瘤細胞基因的不穩(wěn)定突變可能是一種新的策略。

（二）關于轉(zhuǎn)染載體

對于CAR-NK免疫療法來講，轉(zhuǎn)染效率問題是最為重要的問題?，F(xiàn)在運用慢病毒以及逆轉(zhuǎn)錄病毒進行CAR- NK的修飾改造，在NK細胞系的轉(zhuǎn)染效率較高[43]，因此仍需努力對轉(zhuǎn)染載體進行積極的探索，進而提高轉(zhuǎn)染效率，將這些技術(shù)高效的運用于外周血來源的NK細胞改造中。伴隨著轉(zhuǎn)染的進行，一系列關于載體的風險也隨之而來。如病毒載體的容量問題，是否會引發(fā)機體的免疫反應等問題都需要在今后的臨床前以及臨床研究中進一步的評估。

（三）免疫因子風暴

眾所周知，CAR-T在研究中發(fā)現(xiàn)，T細胞通過大量的免疫因子來發(fā)揮抗腫瘤效果，因而免疫風暴是影響其發(fā)展的制約因素之一。盡管NK細胞在激活過程中不分泌IL-6，且參與的免疫因子較少，但是在活化過程中也會分泌大量的IFN-γ和腫瘤壞死因子等。因此，CAR-NK細胞治療的免疫因子風暴問題也需重視。在臨床運用過程中，應當注意細胞制劑的使用量，亦或通過配合使用藥物來避免免疫風暴的發(fā)生。另外，吸取CAR-T細胞設計的經(jīng)驗，在CAR-NK細胞中加裝安全開關也是一個流行的趨勢。

2016年Roybal等[44]在CAR-T系統(tǒng)中引入人為改造的Notch系統(tǒng)，人為影響細胞的凋亡。這些方法都可以提示對NK細胞進行相關改造避免類似不良反應發(fā)生。

（四）改造所需的NK細胞相關問題

由于NK細胞自身的構(gòu)造等原因，現(xiàn)有關于NK細胞的臨床研究中發(fā)現(xiàn)自體或者異體的NK細胞直接用于腫瘤治療的效果不明顯。如表5所示，總結(jié)幾例用于臨床的NK細胞項目進行對比。這些腫瘤治療對象包含了實體瘤以及血液瘤。在這些治療過程中，可以發(fā)現(xiàn)NK細胞系的治療效果以及安全性相對優(yōu)于原代NK細胞。這可能是因為病患自身的NK細胞殺傷性受到抑制，導致免疫逃逸現(xiàn)象的發(fā)生。鑒于此，異體NK細胞會是更好的CAR-NK細胞來源。但異體外周血來源則會由于NK細胞純度問題存在著GVDH風險。

目前，對于開發(fā)細胞治療藥物來講，NK92細胞系是較優(yōu)的選擇，既保持細胞毒作用，并且擴增簡便、縮短治療周期，同時也降低了成本。但是這種永生化細胞系的安全性仍需進一步探索[45]。按照目前國家對于細胞免疫治療按藥物管理的原則，CAR-NK作為細胞藥物，其生產(chǎn)、運輸也將是需要面臨的重要產(chǎn)業(yè)化問題。

隨著CAR技術(shù)的不斷進展，為腫瘤免疫治療打開了一扇新大門。這種技術(shù)可以促使腫瘤免疫治療更加個體化和特異化，使得治療更加精準。目前，CAR-T技術(shù)已經(jīng)廣泛用于腫瘤治療。在免疫系統(tǒng)中NK細胞抗腫瘤能力以及臨床應用的潛力強于T細胞，所以CAR在NK細胞上的應用在理論上是可行的，且有足夠的臨床前研究支持這樣的方案。目前CAR-T療法在血液腫瘤的治療中展現(xiàn)出卓越的效果，但對實體瘤的作用不盡人意。相比T細胞殺傷腫瘤細胞的機制，NK細胞具備更多殺傷腫瘤細胞的途徑，因此在實體瘤的應用方面有更好的預期。在CAR-NK的研發(fā)中，應當努力突破實體瘤治療的難關。NK細胞來源廣泛，最大的優(yōu)點是有成熟的細胞系，如NK92，可以彌補患者自身免疫細胞弱化的缺點，還可以提高治療的通用性，更適合作為細胞藥物進行開發(fā)。CAR-NK免疫療法的周期更快，可以改變免疫細胞療法的繁雜現(xiàn)象即“off-the-shelf”概念。這一系列的優(yōu)勢更利于CAR-NK療法的工業(yè)化生產(chǎn)，質(zhì)量控制更加有保證，為其成藥性提供了巨大的可能性。