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    轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測技術(shù)研究進展

    2018-03-31 14:59:50王顥潛陳銳李夏瑩王夢雨劉鵬程
    生物技術(shù)通報 2018年3期
    關(guān)鍵詞:外源轉(zhuǎn)基因靈敏度

    王顥潛 陳銳 李夏瑩 王夢雨 劉鵬程

    (1. 農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心,北京 100176;2. 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所,天津 300192;3. 中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院,北京 100193)

    轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應用與發(fā)展十分迅猛,已成為世界各國農(nóng)業(yè)科技競爭的焦點。據(jù)統(tǒng)計,在轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化21 年間(從1996-2016年),全球轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植面積持續(xù)增長,累計達到了21 億hm2,這使轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)成為近年來應用最為迅速的作物技術(shù)[1]。轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)給人類帶來了巨大經(jīng)濟效益的同時也引發(fā)了社會關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物安全性問題的爭議,鑒于食用安全長期效應無法確證等問題,當前的研究成果尚不能對轉(zhuǎn)基因安全給出準確、全面的結(jié)論。為加強對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理,世界各國都在積極完善和落實相應的法律法規(guī)。但是,目前不同國家和地區(qū)的轉(zhuǎn)基因法律法規(guī)、標識制度、閾值范圍和管理方式上存在較大差異,對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的進出口檢驗、國際貿(mào)易互認等方面造成了較大的影。由此可見,轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的需求是一直存在的,并隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)應用的快速發(fā)展顯得尤為迫切。開發(fā)便捷、高效的轉(zhuǎn)基因檢測方法,尤其是精準的定量檢測技術(shù),建立相應的檢測技術(shù)體系對促進轉(zhuǎn)基因農(nóng)業(yè)發(fā)展、保護我國農(nóng)產(chǎn)品進出口貿(mào)易利益、滿足轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管需求以及完善轉(zhuǎn)基因標識管理制度等方面意義重大。目前國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術(shù)根據(jù)檢測原理的分為兩類,即基于外源核酸的檢測技術(shù)和基于外源蛋白的檢測技術(shù)。本文就轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測技術(shù)的原理、優(yōu)缺點、研究進展和發(fā)展方向做一簡要概述,旨在促進我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測技術(shù)更好地適應當前轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域的發(fā)展和滿足轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的需求。

    1 基于外源核酸的檢測技術(shù)

    核酸是絕大多數(shù)生命體的遺傳物質(zhì),具有較高的穩(wěn)定性和普遍性,因此以脫氧核糖核酸(DNA)為靶標的檢測技術(shù)是目前最成熟、應用最廣泛的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測技術(shù)[2]。根據(jù)外源DNA片段序列特征和插入位置的不同,核酸檢測可以對篩選元件特異性、基因特異性、載體構(gòu)建特異性和轉(zhuǎn)化事件特異性四個方面進行檢測[3-5]?;谕庠春怂岬霓D(zhuǎn)基因檢測技術(shù)主要有:定性PCR技術(shù)、定量PCR技術(shù)、等溫擴增技術(shù)和基因芯片技術(shù)等。

    1.1 定性PCR技術(shù)

    定性PCR也稱為普通PCR(Conventional PCR),是一種基于聚合酶鏈式反應的檢測技術(shù),是目前應用于轉(zhuǎn)基因檢測最廣泛的方法[6]。此法不受材料加工程度的影響,可以對種子到終產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分進行定性檢測,且靈敏度高、操作簡便,成為許多國家用于市場篩查轉(zhuǎn)基因成分的首選方法,如巴西[7]、科威特[8]、伊朗[9]、沙特阿拉伯[10]、約旦[11]、塞爾維亞[12]及敘利亞[13]等國家。

    普通PCR單次反應只能檢測特定靶序列,無法滿足大量、快速的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測需求。以常規(guī)PCR方法為基礎改進PCR方法也得到了廣泛的應用。例如,多重PCR(Multiplex PCR)在檢測通量和成本控制方面具備優(yōu)勢,近年來也被廣泛關(guān)注和深入研究。Datukishvili等[14]針對轉(zhuǎn)基因大豆開發(fā)了4重PCR體系,能夠同時檢測CaMV35S 啟動子、NOS終止子、epsps基因與大豆內(nèi)源基因lectin,還開發(fā)了轉(zhuǎn)基因玉米3重PCR體系,能夠同時檢測啟動子、cry1Ab基因和玉米內(nèi)源基因zein,該方法特異性良好,并且靈敏度均能達到0.1%;Harikai等[15]結(jié)合多重PCR與引物延伸的方法,將生物素標記的核酸 dUTP混入到引物延伸產(chǎn)物中,可直接光學檢測8重PCR擴增產(chǎn)物,檢測時間短,靈敏度可達1%;Mano等[16]將多重PCR與多重連接酶擴增反應(Multiplex ligase chain reaction,LCR)偶聯(lián),針對7個轉(zhuǎn)基因元件和3個內(nèi)源基因開發(fā)出了高效的多重轉(zhuǎn)基因檢測方法;Patwardhan等[17]開發(fā)了多重PCR-毛細管電泳方法可同時檢測轉(zhuǎn)基因棉花MON531、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯EH 92-527-1、轉(zhuǎn)基因玉米Bt176、轉(zhuǎn)基因玉米GA21和轉(zhuǎn)基因油菜GT73 canola,檢測低限為0.1%。

    對于普通PCR靈敏度不高,對含量低、成分復雜和被嚴重破壞的DNA樣品難以準確檢測的缺點,在普通PCR的基礎上開發(fā)出了巢式PCR(Nested PCR)和半巢式PCR(Semi-Nested PCR)技術(shù)。該技術(shù)的原理是在擴增產(chǎn)物的片段上引入新的引物,通過二次擴增反應對某段序列進行檢測,以提高檢測的準確度和靈敏性。敖金霞等[18]建立了適用于轉(zhuǎn)基因大豆、玉米及水稻深加工產(chǎn)品的五重巢式PCR 技術(shù),檢測靈敏度為0.005%;閆偉等[19]建立的單管巢式和半巢式PCR方法可準確、高效地檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON89034及其產(chǎn)品,此方法的相對檢出限達到0.01%,絕對檢出限為4個單倍體基因組拷貝數(shù),比普通PCR提高了5倍。

    隨著定性PCR技術(shù)的發(fā)展,熱不對稱交錯PCR、連接介導PCR和反向PCR在轉(zhuǎn)基因分子鑒定和單鏈DNA制備等方面開始廣泛應用[20-21]。

    1.2 定量PCR技術(shù)

    目前,越來越多的國家通過設定閾值對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行標識管理,轉(zhuǎn)基因成分含量超過設定閾值的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品必須強制性標識,如歐盟為0.9%,澳大利亞、巴西為1%,馬來西亞、韓國為3%,日本、中國臺灣為5%[22-23]。隨著世界各國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識制度的發(fā)展和完善,應用定量PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行定量標識將越來越廣泛[24]。定量PCR技術(shù)主要有競爭性定量PCR技術(shù)(Competitive quantitative PCR,QC-PCR)、實時定量 PCR技術(shù)(Real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR) 和數(shù)字PCR技術(shù)(Digital PCR,dPCR)3種。

    1.2.1 競爭性定量PCR技術(shù) 競爭性定量PCR通過向PCR反應體系中加入與目標DNA具有相同擴增效率和引物結(jié)合位點的競爭模板,同時以不同稀釋梯度的競爭模板建立標準曲線,從而計算目標DNA的含量[2,23]。Garcíaca?as等[25]將 QC-PCR 方法與毛細管電泳激光誘導熒光技術(shù)巧妙結(jié)合,實現(xiàn)了玉米Bt176品系的定量檢測;Mavropoulou等[26]研究證明QC-PCR比實時定量PCR靈敏度高且探針價格低廉。QC-PCR技術(shù)的難點在于競爭模板的設計。

    1.2.2 實時定量PCR技術(shù) 實時定量PCR通過熒光標記實時監(jiān)控目的片段的擴增,根據(jù)待測物起始濃度與Ct(Threshold Cycle)值線性相關(guān)的原理,從而實現(xiàn)靶標基因的精確定量,已廣泛應用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測[27]。qPCR試驗中,選擇恰當?shù)膬?nèi)源基因并驗證特異引物是定量檢測的關(guān)鍵因素[28]。目前,qPCR檢測技術(shù)已被廣泛應用于大豆[29]、玉米[30]、水稻[31]、菜豆[32]、棉花[33]、茄子[5]、木瓜[34]和釀酒酵母[35]的轉(zhuǎn)基因成分檢測,具備良好的特異性和較高的靈敏度。隨著規(guī)模化和快速化轉(zhuǎn)基因檢測的需求,多重qPCR技術(shù)得到了發(fā)展。D?rries等[36]針 對 P-35S、T-NOS、bar和 FMV35S設計了多重定量PCR預混液,檢測低限均能達到10個拷貝,并且在41個非轉(zhuǎn)基因植物中驗證其特異性良好;Li等[37]設計了四重定量PCR可同時檢測轉(zhuǎn)基因棉花GHB119 的T304-40的事件特異性與外源基因Cry2Ae,檢出限為10個拷貝,定量限為20-25個拷貝。qPCR具有操作簡便、靈敏度高,但成本較高,存在重現(xiàn)性較差的問題。

    1.2.3 數(shù)字PCR技術(shù) 數(shù)字PCR是一種基于泊松分布原理的針對單分子目標DNA的絕對定量技術(shù)[38]。相對qPCR技術(shù),dPCR不需要對每個循環(huán)進行實時熒光測定,也不需要Ct值來定量靶標。dPCR通過將反應試劑平均分配到幾萬至上千萬個單元中,從而使靶標DNA稀釋到單分子水平。擴增結(jié)束后,通過直接計數(shù)或泊松分布計算得到樣品的原始拷貝數(shù),因此其不受擴增效率的影響,也不必使用內(nèi)參基因和標準曲線,具有極高的準確度和重現(xiàn)性。目前,dPCR 已應用于轉(zhuǎn)基因玉米[39]、水稻[40]、大豆[41]及深加工產(chǎn)品[42]中的定量檢測中。

    當前的dPCR技術(shù)平臺主要有兩種,一種是基于固態(tài)平臺開發(fā)的芯片式數(shù)字PCR技術(shù),由Fluidigm公司基于集成流體通路(IFC)芯片與Life Technologies的OpenArray為代表;另一種是基于液體微滴的數(shù)字PCR技術(shù),由Bio-Rad公司和RainDance公司產(chǎn)品為代表。Li等[43]基于Fluidigm公司開發(fā)的動態(tài)芯片技術(shù)建立了高通量數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因檢測方法,可同時檢測48個樣本中的48個靶標基因,包括7個轉(zhuǎn)基因元件、36個事件特異性基因和5個內(nèi)源基因,為克服基因組DNA上樣拷貝數(shù)稀少的問題,該研究還利用8-14個循環(huán)的預擴增來優(yōu)化檢測方法,最終的檢測低限為0.05 ng。

    dPCR特異性強、準確度高,常用來確定轉(zhuǎn)基因標準物質(zhì)的量值。Corbisier等[44]利用dPCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因玉米MON810的標準物質(zhì)進行拷貝數(shù)測定,結(jié)果表明dPCR相對qPCR在絕對定量方面具備優(yōu)勢,可用于標準物質(zhì)的校正;Liang等[45]利用Fluidigm平臺對轉(zhuǎn)基因水稻kefeng6的質(zhì)粒參考物質(zhì)進行檢測,同樣證實數(shù)字PCR可用于轉(zhuǎn)基因標準物質(zhì)的拷貝數(shù)驗證。目前,美國國家標準與技術(shù)研究 院(National Institute of Standards and Technology,NIST)已開發(fā)出全球首例由dPCR校準的DNA標準物質(zhì),可用于人類巨細胞病毒的溯源和檢測結(jié)果比對[46]。

    最新的研究表明,dPCR技術(shù)還是檢驗外源插入基因拷貝數(shù)和純合性的有效方法。Glowacka等[47]在轉(zhuǎn)基因煙草中比較了Southern blot、熱不對稱交錯PCR、定量PCR和數(shù)字PCR等方法,用于分析插入的T-DNA拷貝數(shù)、位點復雜性和純合性,結(jié)果表明dPCR與Southern blot結(jié)果一樣可靠,并且在試驗操作上更加快速和便捷。雖然目前來看dPCR技術(shù)存在成本昂貴等缺陷,但其絕對定量的屬性在轉(zhuǎn)基因檢測中有著廣闊前景。

    1.3 等溫擴增技術(shù)

    等溫擴增技術(shù)是指在一個恒定溫度下,通過不同活性的酶和各種特異性引物來實現(xiàn)DNA擴增的方法,相對于PCR擴增技術(shù)具有快速、高效、特異的優(yōu)點且無需專用設備,在臨床和現(xiàn)場快速診斷中應用廣泛。主要方法有:環(huán)介導等溫擴增(LAMP)、滾環(huán)核酸擴增(RCA)、核酸序列依賴性擴增(NASBA)、鏈替代擴增(SDA)和解鏈酶擴增(HAD)[48]等。

    在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域最常用的主要是LAMP技術(shù),它是由Notomi等發(fā)明的一種等溫核酸擴增技術(shù)[49]?;驹硎轻槍δ繕薉NA的6個不同區(qū)域設計4條不同的引物,依賴鏈置換DNA聚合酶,在恒溫下進行擴增反應,循環(huán)不斷地產(chǎn)生不同長度的DNA片段,反應結(jié)果可通過凝膠電泳、焦磷酸鎂沉淀、實時比濁法、特定熒光染料等來判斷[24,48];周杰等[50]建立了DAS-81419-2、FG72等6種轉(zhuǎn)基因大豆的LAMP檢測方法;Chen等[51]開發(fā)的針對轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1的事件特異性檢測方法中,將鈣黃綠素和錳離子添加至LAMP體系中,可實現(xiàn)一步可視化檢測,方法靈敏度達10-20個拷貝。

    最近的研究顯示,將LAMP技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合是轉(zhuǎn)基因檢測的發(fā)展趨勢。Cheng等[52]將LAMP與DNA酶橫向流動檢測試紙條技術(shù)結(jié)合,用于檢測復合性狀轉(zhuǎn)基因大豆DP305423×GTS 40-3-2,該方法具備良好的靈敏度和特異性;Shao等[53]開發(fā)了特殊的毛細管柱裝置,將LAMP特異引物固定于毛細管壁的內(nèi)壁后,一次上樣并恒溫擴增后,可直接可視化檢測10個靶標基因的擴增結(jié)果,該方法操作簡便、通量高,可用于田間快檢和大規(guī)模轉(zhuǎn)基因篩查工作;Morisset等[54]將NASBA技術(shù)與芯片技術(shù)相結(jié)合,開發(fā)了多重轉(zhuǎn)基因檢測芯片,該方法的特異性與靈敏度與qPCR方法相當,定量檢測的線性范圍為0.1%-25%,是非常有潛力的高通量檢測方法。LAMP技術(shù)對設備要求低,具有直觀、高效的特點,已經(jīng)成為出入境檢驗檢疫等行業(yè)標準轉(zhuǎn)基因成分檢測的一種指定方法,未來仍需克服假陽性較高、引物設計要求高等不足。

    1.4 基因芯片技術(shù)

    基因芯片技術(shù)(Gene chip)是基于核酸雜交的一項高通量檢測技術(shù),利用固體在基質(zhì)表面的上千個特定探針與標記的樣品進行雜交,通過分析雜交信號,能夠一次性準確地對樣品中不同種類的DNA序列進行定性、定量的篩查,已被廣泛應用于轉(zhuǎn)基因檢測等許多領(lǐng)域。Tengs等[55]設計了包含約4萬個探針的Tilling芯片,涵蓋絕大多數(shù)植物轉(zhuǎn)化用的載體序列,可用于篩查未知轉(zhuǎn)化事件;Turkec等[56]對3個轉(zhuǎn)基因大豆和9個轉(zhuǎn)基因玉米開發(fā)檢測芯片,篩選出33個探針可用于區(qū)分12個GMO事件,并開發(fā)了一套數(shù)據(jù)算法來實現(xiàn)最大的檢測通量和靈敏度?;蛐酒夹g(shù)滿足當前轉(zhuǎn)基因高通量、自動化檢測的需求,但由于其成本較高、芯片合成復雜、背景干擾嚴重等不足,一定程度影響了該技術(shù)的廣泛應用。

    2 基于外源蛋白的檢測技術(shù)

    基于外源蛋白的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)是以免疫分析技術(shù)為基礎的對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的外源表達蛋白進行定性和定量檢測的一種技術(shù)。常見的方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、Western blot 檢測技術(shù)和試紙條技術(shù)等。

    2.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

    酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)通過抗原和抗體的可視免疫反應來檢測和鑒定目標蛋白,主要包括雙抗夾心法、直接法、間接法,其中靈敏度最高的雙抗夾心法應用最為廣泛[57]。Guertler等[58]利用雙抗體夾心ELISA檢測法實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Cry1Ab蛋白的檢測,最低檢測限為0.4 ng/mL,特異性高于實時熒光PCR方法。目前,我國對已獲生產(chǎn)應用安全證書的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的衍生品系進行安全評價檢測時,采用ELISA檢測技術(shù)對抗蟲棉不同組織部位中Bt蛋白的表達量進行檢測,從而對抗蟲棉品種的抗性能力進行科學評價。新近發(fā)展起來的PCR- ELISA技術(shù),結(jié)合了PCR方法的高效性和ELISA方法的高特異性,在轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域中極具潛力。利用PCR-ELISA方法檢測轉(zhuǎn)基因大豆的靈敏度比歐盟用的PCR方法高5-10倍,而且有效的避免了假陽性現(xiàn)象的產(chǎn)生[59]。

    2.2 Western blot檢測技術(shù)

    Western blot檢測技術(shù)本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移電泳技術(shù),其原理是將聚丙烯酰胺凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,利用抗體反應和顯色酶反應實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中外源蛋白的有效檢測。Wang等[60]利用Western blot 技術(shù)檢測到了轉(zhuǎn)基因煙草外源EPSPS 蛋白的表達;Yates等[61]利用Western blot技術(shù)對轉(zhuǎn)基因種子的檢出限能達到0.25%,深加工產(chǎn)品可達到1%,靈敏度較高。雖然Western blot技術(shù)操作較為繁瑣,也無法滿足快速高效檢測需求,但其可以有效地檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的不可溶蛋白。

    2.3 試紙條技術(shù)

    試紙條技術(shù)是基于免疫層析的一種快速檢測技術(shù),較之ELISA 法更為簡便、快速,可在5-10 min的時間內(nèi)現(xiàn)場觀測結(jié)果,在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品大規(guī)??焖俸Y查檢測中應用廣泛。許多公司針對不同轉(zhuǎn)基因植物中特異表達的外源蛋白,開發(fā)出大量特異的免疫層析試紙條,如檢測孟山都公司轉(zhuǎn)基因Roundup Ready大豆和油菜中CP4-EPSPS蛋白的試紙條、Starlink玉米中Cry9c蛋白的試紙條等[62]。中國農(nóng)科院油料所研制的Cry1Ab/Cry1Ac試紙條,成本為進口產(chǎn)品的40%,靈敏度等性能參數(shù)與進口試紙條相當,是農(nóng)業(yè)部推薦使用的產(chǎn)品之一。由于試紙條技術(shù)具備操作簡便快速、特異性強、成本低廉等優(yōu)點,其發(fā)展和應用較為迅速。Santos等[63]研發(fā)了一種可以同時檢測Cry1Ac和Cry8Ka5殺蟲蛋白的試紙條,檢出限為0.06 μg,可以很好地區(qū)分抗蟲轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物;Mutoni等[64]用PCR法和試紙條對肯尼亞市場上的120份玉米樣品進行轉(zhuǎn)基因檢測,兩種方法結(jié)果一致;張欣等[65]采用試紙條法檢測水稻樣品,結(jié)果準確,測試時間短于qPCR法,適用于水稻及其產(chǎn)品的現(xiàn)場檢測和大規(guī)模初篩;張裕君等[66]將PCR技術(shù)與試紙條技術(shù)相結(jié)合建立了一種可視化檢測轉(zhuǎn)基因黑曲霉的方法,該方法比傳統(tǒng)凝膠電泳法快捷且靈敏度高出10倍以上。隨著試紙條技術(shù)不斷完善,克服假陰性、假陽性和背景色較重的問題,提升靈敏度和實現(xiàn)多元檢測,試紙條在轉(zhuǎn)基因檢測中將發(fā)揮更重要的作用。

    3 展望

    綜上所述,基于外源核酸的檢測技術(shù)準確性高、穩(wěn)定性好、操作簡便,但轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的多糖、蛋白等雜質(zhì)會對檢測結(jié)果產(chǎn)生一定的干擾,而且DNA的提取質(zhì)量對結(jié)果影響較大;基于外源蛋白的檢測技術(shù)靈敏度高、結(jié)果可靠、重復性好,但受后期加工環(huán)節(jié)的影響,而且外源蛋白在不同部位和不同時期的不同表達量會對檢測結(jié)果造成影響。在實際檢測過程中,并非任何一種檢測方法對某種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測都行之有效,每種方法都有其優(yōu)缺點和適用范圍,選擇檢測方法時應根據(jù)檢測的需要并結(jié)合轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的類型和特點,選擇最有效的方法或技術(shù)組合[67]。隨著商業(yè)化轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物品系的快速增長,以及轉(zhuǎn)基因生物安全評價與監(jiān)管需求,轉(zhuǎn)基因檢測日趨多樣化、復雜化。除以上介紹的方法之外,電化學發(fā)光分析技術(shù)、色譜技術(shù)、近紅外光譜檢測技術(shù)、生物傳感器技術(shù)、生物分子互作技術(shù)以及基于一些成熟技術(shù)建立起來的試劑盒技術(shù)、內(nèi)標基因種屬特異性檢測技術(shù)等在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的實際檢測中都有所應用。

    隨著基因編輯和RNAi等轉(zhuǎn)基因新技術(shù)的應用與推廣,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品呈現(xiàn)出多樣化發(fā)展的趨勢。加之當前可用的轉(zhuǎn)基因分子特征信息十分有限,相關(guān)數(shù)據(jù)庫也并不完善,現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)體系正面臨著巨大挑戰(zhàn)。建立快速、精準、低成本、高通量的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)與方法已成當務之急。通過轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項科技項目的實施,我國轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)發(fā)展將越來越快。大力發(fā)展符合國情的、科學可靠的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù),掌握核心技術(shù),搶占領(lǐng)域高地,不僅關(guān)乎國家利益,而且對推動轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)發(fā)展及維護環(huán)境和食品安全方面都具有十分重要的意義。

    [1] James C. 2016年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J]. 中國生物工程雜志, 2017, 37(4):1-8.

    [2] 蔡軍, 李慧, 胡夢龍, 等. 轉(zhuǎn)基因成分分析檢測技術(shù)研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報, 2016, 7(2):706-714.

    [3] Jiang L, Yang L, Rao J, et al. Development and in-house validation of the event-specific qualitative and quantitative PCR detection methods for genetically modified cotton MON15985[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2010, 90(3):402-408.

    [4]Wu Y, Wang Y, Li J, et al. Development of a general method for detection and quantification of the P35S promoter based on assessment of existing methods[J]. Scientific Reports, 2014, 4(2):7358.

    [5]Ballari RV, Martin A, Gowda LR. Detection and identification of genetically modified EE-1 brinjal(Solanum melongena)by single,multiplex and SYBR? realtime PCR[J]. Journal of the science of food and agriculture. 2013, 93(2):340-347.

    [6]Querci M, Bulcke MVD, ZEl J, et al. New approaches in GMO detection[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2010, 396(6):1991-2002.

    [7]Oliveira CA, Kommers CM, Lehmann FK, et al. Detection of genetically modified maize in processed products, dry grains, and corn ears intended for fresh consumption in South Brazil[J].Genetics & Molecular Research, 2016, 15(4):8818-8827.

    [8]Alsalameen F, Kumar V, Alaqeel H, et al. Detection of genetically modified DNA in fresh and processed foods sold in Kuwait[J].Gm Crops & Food, 2012, 3(4):283.

    [9]Rabiei M, Mehdizadeh M, Rastegar H, et al. Detection of genetically modified maize in processed foods sold commercially in iran by qualitative PCR[J]. Iranian Journal of Pharmaceutical Research,2013, 12(1):25-30.

    [10]Elsanhoty RM, Al-Turki A, Ramadan MF. Prevalence of genetically modified rice, maize, and soy in Saudi food products[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology. 2013, 171(4):883-899.

    [11] Alhmoud N, Alhusseini N, Ibrahimalobaide MA, et al. Unconventional P-35Ssequence identified in genetically modified maize[J].Gm Crops Food, 2014, 5(1):58.

    [12]Nikoli? Z, Vasiljevi? I, Zdjelar G, et al. Detection of genetically modified soybean in crude soybean oil[J]. Food Chemistry,2014, 145(7):1072-1075.

    [13]Alasaad N, Alzubi H, Kader AA. Data in support of the detection of genetically modified organisms(GMOs)in food and feed samples[J]. Data in Brief, 2016, 7 :243-252.

    [14]Datukishvili N, Kutateladze T, Gabriadze I, et al. New multiplex PCR methods for rapid screening of genetically modified organisms in foods[J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6(6):757.

    [15]Harikai N, Saito S, Abe M, et al. Optical detection of specific genes for genetically modified soybean and maize using multiplex PCR coupled with primer extension on a plastic plate[J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry, 2009, 73(8):1886-1889.

    [16]Mano J, Oguchi T, Akiyama H, et al. Simultaneous detection of recombinant DNA segments introduced into genetically modified crops with multiplex ligase chain reaction coupled with multiplex polymerase chain reaction[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2009, 57(7):2640-2646.

    [17]Patwardhan S, Dasari S, Bhagavatula K, et al. Simultaneous detection of genetically modified organisms in a mixture by multiplex PCR-chip capillary electrophoresis[J]. Journal of AOAC International, 2015, 98(5):1366-1374.

    [18]敖金霞, 高學軍, 于艷波, 等. 轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻深加工產(chǎn)品的五重巢式PCR技術(shù)檢測[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報,2010, 15(2):93-99.

    [19]閆偉, 李蔥蔥, 夏蔚, 等. 應用單管巢式和半巢式PCR檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON89034[J]. 玉米科學, 2016(4):56-60.

    [20]Yang L, Xu S, Pan A, et al. Event specific qualitative and quantitative polymerase chain reaction detection of genetically modified MON863 maize based on the 5’-transgene integration sequence[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2005,53(24):9312-9318.

    [21]Holck A, Va?tilingom M, Didierjean L, et al. 5'-Nuclease PCR for quantitative event-specific detection of the genetically modified Mon810 MaisGard maize[J]. European Food Research &Technology, 2002, 214(5):449-454.

    [22]金蕪軍, 賈士榮, 彭于發(fā). 不同國家和地區(qū)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標識管理政策的比較[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報, 2004(1):1-7.

    [23]杜智欣, 焦悅, 張亮亮, 等. 轉(zhuǎn)基因成分定量檢測技術(shù)研究進展[J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(10):379-384.

    [24]鄧漢超, 尹長城, 劉國振, 等. 轉(zhuǎn)基因植物核酸成分檢測技術(shù)研究進展[J]. 中國生物工程雜志, 2011, 31(1):86-95.

    [25]Garcíaca?as V, Cifuentes A, González R. Quantitation of transgenic Bt event-176 maize using double quantitative competitive polymerase chain reaction and capillary gel electrophoresis laserinduced fluorescence[J]. Analytical Chemistry, 2004, 76(8):2306-2313.

    [26]Mavropoulou AK, Theodora K, Ioannou PC, et al. High-throughput double quantitative competitive polymerase chain reaction for determination of genetically modified organisms[J]. Anal Chem,2005, 77(15):4785-4791.

    [27]陳銳, 朱珠, 蘭青闊, 等. 轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)與標準物質(zhì)研究概述[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學, 2014, 20(3):10-14.

    [28]Venturelli GL, Brod FC, Rossi GB, et al. A specific endogenous reference for genetically modified common bean(Phaseolus vulgarisL.)DNA quantification by real-time PCR targeting lectin gene[J]. Molecular Biotechnology, 2014, 56(11):1060-1068.

    [29]Xiao X, Wu H, Zhou X, et al. The combination of quantitative PCR and western blot detecting CP4-EPSPS component in roundup ready soy plant tissues and commercial soy-related foodstuffs[J].Journal of Food Science, 2012, 77(6):C603-C608.

    [30]宋君, 郭靈安, 雷紹榮, 等. 實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因玉米59122的方法建立及測量不確定度評估[J]. 食品科學,2014, 35(24):259-264.

    [31]張麗, 劉麗麗, 梁曉聲, 等. 實時定量PC R鑒定轉(zhuǎn)基因作物純合[J]. 中南民族大學學報:自然科學版, 2015, (1):43-46.

    [32]Treml D, Venturelli GL, Brod FbC, et al. Development of an eventspecific hydrolysis probe quantitative real-time polymerase chain reaction assay for Embrapa 5. 1 genetically modified common bean(Phaseolus vulgaris)[J]. J Agric Food Chem, 2014, 62(49):11994-12000.

    [33]Randhawa GJ, Chhabra R, Singh M. Decaplex and real-time PCR based detection of MON531 and MON15985 Bt cotton events[J].J Agric Food Chem, 2010, 58(18):9875-9881.

    [34]Madhugiri NR, Charles K, Sujata A, et al. Sensitivity of a realtime PCR method for the detection of transgenes in a mixture of transgenic and non-transgenic seeds of papaya(Carica papayaL.)[J]. BMC Biotechnology, 2013, 13(1):69.

    [35]Vaudano E, Costantini A, Garcia-Moruno E. An event-specific method for the detection and quantification of ML01, a genetically modifiedSaccharomyces cerevisiaewine strain, using quantitative PCR[J]. International Journal of Food Microbiology, 2016, 234:15-23.

    [36]D?rries HH, Remus I, Gr?newald A, et al. Development of a qualitative, multiplex real-time PCR kit for screening of genetically modified organisms(GMOs)[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2010, 396(6):2043-2054.

    [37]Li X, Wang X, Yang J, et al. A novel quadruplex real-time PCR method for simultaneous detection ofCry2Aeand two genetically modified cotton events(GHB119 and T304-40)[J]. BMC Biotechnology, 2014, 14(1):43.

    [38]李亮, 隋志偉, 王晶, 等. 基于數(shù)字PCR的單分子DNA定量技術(shù)研究進展[J]. 生物化學與生物物理進展, 2012, 39(10):1017-1023.

    [39] Dobnik D, Spilsberg B, Bogo?alec KA, et al. Multiplex quantification of 12 European Union authorized genetically modified maize lines with droplet digital polymerase chain reaction[J]. Analytical Chemistry, 2015, 87(16):8218-8226.

    [40]任怡菲, 高琴, 鄧婷婷, 等. 基于數(shù)字PCR的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系精準定量檢測方法建立[J]. 生物技術(shù)通報, 2016,32(8):69-76.

    [41]于曉帆, 高宏偉, 孫敏, 等. 熒光PCR和數(shù)字PCR法檢測轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6品系大豆[J]. 食品科學, 2016, 37(16):235-241.

    [42]Baker M. Digital PCR hits its stride[J]. Nature Methods, 2012, 9(6):541-544.

    [43] Li X, Wu Y, Li J, et al. Development and validation of a 48-target analytical method for high-throughput monitoring of genetically modified organisms[J]. Scientific Reports, 2015, 5 :7616.

    [44] Corbisier P, Bhat S, Partis L, et al. Absolute quantification of genetically modified MON810 maize(Zea maysL.)by digital polymerase chain reaction[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010, 396(6):2143-2150.

    [45] Liang L, Zhang X, Wan Y, et al. Development of a novel reference plasmid for accurate quantification of genetically modified kefeng6 rice DNA in food and feed samples[J]. BioMed Research International, 2013, 2013(10):134675.

    [46]Bhat S, Emslie KR. Digital polymerase chain reaction for characterisation of DNA reference materials[J]. Biomol Detect Quantif, 2016, 10:47-49.

    [47]Gtowacka K, Kromdijk J, Leonelli L, et al. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants[J]. Plant Cell & Environment,2016, 39(4):908.

    [48] 徐潮. 重組酶介導的等溫擴增技術(shù)在轉(zhuǎn)基因檢測中的應用[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學院, 2014.

    [49]Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research.2000, 28(12):e63-e63.

    [50]周杰, 黃文勝, 鄧婷婷, 等. 環(huán)介導等溫擴增法檢測6種轉(zhuǎn)基因大豆[J/OL]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報, 2017, 25(2):335-344.

    [51]Chen R, Wang Y, Zhu Z, et al. Development of the one-step visual loop-mediated isothermal amplification assay for genetically modified rice event TT51-1[J]. Food Science and Technology Research, 2014, 20(1):71-77.

    [52]Cheng N, Shang Y, Xu Y, et al. On-site detection of stacked genetically modified soybean based on event-specific TM-LAMP and a DNAzyme-lateral flow biosensor[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2017, 91:408-416.

    [53]Shao N, Chen J, Hu J, et al. Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array[J]. Lab on A Chip,2017, 17(3):521-529.

    [54] Morisset D, Dobnik D, Hamels S, et al. NAIMA :target amplification strategy allowing quantitative on-chip detection of GMOs[J]. Nucleic Acids Research, 2008, 36(18):e118-e118.

    [55]Tengs T, Kristoffersen AB, Berdal KG, et al. Microarray-based method for detection of unknown genetic modifications[J]. BMC Biotechnology, 2007, 7(1):91.

    [56]Turkec A, Lucas SJ, Karacanli B, et al. Assessment of a direct hybridization microarray strategy for comprehensive monitoring of genetically modified organisms(GMOs)[J]. Food Chemistry,2016, 194:399-409.

    [57]邵碧英, 陳文炳, 李壽崧, 等. 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法建立的基礎及應用[J]. 檢驗檢疫科學, 2002(3):14-19.

    [58]Guertler P, Paul V, Albrecht C, et al. Sensitive and highly specific quantitative real-time PCR and ELISA for recording a potential transfer of novel DNA and Cry1Ab protein from feed into bovine milk[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2009, 393(6-7):1629-1638.

    [59]胡艷麗. PCR-ELISA方法在轉(zhuǎn)基因大豆檢測中的應用[J].食品安全導刊, 2015, 21:74.

    [60]Wang XJ, Jin X, Dun BQ, et al. Gene-splitting technology:a novel approach for the containment of transgene flow inNicotiana tabacum[J]. PLoS One, 2014, 9(6):e99651.

    [61]Yates K, Sambrook J, Russel D, et al. Detection methods for novel foods derived from genetically modified organisms[M]. ILSI Europe, 1999.

    [62]王榮談, 張建中, 劉冬兒, 等. 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法研究進展[J]. 上海農(nóng)業(yè)學報, 2010, 26(1):116-119.

    [63]Santos VO, Pelegrini PB, Mulinari F, et al. A novel immunochromatographic strip test for rapid detection of Cry1Ac and Cry8Ka5 proteins in genetically modified crops[J]. Analytical Methods,2015, 7(21):9331-9339.

    [64]Mutoni CK, Magiri E, Boga IH, et al. Inadvertent presence of genetically modified elements in maize food products in Kenyan markets[J]. African Journal of Biotechnology, 2013, (31):4881-4890.

    [65]張欣, 彭毛, 劉波, 等. 快速試紙條在轉(zhuǎn)基因水稻和大米檢測中的應用[J]. 糧食科技與經(jīng)濟, 2015, 40(5):48-49.

    [66]張裕君, 賀艷, 趙衛(wèi)東, 等. PCR核酸試紙條法檢測轉(zhuǎn)基因黑曲霉[J]. 食品研究與開發(fā), 2013, 34(20):62-64.

    [67]沈蘇南. 一種多重PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因大豆檢測中的應用研究[D]. 蘇州:蘇州大學, 2016.

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