UVB誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞的SMP30基因表達(dá)變化

張 杰, 高 波

0 引 言

正常人皮膚成纖維細(xì)胞(human skin fibroblast，HSF)長(zhǎng)期暴露在氧化應(yīng)激條件下，可以被氧化應(yīng)激誘導(dǎo)出現(xiàn)衰老、形態(tài)改變、G1期停滯以及許多調(diào)控衰老靶基因的表達(dá)水平改變等標(biāo)記[1-2]。紫外線長(zhǎng)期照射皮膚可以發(fā)生氧化應(yīng)激類的光損傷，這種光損傷在細(xì)胞衰老、皮膚老化的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，紫外線中波(ultraviolet B,UVB)作為自然環(huán)境中的一種紫外輻射主要作用于皮膚的真皮淺層和表皮層，UVB照射后可以誘導(dǎo)皮膚光老化，導(dǎo)致皮膚變得粗糙、皺紋加深[3]。衰老標(biāo)記蛋白30(senescence marker protein 30,SMP30)是新發(fā)現(xiàn)的一種存在于大腦微粒體中的衰老標(biāo)記蛋白，最早識(shí)別于老鼠肝臟，又被稱為鈣調(diào)素，其表達(dá)隨著宿主年齡的增加而降低，可能介導(dǎo)延緩衰老的進(jìn)程[4]。本研究采用不同劑量的UVB照射HSF不同時(shí)間，模擬損傷狀態(tài)，觀察HSF細(xì)胞生長(zhǎng)活性、凋亡率以及SMP30基因表達(dá)的變化，探討該基因在UVB導(dǎo)致的皮膚損傷的作用，為闡明氧化應(yīng)激類光損傷機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料HSF (武漢大學(xué)細(xì)胞庫(kù))，Reverse Transcription System A3500、Trizol Reagent(Promega)；PE7500(ABI公司)；100 bp DNA marker (Fermentas公司)；SYBR GreenⅠ染料(Gene公司)；RG-BOX紫外凝膠成像系統(tǒng)(Gene公司)； CF-16RX臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(日立公司)；721紫外分光光度計(jì)(北京六一公司)；PCR試劑盒 (上海生物工程有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與UVB處理將細(xì)胞凍融復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，融合生長(zhǎng)至80%后用1∶1的胰蛋白酶和EDTA進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。取2～4代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，其余液氮保存。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，其中經(jīng)過(guò)不同劑量UVB(100、200、300 mJ/cm2)處理不同時(shí)間(1、2、3 d后)[5]的HSF為實(shí)驗(yàn)組，以未采用UVB照射的HSF為陰性對(duì)照組。取生長(zhǎng)良好的傳代細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行HSF細(xì)胞生長(zhǎng)活性、凋亡率以及SMP30基因表達(dá)的檢測(cè)。

1.2.2細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)應(yīng)用MTT法檢測(cè)。具體方法為：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞約2×103個(gè)(約200 μL)的培養(yǎng)液接種到培養(yǎng)板中，24 h后細(xì)胞貼壁單層生長(zhǎng)約50%～60%孔面積時(shí)棄上清，UVB間距30 cm處照射，劑量分別為100、200、300 mJ/cm2，照射時(shí)間分別為1、2、3 d。照射結(jié)束后終止培養(yǎng)，棄去上清，每空加二甲亞砜振蕩混勻，測(cè)定各孔570 nm處吸光度(A)，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate, CPIR)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，計(jì)算公式如下：

CPIR=(對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A/對(duì)照組A)×100%

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSF細(xì)胞凋亡率UVB照射時(shí)間、劑量方法同上。照射完畢后胰蛋白酶消化離心收集細(xì)胞約1×106個(gè)，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞3次，加入FITC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V 10 μL和結(jié)合緩沖液100 μL，室溫避光10 min，加入碘化丙啶5 uL，混勻后避光染色30 min后用流式細(xì)胞儀測(cè)定HSF細(xì)胞凋亡率。

1.3SMP30基因表達(dá)檢測(cè)

1.3.1引物合成內(nèi)參β-actin的上游引物: CTC GCG TAC TCT CTC TTT CTG G，下游引物: GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC TTA A，擴(kuò)增片段334 bp；SMP30的上游引物:CCG TGG ATG CCT TTG ACT AT，下游引物:TCC AAA GCA GCA TGA AGT TG，擴(kuò)增片段233 bp(上海生物工程有限公司)。

1.3.2RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄收集細(xì)胞，按照說(shuō)明書步驟提取HSF細(xì)胞中總RNA，提取的RNA經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度后溶于無(wú)RNA酶的雙蒸水中，采用A3500逆轉(zhuǎn)試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系為：總RNA 2 μL，25 mmol/L MgCL24 μL，10 mmol/L dNTP混合液 2 μL，10×Buffer 2 μL，Oligo(dT)引物1 μL，AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶0.6 μL，Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，用無(wú)核酸酶的雙蒸水齊體積至20 μL。短暫離心后置于PCR擴(kuò)增儀，42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用無(wú)RNA酶的雙蒸水稀釋逆轉(zhuǎn)的cDNA至100 μL后mRNA擴(kuò)增或者-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系 2mmol/L dNTP 1.5 μL、10×Buffer 3 μL、25mmol/L Mg2+2.4 μL、5 U/uL Taq 0.3 μL、上下游引物各2 μL、10×SYBR-GreenⅠ1 μL、 cDNA 5 μL，用無(wú)菌水補(bǔ)齊體積共30 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 60 s共40個(gè)循環(huán)；最后一步收集熔點(diǎn)曲線的過(guò)程95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min。

1.3.4結(jié)果判斷通過(guò)熔點(diǎn)曲線判斷擴(kuò)增的特異性，然后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與指示buffer混勻后，2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，120 V電壓電泳1 h，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。在233、334 bp處出現(xiàn)特異性目的條帶。并利用檢測(cè)Ct值和擴(kuò)增效率E，以β-actin mRNA為參照，計(jì)算SMP30相對(duì)表達(dá)量，公式如下：

SMP30 mRNA/β-actin mRNA=(1+Eβ-actin)Ct (β-actin)/ (1+ESMP30)Ct (SMP30)

2 結(jié) 果

2.1不同劑量UVB處理不同時(shí)間后對(duì)HSF細(xì)胞增殖的影響隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，CPIR增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著UVB劑量的增加，CPIR增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

組別不同照射時(shí)間的CPIR1d2d3d對(duì)照組000實(shí)驗(yàn)組 100mJ/cm24.12±0.76*#6.02±1.08#8.38±1.27*# 200mJ/cm27.14±0.84*9.14±1.4411.42±1.51* 300mJ/cm29.52±0.53*#12.37±0.96#14.64±1.05*#與UVB照射2d比較,*P<0.05;與實(shí)驗(yàn)組UVB200mJ/cm2比較,#P<0.05

2.2不同劑量UVB處理不同時(shí)間后對(duì)HSF細(xì)胞凋亡的影響隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著UVB劑量的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸增高(P<0.05)。見(jiàn)表2 。

組別不同照射時(shí)間的細(xì)胞凋亡率1d2d3d對(duì)照組1.96±0.412.81±0.574.01±0.38實(shí)驗(yàn)組 100mJ/cm26.52±1.51*#10.06±1.50#12.06±1.17*# 200mJ/cm29.61±1.14*12.24±1.1914.32±0.86* 300mJ/cm212.06±1.17*#14.18±1.16#16.02±1.32*#與UVB照射2d比較,*P<0.05;與實(shí)驗(yàn)組UVB200mJ/cm2比較,#P<0.05

2.3UVB誘導(dǎo)后SMP30基因表達(dá)的變化對(duì)照組中SMP30基因的相對(duì)表達(dá)量為(1.15±0.11)，實(shí)驗(yàn)組中SMP30基因表達(dá)量為(0.66±0.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.5，P<0.01)?；虮磉_(dá)的電泳見(jiàn)圖1。隨著UVB劑量的增加，實(shí)驗(yàn)組中SMP30基因表達(dá)逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著UVB處理時(shí)間的延長(zhǎng)SMP30基因表達(dá)也逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，基因的表達(dá)對(duì)UVB誘導(dǎo)有著較為明顯的時(shí)間依賴性和濃度劑量依賴性。見(jiàn)表3。

1：對(duì)照組；2：β-actin；3～5分別為實(shí)驗(yàn)組UVB 100、200、300 mJ/cm2圖1 SMP30基因在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的表達(dá)電泳圖

組別不同照射時(shí)間的基因相對(duì)表達(dá)量1d2d3d對(duì)照組1.08±0.101.18±0.101.20±0.10實(shí)驗(yàn)組 100mJ/cm20.94±0.08#*0.82±0.08#0.69±0.10#* 200mJ/cm20.80±0.11*0.66±0.080.53±0.09* 300mJ/cm20.63±0.12#*0.48±0.08#0.36±0.07*#與UVB照射2d比較,*P<0.05;與實(shí)驗(yàn)組UVB200mJ/cm2比較,#P<0.05

3 討 論

衰老是指在正常生理情況下發(fā)育成熟的個(gè)體隨著年齡的增長(zhǎng)器官逐漸退行性改變以及生理機(jī)能逐漸衰退等生物現(xiàn)象，是內(nèi)源性因素和外源性因素共同作用的結(jié)果[6]。細(xì)胞內(nèi)mRNA含量降低是衰老后細(xì)胞分子水平的主要改變，作為人體最大器官的皮膚隨著年齡增長(zhǎng)也會(huì)出現(xiàn)衰老情況，并且研究表明長(zhǎng)期的UVB照射可以導(dǎo)致不可逆的慢性光老化曬傷，發(fā)病隱蔽、病程較長(zhǎng)，不僅可以造成皮膚的早衰、難治性皮損，還可以誘發(fā)皮膚腫瘤的發(fā)生[7-10]。為研究UVB照射和SMP30基因改變之間的關(guān)系，本文以不同劑量UVB處理不同時(shí)間后的HSF為研究對(duì)象，研究SMP30基因在模擬損傷狀態(tài)前后基因表達(dá)的變化，探討UVB照射在皮膚衰老中的機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著UVB劑量的增加以及照射時(shí)間的延長(zhǎng)，HSF細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率逐漸增高，表明HSF在一定劑量UVB照射一定時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)一定的損傷狀態(tài)，比如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生存率下降等。王懿娜等[2]研究也發(fā)現(xiàn)300 mJ/cm2劑量的UVB照射可以使得HSF細(xì)胞進(jìn)入光損傷狀態(tài)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)一系列的氧化應(yīng)激損傷表現(xiàn)，如：細(xì)胞周期停滯在G1期、細(xì)胞凋亡、SOD活性下降以及氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)物升高等。并且本研究發(fā)現(xiàn)隨著UVB劑量的增加實(shí)驗(yàn)組中SMP30基因表達(dá)逐漸降低，基因的表達(dá)對(duì)UVB誘導(dǎo)有著較為明顯的時(shí)間依賴性和濃度劑量依賴性，模擬損傷后的基因表達(dá)要明顯低于對(duì)照組，這與國(guó)內(nèi)的研究結(jié)果一致[11]。SMP30在實(shí)驗(yàn)老鼠中，隨著氧化應(yīng)激水平的逐漸增強(qiáng)，其表達(dá)逐漸減弱[12]，并且高表達(dá)的SMP30可以抑制與衰老相關(guān)的細(xì)胞活性氧ROS和β-半乳糖苷酶的表達(dá)[11]，而在小鼠敲除SMP30基因后，促氧化劑水平隨著鼠齡增加而增加[13]，這些研究表明SMP30具有抗細(xì)胞衰老的作用，可能正是由于皮膚在遭受UVB這類氧化應(yīng)激時(shí)，氧自由基增多聚集，并且引起HSF細(xì)胞中調(diào)控皮膚衰老的基因SMP30表達(dá)降低，產(chǎn)生一系列不可逆的細(xì)胞內(nèi)的氧化損傷，導(dǎo)致皮膚的衰老[14]。

研究表明，大劑量的紫外照射可以引起DNA不可逆的損傷，或者細(xì)胞壞死甚至癌變，小劑量的照射可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的光損傷，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞老化過(guò)程[15-16]。氧化應(yīng)激損傷在皮膚細(xì)胞早衰過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，并且紫外照射導(dǎo)致的光老化被認(rèn)為是一種癌前病變[17]，如何有效降低和控制這類損傷，延緩和預(yù)防由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致的皮膚衰老是我們后期研究的主要方向，也是課題目前不足之處，但這也為美容醫(yī)學(xué)提供了一個(gè)很好的契機(jī)。并且進(jìn)一步研究UVB照射，預(yù)防皮膚腫瘤的發(fā)生也將是我們后期研究的重點(diǎn)。

綜上所述，經(jīng)過(guò)不同劑量UVB處理不同時(shí)間后，HSF細(xì)胞中SMP30表達(dá)存在較為明顯的時(shí)間依賴性和劑量依賴性，這對(duì)了解UVB如何調(diào)控皮膚衰老機(jī)制提供一定理論依據(jù)。

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