玻璃體液檢測(cè)技術(shù)在法醫(yī)學(xué)死亡時(shí)間推斷中的研究進(jìn)展

段偉成，蘭玲梅，郭亞?wèn)|，扎拉嘎白乙拉，閆 杰，丁艷君，蔡繼峰

（中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

死亡時(shí)間（PMI）的推斷，一直是法醫(yī)學(xué)研究和實(shí)踐工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。傳統(tǒng)的PMI推斷方法包括根據(jù)尸冷、尸僵、尸斑、組織腐敗的時(shí)間、胃內(nèi)容物、超生反應(yīng)和法醫(yī)昆蟲學(xué)等，這些方法雖然能夠推斷PMI，但有自身的局限性，存在其特定使用的時(shí)間和范圍，且其中一些方法精確度仍有待提高[1]。玻璃體占眼球總體積的80%，其含水量在98.00%～99.17%，其余約1%為少量蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、糖、乳酸、尿素、維生素C、氨基酸、脂質(zhì)等[2-3]，而且玻璃體在眼球中處于一個(gè)特殊的位置，受尸體腐敗和外界污染影響較小，內(nèi)部環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。據(jù)此認(rèn)為，其內(nèi)不同生物化學(xué)指標(biāo)的變化，可作為早期PMI推斷的依據(jù)[4]。近些年，隨著相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，不同技術(shù)存在各自的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點(diǎn)；而且不同實(shí)驗(yàn)室的校準(zhǔn)、處理方法以及使用的儀器不同都可能使同一樣品檢測(cè)出不同結(jié)果，從而影響其實(shí)際應(yīng)用[5-6]。因此，為了進(jìn)一步利用玻璃體液進(jìn)行PMI的推斷和相關(guān)技術(shù)的合理應(yīng)用及改進(jìn)，本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)用于PMI推斷的玻璃體液檢測(cè)技術(shù)、儀器及其近年來(lái)的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 推斷PMI的玻璃體液檢測(cè)技術(shù)

1.1 離子選擇性電極技術(shù)用于PMI推斷

離子選擇性電極（ion selective electrode，ISE）是一類利用膜電位測(cè)定溶液中離子活度或濃度的電化學(xué)傳感器，其原理是將溶液中指定離子的活度轉(zhuǎn)化為一定的電位，對(duì)溶液中特定離子進(jìn)行選擇性響應(yīng)，其電位可用能斯特方程表示[7]。

早在數(shù)十年前即有學(xué)者利用ISE檢測(cè)玻璃體液的K+濃度，并對(duì)PMI進(jìn)行推斷[8]。近年來(lái)，CHANDRAKANTH等[9]進(jìn)一步利用Roche 9180電解質(zhì)分析儀中的ISE法，研究了114例PMI為36 h內(nèi)的尸體［男性76例，女性38例，年齡為12～77歲，平均年齡為（36.4±15.6）歲］的玻璃體液中 Na+、K+、Cl-濃度在男、女性以及左、右眼中是否存在差異，以期進(jìn)一步找到影響因素，從而優(yōu)化檢測(cè)。在該方法中，離子電極被固定在含有纈氨霉素的離子交換膜上，經(jīng)過(guò)檢測(cè)及比較后，發(fā)現(xiàn)玻璃體液中 Na+、K+、Cl-濃度在男、女性和左、右眼中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了進(jìn)一步排除影響玻璃體液進(jìn)行PMI推斷的干擾因素，ZILG等[10]通過(guò)ABL 625型血?dú)夥治鰞x內(nèi)置的ISE法測(cè)定了462例PMI為2 h～17 d的尸體（男性346例，女性116例）的玻璃體液中K+濃度，同時(shí)對(duì)所有案例的年齡及其中272例周圍環(huán)境溫度進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，得到年齡范圍為0～95歲（平均年齡52歲），發(fā)現(xiàn)玻璃體液中 K+濃度與年齡和環(huán)境溫度顯著相關(guān)，并推導(dǎo)出一個(gè)多元非線性方程進(jìn)行PMI推斷：

式中M表示穩(wěn)態(tài)時(shí)的鉀離子濃度，C0表示死亡時(shí)的鉀離子濃度，L0表示無(wú)年齡和溫度影響下的鉀離子跨膜率，A 表示年齡（歲），T 表示溫度（℃），mA表示年齡系數(shù)，mT表示溫度系數(shù)，[K+]在4.73～29.91mmol/L時(shí)，利用該公式才有意義。作者根據(jù)272例案件數(shù)據(jù)得到參數(shù)最佳值，由此推斷的PMI誤差約為4.05 h，且其可對(duì)死亡5d內(nèi)的尸體進(jìn)行PMI推斷。簡(jiǎn)化檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)檢案極其重要，特別是偏遠(yuǎn)地區(qū)。為此，徐升橋等[11]采用ISE作為信號(hào)轉(zhuǎn)換元件來(lái)檢測(cè)離子濃度，設(shè)計(jì)出一種玻璃體液鉀鈉離子濃度便攜式檢測(cè)設(shè)備，可以通過(guò)在現(xiàn)場(chǎng)快速檢出玻璃體液中K+、Na+的濃度，進(jìn)而間接推斷PMI。PASSOS等[12]報(bào)道了一個(gè)獨(dú)特的分析循環(huán)方法——順序注射系統(tǒng)，即基于黃嘌呤氧化酶催化的次黃嘌呤與尿酸的氧化反應(yīng)測(cè)定次黃嘌呤，采用ISE法測(cè)定K+濃度，使得K+與次黃嘌呤能夠被同時(shí)、自動(dòng)化地測(cè)定；并對(duì)9例尸體玻璃體液成功檢測(cè)，認(rèn)為同時(shí)檢測(cè)兩種參數(shù)可較好地減小PMI推斷的誤差。

ISE法的缺點(diǎn)在于檢測(cè)對(duì)象僅限于離子，并且需要專業(yè)人員操作及定期更換電極。但其在分析方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如寬線性范圍、高選擇性、低檢測(cè)限、快速響應(yīng)等，可利用此來(lái)對(duì)玻璃體液金屬離子進(jìn)行研究，且可通過(guò)檢測(cè)K+濃度并結(jié)合年齡、環(huán)境因素等多參數(shù)在一定程度上推斷PMI，適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，而基于此法的儀器若能在設(shè)計(jì)上實(shí)現(xiàn)便攜式、簡(jiǎn)單化、廉價(jià)化，將進(jìn)一步有利于我國(guó)基層的應(yīng)用。

1.2 毛細(xì)管離子分析技術(shù)用于PMI推斷

毛細(xì)管離子分析（capillary ion analysis，CIA）是一種新型、便捷、靈敏的分析技術(shù)，其原理是利用電場(chǎng)對(duì)電解質(zhì)溶液中帶電化合物的電場(chǎng)力作用，產(chǎn)生定向移動(dòng)來(lái)完成對(duì)物質(zhì)的分析[13]。

FERSLEW等[14]采用CIA技術(shù)對(duì)25例尸體的玻璃體液K+濃度進(jìn)行研究，樣本分離后在214 nm處進(jìn)行紫外吸收檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與ISE法所得結(jié)果相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為CIA可以用于玻璃體液K+濃度的檢測(cè)。之后，TAGLIARO等[15]又對(duì)CIA的應(yīng)用進(jìn)行了優(yōu)化，并以優(yōu)化的試劑檢測(cè)了12例尸體玻璃體液K+濃度，同樣在214nm處進(jìn)行紫外吸收檢測(cè)，并與火焰原子吸收光譜（flame atomic absorption spectroscopy，F(xiàn)AAS）法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示與火焰原子吸收光譜法相比無(wú)明顯差異，認(rèn)為該方法可以用于法醫(yī)學(xué)中PMI推斷。BOCAZ-BENEVENTI等[16]進(jìn)一步通過(guò)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度優(yōu)化CIA測(cè)定的玻璃體液K+濃度與PMI的相關(guān)性，比傳統(tǒng)線性最小二乘法相關(guān)性更好（r=0.98），并且其推斷的PMI誤差小于 3 h。 BORTOLOTTI等[17]選擇了 PMI在 2～110 h的164個(gè)案例（年齡11～88歲），采用CIA技術(shù)研究了玻璃體液 K+濃度（y）和 PMI（x）的關(guān)系，并進(jìn)一步建立了線性回歸方程：

其推斷平均誤差為5.54h。

CIA技術(shù)具有高靈敏度、強(qiáng)抗干擾性、低成本、分離性能良好等優(yōu)點(diǎn)[18]，但同樣有其不足，如操作的專業(yè)性、檢測(cè)對(duì)象的局限性以及對(duì)溫度變化敏感導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性相對(duì)較差等問(wèn)題，使其不利于在法庭科學(xué)中應(yīng)用。

1.3 光譜法用于PMI推斷

1.3.1 原子吸收光譜法

原子吸收光譜（atomic absorption spectrometry，AAS）法是指在通入試樣時(shí)，其蒸汽相中待測(cè)元素的基態(tài)原子共振吸收了光譜儀所發(fā)射出的含有待測(cè)特征譜線元素的光，通過(guò)發(fā)射光前后的差異對(duì)試樣中待測(cè)元素進(jìn)行定量。

JASHNANI等[19]利用AAS法測(cè)定了PMI在50 h內(nèi)的120例尸體玻璃體液中的Na+、K+濃度，發(fā)現(xiàn)其含量與年齡、性別、季節(jié)和保存條件（冷凍）無(wú)關(guān)，該結(jié)論明顯與HENSSGE等[20]不符，還需進(jìn)行大數(shù)據(jù)研究；此外，他們對(duì)Na+濃度與K+濃度的比值和PMI的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明兩者有顯著的線性關(guān)系（R2=0.4702）。針對(duì)外界環(huán)境溫度的影響，ROGNUM等[21]利用AAS法測(cè)定了106例PMI為17 min～118 h的尸體（男性53例，女性53例，年齡 15～100歲，中位年齡77歲，中位PMI 21.9h）的玻璃體液K+濃度，研究發(fā)現(xiàn)，玻璃體液K+濃度與外界環(huán)境溫度以及PMI有關(guān)，并以K+濃度和環(huán)境溫度作為參數(shù)，建立與PMI之間的多元線性方程：

式中T為環(huán)境溫度（℃），在95%的置信區(qū)間內(nèi)其誤差約為3h。

AAS法主要是對(duì)金屬元素進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)非金屬元素測(cè)定困難，并且其多采用單元素?zé)簦蚨荒苓M(jìn)行多元素分析，存在局限性[22]。但因其對(duì)溫度的變化不敏感，故具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。同時(shí)由于其具有高靈敏度、高精確度、低檢測(cè)限以及分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，可用于實(shí)驗(yàn)室金屬元素常規(guī)檢測(cè)和玻璃體液大數(shù)據(jù)分析。

1.3.2 電感耦合等離子體質(zhì)譜法

電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）法是一種以具有高溫電離特性的電感耦合等離子體為離子源，與質(zhì)譜儀聯(lián)合使用而形成的一種獨(dú)特的分析技術(shù)。

龔志強(qiáng)等[23]利用ICP-MS法分析了家兔死后96h內(nèi)玻璃體液中21種元素的含量變化，探究其是否與PMI相關(guān)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，13種元素（鈉、鋁、鈣、鉀、鎂、鐵、磷、銻、鰓、鋇、鎳、銅、鋅）的含量與 PMI有關(guān)，其中鉀、鎂、鋇、鰓、磷含量與PMI為正相關(guān)，鈉、鈣、銅、鐵含量與PMI為負(fù)相關(guān)。

ICP-MS樣品制備簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度高、速度快，可在幾分鐘內(nèi)完成數(shù)十種元素的定量測(cè)定，故可用于篩選，以探究各元素的法醫(yī)學(xué)意義，但其無(wú)法對(duì)各化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)由于儀器的精密、昂貴，不適于現(xiàn)場(chǎng)檢案。

1.4 液相色譜法用于PMI推斷

液相色譜（liquid chromatography，LC）法是根據(jù)混合物中不同組分對(duì)某些物質(zhì)親和力的差異，以液體作為流動(dòng)相載入，從而進(jìn)行分離測(cè)定的方法。而高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法是在傳統(tǒng)LC法的基礎(chǔ)上利用高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)行的優(yōu)化與應(yīng)用。其特點(diǎn)是優(yōu)化了色譜分離參數(shù)，提高了分離度，減少了分析時(shí)間與成本[24]。

1.4.1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）是色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ)，將色譜高分離性能與質(zhì)譜高靈敏度、高選擇性及能準(zhǔn)確對(duì)分子量與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，在法醫(yī)學(xué)鑒定、醫(yī)藥、食品和環(huán)境等各分析檢測(cè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

LENDOIRO等[25]通過(guò)LC-MS/MS法對(duì)人玻璃體液中次黃嘌呤含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)能準(zhǔn)確對(duì)其進(jìn)行定量分析，檢測(cè)范圍為0.25～2.5μmol，比單獨(dú)使用LC法更加精確。同時(shí)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受血液污染的玻璃體液中可定性檢測(cè)尿酸陽(yáng)性。據(jù)此提出，可以憑借LCMS/MS法對(duì)尿酸定性檢測(cè)來(lái)判斷所測(cè)玻璃體液是否被污染，如尿酸檢測(cè)陽(yáng)性即可認(rèn)為此樣品已被污染，沒(méi)有檢測(cè)價(jià)值。由于玻璃體液含有黏性基質(zhì)，在對(duì)其檢測(cè)前必須將其液化。為了研究不同預(yù)處理方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的影響，CAMBA等[5]將105例尸體的玻璃體液樣品每例均分為4份，分別通過(guò)酶消化法、聲波降解法、離心法、加熱法進(jìn)行預(yù)處理，并采用LC-MS/MS法測(cè)定其中次黃嘌呤含量以評(píng)價(jià)其優(yōu)劣，最終推薦使用離心法和聲波降解法進(jìn)行玻璃體液樣本預(yù)處理，這為玻璃體液樣本的預(yù)處理提供了理論依據(jù)。

1.4.2 高效液相色譜與熒光檢測(cè)器聯(lián)用法

高效液相色譜與熒光檢測(cè)器聯(lián)用（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）法已被報(bào)道用于法醫(yī)學(xué)研究。GIRELA等[26]通過(guò)HPLC-FLD法定量檢測(cè)了58具尸體（男性18 例，女性 40 例，年齡 13～97 歲，PMI為 5～60 h，平均PMI為23.9 h）的玻璃體液中17種游離氨基酸的含量，并研究其與PMI之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，3種氨基酸與PMI具有相關(guān)性，即天冬氨酸（r=0.4508，P=0.000 3）、谷氨酸（r=0.432 3，P=0.000 7）、氨基乙磺酸（r=0.3191，P=0.01461），尤其是天冬氨酸在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著的增加，認(rèn)為其可以在PMI推斷中作為輔助參數(shù)，有一定參考價(jià)值。

1.4.3 高效液相色譜-紫外檢測(cè)法

高效液相色譜-紫外檢測(cè)（high performance liquid chromatography-ultraviolet detection，HPLC-UV）法是HPLC與紫外光譜分析聯(lián)用的方法。MU?OZ等[27]利用HPLC-UV法檢測(cè)了死亡32 h內(nèi)的134例尸體玻璃體液樣本的次黃嘌呤含量，并驗(yàn)證了其與PMI的相關(guān)性，推導(dǎo)出線性回歸方程：

其中[Hx]表示次黃嘌呤的含量。與傳統(tǒng)酶學(xué)檢測(cè)方法相比，其線性擬合程度更好，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)更方便。

1.4.4 離子色譜法

離子色譜法是根據(jù)被測(cè)物質(zhì)的離子性進(jìn)行分離和檢測(cè)的LC法，常被用來(lái)對(duì)離子進(jìn)行分析。ZHOU等[6]首次使用低壓離子色譜法檢測(cè)玻璃體液K+濃度，認(rèn)為其具有高選擇性與敏感性，并采用相對(duì)短的色譜柱對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，使其檢出限為1 mmol/L，變異系數(shù)小于5%，并通過(guò)研究PMI為1～27h的62個(gè)成年人尸體樣品，建立了玻璃體液K+濃度與PMI的線性關(guān)系：

LC法與其他技術(shù)聯(lián)用，可高效、靈敏地定性、定量檢測(cè)多種化學(xué)物質(zhì)，但同樣因?yàn)閮x器昂貴、不便于攜帶等原因不適于現(xiàn)場(chǎng)使用。

1.5 納米傳感技術(shù)用于PMI推斷

近年來(lái)，一些學(xué)者利用納米材料尺寸小、接觸面積大、響應(yīng)迅速等特點(diǎn)制備了一種傳感檢測(cè)體系，因其所采用材料的特性，故將這種技術(shù)稱為納米傳感技術(shù)。該技術(shù)主要是通過(guò)一些生物、化學(xué)物質(zhì)特異性識(shí)別被檢物質(zhì)，信號(hào)元件作出響應(yīng)，從而對(duì)某一物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，具有簡(jiǎn)單、靈敏、高效的特點(diǎn)，并給傳統(tǒng)的檢測(cè)領(lǐng)域帶來(lái)一種全新思路。其中食品、醫(yī)療、環(huán)境等檢測(cè)領(lǐng)域研究了大量稀有金屬（Au、Ag、Cu、Pt等）量子點(diǎn)[28]。

ANSARI等[29]利用所合成的特定銀量子點(diǎn)與胱氨酸氫鍵連接產(chǎn)生特異的構(gòu)象改變，根據(jù)其優(yōu)良的光學(xué)性能，構(gòu)建出基于銀量子點(diǎn)的傳感體系，用于玻璃體液中的胱氨酸檢測(cè)，并利用該方法聯(lián)合紫外光譜檢測(cè)了90例包含正?；蚍钦Ｋ劳鍪w（20～60歲）中的玻璃體液，發(fā)現(xiàn)在死亡后96 h內(nèi)玻璃體液中胱氨酸濃度與PMI有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)誤為3.9h。并且通過(guò)智能手機(jī)對(duì)反應(yīng)后的傳感體系進(jìn)行比色分析的情況下，發(fā)現(xiàn)該方法在死后24 h內(nèi)對(duì)PMI推斷具有極大可行性，推導(dǎo)出方程：

式中TSD（time since death）表示死后經(jīng)過(guò)時(shí)間，x表示半胱氨酸濃度的色彩數(shù)字強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)誤為2.6h，可用于現(xiàn)場(chǎng)PMI快速推斷。

該銀量子點(diǎn)傳感器用于PMI的推斷將新興的納米傳感技術(shù)引入法醫(yī)學(xué)研究，其現(xiàn)場(chǎng)可操作性以及簡(jiǎn)便、靈敏等特點(diǎn)與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢(shì)，但其穩(wěn)定性、重復(fù)性仍待進(jìn)一步確認(rèn)。并且，此文獻(xiàn)[29]僅針對(duì)半胱氨酸單一參數(shù)進(jìn)行了研究報(bào)道，未對(duì)玻璃體液進(jìn)行多成分分析。而聯(lián)合應(yīng)用多種指標(biāo)進(jìn)行PMI推斷將有利于提高推斷的準(zhǔn)確性。故利用納米傳感技術(shù)對(duì)玻璃體液多成分同時(shí)進(jìn)行分析并以此推斷PMI，對(duì)于推廣玻璃體液在法醫(yī)檢案中的實(shí)際應(yīng)用有著較大潛力，值得進(jìn)一步研究。

2 推斷PMI的玻璃體液檢測(cè)儀器

2.1 全自動(dòng)生化分析儀用于PMI推斷

霍菁菁[30]使用全自動(dòng)生化分析儀中的ISE法對(duì)家兔死后不同時(shí)間玻璃體液內(nèi)K+濃度進(jìn)行測(cè)定，并且比較了不同溫度下K+濃度與PMI的關(guān)系，認(rèn)為溫度越高，離子濃度上升速率越快，在死亡前期較為明顯，在24h內(nèi)，死亡早期升高的速率快于后期。為了控制氣候環(huán)境條件對(duì)玻璃體液中電解質(zhì)和葡萄糖與PMI關(guān)系的影響，SIDDAMSETTY等[31]利用生化分析儀在半干旱條件下分析了210例尸體（男性174例，女性36例）玻璃體液的多種化學(xué)成分，分析結(jié)果表明，PMI與K+濃度具有顯著的正相關(guān)性（r=0.841），與Na+和葡萄糖僅有微弱的負(fù)相關(guān)性，r值分別為0.137和0.241，而Ca2+和Cl-濃度與PMI無(wú)明顯相關(guān)性，并且PMI在72h內(nèi)時(shí)誤差較小。王偉平等[32]用日本島津全自動(dòng)生化檢測(cè)儀對(duì)模擬春秋和冬季的家兔玻璃體液內(nèi)的膽堿酯酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性變化進(jìn)行了多通道分光光度計(jì)比色分析，并經(jīng)Pearson相關(guān)分析得到膽堿酯酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性與PMI呈明顯負(fù)相關(guān)。MIHAILOVIC等[33]根據(jù)性別、年齡、死亡原因等將63具尸體（18～65歲）分成兩組以降低這些因素干擾，然后分別在4℃和20℃的恒溫環(huán)境下進(jìn)行試驗(yàn)，在24 h內(nèi)每隔3 h采集一次玻璃體液，共計(jì)567個(gè)樣本，利用ARCHITECT c8000全自動(dòng)生化分析系統(tǒng)中酶催化法（乳酸脫氫酶催化乳酸為丙酮酸和過(guò)氧化氫）檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)玻璃體液中乳酸與PMI有良好的線性相關(guān)性，從而可以通過(guò)玻璃體液中乳酸的含量較為精確地計(jì)算PMI，并推導(dǎo)出4℃和20℃下的方程分別為：

式中 L表示乳酸濃度（mmol/L），誤差分別為（4.2±2.9）h 和（2.5±2.4）h。

該測(cè)定方法簡(jiǎn)單，能通過(guò)內(nèi)置多種檢測(cè)技術(shù)對(duì)多種物質(zhì)實(shí)行自動(dòng)化檢測(cè)，對(duì)于法醫(yī)PMI推斷具有一定的指導(dǎo)意義。然而相對(duì)于LC法而言，全自動(dòng)生化分析儀只能對(duì)常規(guī)生化物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，不適用于某些特殊物質(zhì)及探索性研究。但因其自動(dòng)化及簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用較為方便。若能進(jìn)一步確定多個(gè)常規(guī)參數(shù)并聯(lián)合使用，以此檢測(cè)來(lái)推斷PMI有望成為一種簡(jiǎn)便方法。

2.2 流式細(xì)胞儀用于PMI推斷

CORDEIRO等[34]通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了40例死亡后24 h內(nèi)尸體玻璃體液中的紅細(xì)胞含量，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)的濃度結(jié)果能夠很好地反映樣本是否被污染，為篩選樣本是否適用于檢測(cè)提供了方便有效的方法，降低了PMI估算的錯(cuò)誤率，使得分析結(jié)果更加精確。因此，在檢案中可聯(lián)合該技術(shù)來(lái)輔助玻璃體液用于PMI推斷，對(duì)法庭科學(xué)證據(jù)進(jìn)行有效性篩選。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)用于PMI推斷

ODRIOZOLA等[35]將PMI在24h內(nèi)的34例尸體玻璃體液分為白天死亡組和夜晚死亡組，并利用實(shí)時(shí)定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）分析了玻璃體液中 miR-34c、miR-541、mir-888、miR-484、miR-142-5p和miR-222的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-541和miR-142-5p的表達(dá)在夜晚和白天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其與PMI無(wú)顯著相關(guān)性，可以此作為PMI晝夜分類的初篩指標(biāo)。

2.4 CT掃描用于PMI推斷

KOOPMANSCHAP等[36]設(shè)立了3組實(shí)驗(yàn)，對(duì)玻璃體液進(jìn)行CT掃描來(lái)檢測(cè)其放射密度，從而分析放射密度與PMI的關(guān)系。其中第一組為5具尸體，于死后36 h內(nèi)每小時(shí)對(duì)其玻璃體液進(jìn)行CT掃描一次，并定期檢測(cè)鼓膜溫度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，放射密度隨PMI遞增（r2=0.65），但與溫度無(wú)關(guān)。另外兩組分別為100例在醫(yī)院死亡的尸體［男性62例，女性38例，年齡0～91 歲，PMI為 0.2～63.8 h，平均 PMI為（12.6±11.8）h］和12例院外死亡的尸體（男性9例，女性3例，年齡29～84歲），對(duì)這兩組尸體玻璃體液進(jìn)行CT掃描，發(fā)現(xiàn)其放射密度明顯高于第一組。最終認(rèn)為，玻璃體液放射密度可以用于推斷PMI，但其中還有很多影響因素有待進(jìn)一步研究。

3 展 望

通過(guò)測(cè)定玻璃體液理化成分的規(guī)律性變化，雖然為PMI的確定提供了一種較好的方法，但在PMI推斷實(shí)踐中仍有許多問(wèn)題有待進(jìn)一步研究。玻璃體液本身成分的多樣性，加上機(jī)體死后存在復(fù)雜的變化過(guò)程，受生物屏障破壞、代謝穩(wěn)定性消失以及死者病情、死亡原因的復(fù)雜性等多種因素影響，使得在推斷PMI過(guò)程中不能僅局限于某種指標(biāo)的變化。應(yīng)根據(jù)病情、死亡原因等分類尋找多個(gè)合適參數(shù)，對(duì)其共同分析以減小誤差。同時(shí)，檢材的不同預(yù)處理、檢測(cè)方法等都可能影響檢測(cè)結(jié)果，從而影響其精確度。所以，在方法學(xué)上進(jìn)行統(tǒng)一也具有一定的重要性。

通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)用上述多種技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)玻璃體液多個(gè)參數(shù)進(jìn)行分析，主要是通過(guò)平行單組分法，即通過(guò)多個(gè)流程對(duì)玻璃體液的多組分進(jìn)行測(cè)定，其中每個(gè)過(guò)程僅局限于單一組分分析，然后通過(guò)綜合單一結(jié)果得到所需各組分含量，可在一定程度上優(yōu)化玻璃體液對(duì)PMI的推斷。目前，隨著材料、化學(xué)以及生物技術(shù)等領(lǐng)域的飛速發(fā)展，多組分同時(shí)分析正成為研究熱點(diǎn)。相較于平行單組分分析，多組分分析測(cè)定具有耗時(shí)少、耗材少、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，并能進(jìn)一步減小各指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用的誤差。如上述的納米傳感技術(shù)，因其獨(dú)特的生物相容性等優(yōu)勢(shì)，臨床醫(yī)學(xué)、食品等其他領(lǐng)域都已將此技術(shù)用于多組分同時(shí)分析[37-38]。若能以此為基礎(chǔ)，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中發(fā)展該方法，對(duì)玻璃體液進(jìn)行多組分分析，將會(huì)進(jìn)一步校準(zhǔn)依據(jù)玻璃體液推斷的PMI，給法醫(yī)學(xué)分析檢測(cè)領(lǐng)域帶來(lái)較大突破。

總而言之，在生物學(xué)角度，若能進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)各種死亡原因、病情下玻璃體液中適宜分析的理化成分，結(jié)合環(huán)境因素影響，在保證精確度及靈敏度的基礎(chǔ)上，發(fā)展一種便攜式、自動(dòng)化，并能多參數(shù)、多通道分析的方法進(jìn)行PMI推斷，并據(jù)此重新擬定回歸方程，將在一定程度上解決上述問(wèn)題，使得依據(jù)玻璃體液推斷的PMI進(jìn)一步精確，并廣泛用于不同地區(qū)的相關(guān)案件分析。

[1]MUGGENTHALER H，SINICINA I，HUBIG M，et al.Database of post-mortem rectal cooling cases under strictly controlled conditions：a useful tool in death time estimation[J].Int J Legal Med，2012，126（1）：79-87.

[2]BISHOP P.The biochemical structure of mammalian vitreous[J].Eye （Lond），1996，10（Pt 6）：664-670.

[3]BREWTON R G，MAYNE R.Mammalian vitreous humor contains networks of hyaluronan molecules：electron microscopic analysis using the hyaluronanbinding region （G1） of aggrecan and link protein[J].Exp Cell Res，1992，198（2）：237-249.

[4]陳瑤清，蔡繼峰，文繼舫.玻璃體液化學(xué)成分規(guī)律性改變與死亡時(shí)間推斷的研究進(jìn)展[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（1）：53-56.

[5]CAMBA A，LENDOIRO E，CORDEIRO C，et al.High variation in hypoxanthine determination after ana-lytical treatment of vitreous humor samples[J].Forensic Sci Med Pathol，2014，10（4）：627-633.

[6]ZHOU B，ZHANG L，ZHANG G，et al.The determination of potassium concentration in vitreous humor by low pressure ion chromatography and its application in the estimation of postmortem interval[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2007，852（1-2）：278-281.

[7]閻秉峰.離子選擇性電極的工作原理[J].內(nèi)蒙古科技與經(jīng)濟(jì)，2005（3）：106-109.

[8]趙經(jīng)隆，高光斗，杜新增.利用玻璃體液鉀離子濃度推斷死亡時(shí)間[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，1988，3（3）：146.

[9]CHANDRAKANTH H V，KANCHAN T， BALARAJ B M，et al.Postmortem vitreous chemistry--an evaluation of sodium，potassium and chloride levels in estimation of time since death（during the first 36h after death）[J].J Forensic Leg Med，2013，20（4）：211-216.

[10]ZILG B，BERNARD S，ALKASS K，et al.A new model for the estimation of time of death from vitreous potassium levels corrected for age and temperature[J].Forensic Sci Int，2015，254：158-166.

[11]徐升橋，徐效文，蘇日娜，等.玻璃體液鉀鈉離子濃度便攜式測(cè)定儀器的初步設(shè)計(jì)[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志，2010，27（6）：2279-2282.

[12]PASSOS M L， SANTOS A M， PEREIRA A I， et al.Estimation of postmortem interval by hypoxanthine and potassium evaluation in vitreous humor with a sequential injection system[J].Talanta，2009，79（4）：1094-1099.

[13]關(guān)福玉.高效毛細(xì)管電泳離子分析[J].分析化學(xué)，1995，23（1）：111-116.

[14]FERSLEW K E， HAGARDORN A N， HARRISON M T，et al.Capillary ion analysis of potassium concentrations in human vitreous humor[J].Electrophoresis，1998，19（1）：6-10.

[15]TAGLIARO F，MANETTO G，CITTADINI F， et al.Capillary zone electrophoresis of potassium in human vitreous humour：validation of a new method[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl，1999，733（1-2）：273-279.

[16]BOCAZ-BENEVENTI G， TAGLIARO F， BORTOLOTTI F，et al.Capillary zone electrophoresis and artificial neural networks for estimation of the postmortem interval（PMI） using electrolytes measurements in human vitreous humour[J].Int J Legal Med，2002，116（1）：5-11.

[17]BORTOLOTTI F， PASCALI J P， DAVIS G G， et al.Study of vitreous potassium correlation with time since death in the postmortem range from 2 to 110 hours using capillary ion analysis[J].Med Sci Law，2011，51（S1）：S20-S23.

[18]HILHORST M J， SOMSEN G W， DE JONG G J.Capillary electrokinetic separation techniques for profiling of drugs and related products[J].Electrophoresis，2001，22（12）：2542-2564.

[19]JASHNANI K D，KALE S A，RUPANI A B.Vitreous humor：biochemical constituents in estimation of postmortem interval[J].J Forensic Sci，2010，55（6）：1523-1527.

[20]HENSSGE C，MADEA B.Estimation of the time since death in the early post-mortem period[J].Forensic Sci Int，2004，144（2-3）：167-175.

[21]ROGNUM T O，HOLMEN S，MUSSE M A， et al.Estimation of time since death by vitreous humor hypoxanthine，potassium，and ambient temperature[J].Forensic Sci Int，2016，262：160-165.

[22]許文艷，李曉蓉，郭斌.原子吸收光譜法檢測(cè)技術(shù)研究綜述[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，2015（11）：76-79.

[23]龔志強(qiáng)，曾憲斌，孫躍剛，等.家兔眼玻璃體液21種元素含量與 PMI關(guān)系的研究[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2002，18（2）：67-69.

[24]孫會(huì)敏，田頌九.高效液相色譜法簡(jiǎn)介及其在藥品檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].齊魯藥事，2011，30（1）：38-42.

[25]LENDOIRO E， CORDEIRO C， RODRíGUEZ-CALVO M S，et al.Applications of Tandem Mass Spectrometry（LC-MSMS） in estimating the post-mortem interval using the biochemistry of the vitreous humour[J].Forensic Sci Int，2012，223（1-3）：160-164.

[26]GIRELA E， VILLANUEVA E， IRIGOYEN P， et al.Free amino acid concentrations in vitreous humor and cerebrospinal fluid in relation to the cause of death and postmortem interval[J].J Forensic Sci，2008，53（3）：730-733.

[27]MU?OZ J I， COSTAS E， RODRíGUEZ-CALVO M S，et al.A high-performance liquid chromatography method for hypoxanthine determination in vitreous humour：application to estimation of post mortem interval[J].Hum Exp Toxicol，2006，25（5）：279-281.

[28]WU S，DUAN N，SHI Z，et al.Dual fluorescence resonance energy transfer assay between tunable upconversion nanoparticles and controlled gold nanoparticles for the simultaneous detection of Pb2+and Hg2+[J].Talanta，2014，128：327-336.

[29]ANSARI N，LODHA A，MENON S K.Smart platform for the time since death determination from vitreous humor cystine[J].Biosens Bioelectron，2016，86：115-121.

[30]霍菁菁.不同溫度下死亡家兔玻璃體液鉀離子濃度與PMI關(guān)系的研究[D].蘭州：甘肅政法學(xué)院，2014.

[31]SIDDAMSETTY A K， VERMA S K， KOHLI A，et al.Estimation of time since death from electrolyte，glucose and calcium analysis of postmortem vitreous humour in semi-arid climate[J].Med Sci Law，2014，54（3）：158-166.

[32]王偉平，龍仁，劉承泉，等.家兔玻璃體液2種酶活性變化與死亡時(shí)間的相關(guān)性[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2005，20（4）：199-201.

[33]MIHAILOVIC Z，ATANASIJEVIC T，POPOVIC V，et al.Could lactates in vitreous humour be used to estimate the time since death?[J].Med Sci Law，2011，51（3）：156-160.

[34]CORDEIRO C，SEOANE R，CAMBA A，et al.The application of flow cytometry as a rapid and sensitive screening method to detect contamination of vitreous humor samples and avoid miscalculation of the postmortem interval[J].J Forensic Sci，2015，60（5）：1346-1349.

[35]ODRIOZOLA A，RIANCHO J A，DE LA VEGA R，et al.miRNA analysis in vitreous humor to determine the time of death：a proof-of-concept pilot study[J].Int J Legal Med，2013，127（3）：573-578.

[36]KOOPMANSCHAP D H，BAYAT A R，KUBAT B，et al.The radiodensity of cerebrospinal fluid and vitreous humor as indicator of the time since death[J].Forensic Sci Med Pathol，2016，12（3）：248-256.

[37]ZHOU Y， TIAN X L， LI Y S， et al.A versatile and highly sensitive probe for Hg （II）， Pb （II） and Cd （II） detection individually and totally in water samples[J].Biosens Bioelectron，2011，30（1）：310-314.

[38]ZONG C， WU J， WANG C， et al.Chemiluminescence imaging immunoassay of multiple tumor markers for cancer screening[J].Anal Chem，2012，84（5）：2410-2415.