示指與接觸物菌群ERIC-PCR指紋圖譜比對(duì)

劉耘汀 ，孫大明 ，施少培 ，楊 旭

（1.華東政法大學(xué)，上海 200043；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063）

對(duì)嫌疑人現(xiàn)場(chǎng)留下的蛛絲馬跡進(jìn)行識(shí)別和追蹤是刑事案件偵破的最常用手段之一。隨著嫌疑人反偵察意識(shí)的增強(qiáng)，傳統(tǒng)的鑒定方法如手印、足跡等痕跡鑒定已無法完全滿足現(xiàn)代刑事偵查的要求。毛發(fā)、血液、軟組織碎片等生物物證的DNA分析技術(shù)是近年來使用廣泛、成熟可靠的物證鑒定技術(shù)，被廣泛運(yùn)用于犯罪現(xiàn)場(chǎng)、犯罪嫌疑人、血緣關(guān)系確認(rèn)等諸多偵查領(lǐng)域[1-2]，但該技術(shù)對(duì)生物檢材的質(zhì)和量均有一定要求，部分限制了該技術(shù)的應(yīng)用。

細(xì)菌作為最原始、種類數(shù)量最龐大的客體，是人體與生俱來的附屬生物。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌幾乎存在于人體所有部位并和人體建立了密切的共生或寄生關(guān)系，一個(gè)正常人所攜帶的細(xì)菌約為1.0～1.5kg，這些細(xì)菌大多存在于腸道系統(tǒng)，幫助人體消化食物、保護(hù)病原微生物入侵。僅就人手部而言，每個(gè)人雙手大約有150種細(xì)菌，總數(shù)多達(dá)80萬個(gè)。2010年，F(xiàn)IERER等[5-6]發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌寄生人體具有一定的“特異性”，即每個(gè)人可能具有獨(dú)有的寄生細(xì)菌，人和人之間的菌群種類差別高達(dá)80%～90%，且在人體手部接觸物體后，留在物體表面的細(xì)菌可存活2周，這些細(xì)菌具有頑強(qiáng)的生命力，即使在犯罪嫌疑人用洗滌液清洗后，殘留的少量細(xì)菌仍能在4h左右恢復(fù)原有細(xì)菌菌群。因此，人體自身特有的細(xì)菌群落，可能成為犯罪現(xiàn)場(chǎng)無法消除的重要生物學(xué)線索。當(dāng)提取到犯罪嫌疑人殘留在其接觸物體上的細(xì)菌后，即可擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)而復(fù)原細(xì)菌原有種群，通過DNA指紋技術(shù)建立獨(dú)特的“細(xì)菌指紋圖譜”，從而用于司法鑒定工作。

DNA指紋技術(shù)是指利用不同生物體中DNA序列的差異性，建立起的一種用于個(gè)體識(shí)別、遺傳追溯的DNA條帶圖譜。該技術(shù)自從20世紀(jì)70年代被提出后，迅速運(yùn)用于物種起源進(jìn)化、腫瘤發(fā)生、疾病診斷、親子鑒定、法醫(yī)鑒定等諸多領(lǐng)域[7-8]。腸道細(xì)菌基因間重復(fù)序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）是最早在腸道細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度約為124～127bp的高度保守的DNA重復(fù)序列。近年大量研究[9-13]表明，幾乎所有細(xì)菌基因組均包括ERIC，該序列在不同細(xì)菌基因組的重復(fù)頻次、間隔等具有特異性。在使用該序列的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增后，腸道中不同的細(xì)菌會(huì)出現(xiàn)特異性DNA條帶圖譜，即ERICPCR指紋圖譜。這種圖譜具有分辨率高、敏感性高、重復(fù)性高、操作簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)，因此被越來越多地運(yùn)用于細(xì)菌鑒定、種群分布、群落生態(tài)等研究領(lǐng)域。

本研究采集人體示指細(xì)菌和其常用手機(jī)觸摸屏、個(gè)人辦公桌桌面細(xì)菌，對(duì)菌群進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取混合細(xì)菌的宏基因組DNA，利用ERIC-PCR技術(shù)對(duì)上述樣本分別進(jìn)行分型，通過對(duì)三者之間的圖譜比對(duì)分析，探討ERIC-PCR指紋圖譜用于同一認(rèn)定的可能性。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

酵母浸粉、胰蛋白胨（北京陸橋技術(shù)股份有限公司），溶菌酶、飽和酚溶液、蛋白酶K（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司），ERIC-PCR引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］，LA Taq 酶、dNTP、DNA maker（日本TaKaRa公司），9700型PCR儀（美國(guó)AB公司），G-Box型凝膠成像分析儀（美國(guó)SYNGENE公司），PowerPacTM基礎(chǔ)電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司），5810R型低溫冷凍離心機(jī)（德國(guó)eppendorf公司），NanoDrop 2000C分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific公司），SIMF140AY65型雪花狀制冰機(jī)（日本SANYO公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 細(xì)菌樣本采集及培養(yǎng)

邀請(qǐng)男性和女性志愿者各5名，用滅菌PBS溶液濕潤(rùn)滅菌棉球，根據(jù)志愿者使用手機(jī)和鼠標(biāo)的習(xí)慣，分別擦拭志愿者右手示指、手機(jī)觸摸屏、個(gè)人辦公桌桌面，將擦拭后的棉球放入標(biāo)識(shí)好的普通培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）中，37℃搖床過夜培養(yǎng)。男性細(xì)菌樣本用M代表，示指分別編號(hào)為Mf1～5，對(duì)應(yīng)的手機(jī)觸摸屏分別編號(hào)為Mp1～5，對(duì)應(yīng)的桌面編號(hào)為Me1～5；女性樣本用F代表，示指、手機(jī)觸摸屏、個(gè)人辦公桌桌面分別編號(hào)為Ff1～5、Fp1～5、Fe1～5。LB培養(yǎng)基配方如下：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂粉15g/L，高滅菌后倒置固體平板培養(yǎng)基。

1.2.2 細(xì)菌宏基因組提取

取過夜培養(yǎng)16h的菌液3mL，以離心半徑10cm，5000r/min，離心10min，棄上清液，PBS緩沖液洗菌體沉淀3次，1mL PBS重懸后加入50mg/mL溶菌酶37℃孵育1h，依次加入100μL 10%SDS溶液，20 mg/mL蛋白酶K 55℃孵育1h，再加入1500μL 5mol/L NaCl溶液；最后經(jīng)過 V酚∶V氯仿∶V異戊=25∶24∶1 抽提，2 倍體積無水乙醇沉淀DNA后雙蒸水溶解。

1.2.3 ERIC-PCR

ERIC-PCR 引物序列為 ERIC（F） 5′-ATGTAAG CTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC（R） 3′-AAGTAAGTG ACTGGGGTGAGCG-5′[8，11]。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；94℃ 3s，92℃ 30s，50℃ 1min，65℃ 8min；30 次循環(huán)；65℃ 8 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后，由G-Box型凝膠成像分析儀采集圖像。

1.3 結(jié)果分析

電泳圖譜通過G-Box型凝膠成像分析儀采集條帶后進(jìn)行分析比對(duì)。

2 結(jié) 果

2.1 示指宏基因組DNA質(zhì)量

如圖1所示，所有采集到的志愿者宏基因組均有較完整的全基因組條帶。另外，經(jīng)NanoDrop 2000C分光光度計(jì)分析，所有DNA的D260/280值均在1.8～2.0。

圖1 10名志愿者的宏基因組DNA提取結(jié)果

2.2 示指和手機(jī)觸摸屏細(xì)菌宏基因組ERIC-PCR關(guān)聯(lián)性比較

示指和手機(jī)觸摸屏細(xì)菌宏基因組ERIC-PCR結(jié)果如圖2所示，在10名志愿者中一共有4名男性、3名女性的示指與手機(jī)觸摸屏上的菌群ERIC-PCR指紋圖譜對(duì)應(yīng)吻合。有1名男性、2名女性示指和手機(jī)觸摸屏上的細(xì)菌ERIC-PCR指紋圖譜不一致，其中1名男性（7～8泳道）示指和手機(jī)觸摸屏上的DNA圖譜只有一條近似大小的DNA條帶，1名女性（11～12泳道）示指和手機(jī)觸摸屏上的菌群ERIC-PCR指紋圖譜完全不同，無同樣大小的條帶。以上兩名志愿者示指和手機(jī)觸摸屏上的菌群采集和ERIC-PCR重復(fù)三次，結(jié)果完全相同。對(duì)于不同人的ERIC-PCR指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，不論是示指還是手機(jī)觸摸屏上的細(xì)菌ERIC-PCR指紋圖譜均有較大區(qū)別。

圖2 示指和手機(jī)觸摸屏菌群宏基因組ERIC-PCR結(jié)果

2.3 示指和個(gè)人辦公桌桌面細(xì)菌宏基因組ERICPCR關(guān)聯(lián)性比較

如圖3，在10名志愿者中，只有2名男性（1～2和9～10泳道）和1名女性（17～18泳道）的示指與個(gè)人辦公桌桌面菌群ERIC-PCR指紋圖譜對(duì)應(yīng)吻合，而其他7名志愿者示指和辦公桌桌面菌群ERIC-PCR指紋圖譜不完全相符。但圖譜條帶比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，3～4、5～6、11～12、13～14、15～16、19～20 泳道中至少有一個(gè)條帶大小近似，且大多數(shù)條帶大小完全一致，可以根據(jù)條帶的符合程度來推測(cè)兩者之間細(xì)菌種群的近似性，條帶位置、數(shù)目越接近，表示兩者的菌群構(gòu)成越相似。

圖3 示指和辦公桌桌面細(xì)菌宏基因組ERIC-PCR結(jié)果

3 討 論

2010年，F(xiàn)IERER等[5]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌寄生人體具有一定的“特異性”。2012年，GOGA 研究[14]發(fā)現(xiàn)，可以通過襪子上的細(xì)菌來確定襪子的所有者。以上研究證明，細(xì)菌作為一種可擴(kuò)增繁殖、不易被消除的生物材料，在法醫(yī)學(xué)鑒定方面具有較大潛力，但實(shí)際運(yùn)用并不多。

本研究通過對(duì)志愿者示指和接觸物（手機(jī)觸摸屏、個(gè)人辦公桌桌面）細(xì)菌進(jìn)行ERIC-PCR，建立DNA指紋圖譜，比較示指和其接觸物（手機(jī)觸摸屏、個(gè)人辦公桌桌面）之間細(xì)菌宏基因組的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人體示指與接觸物（手機(jī)觸摸屏、個(gè)人辦公桌桌面）菌群之間存在關(guān)聯(lián)性，且這種關(guān)聯(lián)性可以借助ERIC-PCR建立DNA指紋圖譜來快捷、直觀地呈現(xiàn)。其中，與手機(jī)觸摸屏相比，個(gè)人辦公桌桌面采集的細(xì)菌和個(gè)體示指表面菌群的關(guān)聯(lián)性明顯降低?？紤]到示指及接觸物（手機(jī)觸摸屏、個(gè)人辦公桌桌面）菌群復(fù)雜，部分細(xì)菌可能帶有莢膜、細(xì)胞壁等，對(duì)細(xì)菌的裂解造成影響，另外糖類、蛋白質(zhì)、RNA可能也會(huì)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生不良影響，而相較于一般PCR，ERIC-PCR對(duì)模板DNA要求更高。因此，為了保證DNA質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop 2000C分光光度計(jì)測(cè)定D260/280值兩種方法來檢測(cè)DNA質(zhì)量。另外，反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌樣品的采集極為關(guān)鍵，物品使用者的個(gè)人習(xí)慣、環(huán)境中其他微生物等都會(huì)對(duì)ERIC-PCR結(jié)果產(chǎn)生較大影響。

因?yàn)楸狙芯空心嫉闹驹刚呷藬?shù)有限，所得的結(jié)果只能作為初步推測(cè)。鑒于細(xì)菌群落構(gòu)成受地域、性別、年齡、職業(yè)、遺傳等多個(gè)因素影響而表現(xiàn)出相對(duì)的穩(wěn)定和變化，手機(jī)觸摸屏、個(gè)人辦公桌桌面的菌群也受到濕度、酸堿度、時(shí)間等因素影響，為了盡可能地避免干擾，實(shí)驗(yàn)邀請(qǐng)的10名志愿者均為年齡、職業(yè)、工作環(huán)境相對(duì)一致的研究生，但最終想要將菌群作為個(gè)體識(shí)別的材料之一，仍需進(jìn)一步深入研究。此外，本研究雖然通過ERIC-PCR指紋圖譜比對(duì)方法初步證明了宏基因組在同一認(rèn)定中的應(yīng)用價(jià)值，但是由于體外培養(yǎng)的方法可能帶來微生物種類的變化或偏移，加之檢驗(yàn)方法的靈敏度所限，在今后的研究中將對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步優(yōu)化，包括采用新一代高通量測(cè)序等更加靈敏的檢測(cè)手段以及增加樣本檢測(cè)量和代表性，使研究結(jié)果更接近鑒定應(yīng)用的需要。

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