陳琪 羅程 陳紅 蘇松 付文廣 謝鑫 鄭思琳
口腔潰瘍(oral ulcer)在黏膜疾病中占據(jù)首位,不論性別、年齡、人種均可發(fā)生,是術(shù)后、腫瘤等患者的常見并發(fā)癥。疼痛具有反復(fù)性、灼痛感等特征,阻礙進食、睡眠,從而導(dǎo)致營養(yǎng)不良、抵抗力下降,嚴重影響患者的生存質(zhì)量[1-2]。目前的治療方法有針灸、冷敷、光子照射等,治療藥物多種,但目前沒有療效明確的治療方法與藥物[3]。而基因治療是目前尚未廣泛應(yīng)用又極具前景的治療方式。所以,我們嘗試從相關(guān)基因入手,堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)一種促進細胞生長的多肽生長因子,具有修復(fù)完善骨組織、血管、神經(jīng)的作用,能夠刺激內(nèi)皮細胞增殖和新生血管的生成。那么它在潰瘍組織中是如何表達呢?目前尚無明確的研究,因此,本項目擬研究在口腔潰瘍兔口腔頰黏膜組織中bFGF的表達情況,嘗試為口腔潰瘍治療提供新的思路。
新西蘭兔72 只, SPF級, 體重3 000~3 500 g,雌雄各半,購于瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心,許可證號:SYXK(川)2013-065。
口腔潰瘍散(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產(chǎn)), 3 g/瓶(國藥準字Z11020184, 產(chǎn)品批號: 15100065)。涂于潰瘍處, 2 次/d, 療程7 d。
Rabbit anti-bFGF、 羊抗兔二抗(CST公司, 美國); SP kit、DAB kit、First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche公司, 瑞士); 病理切片機、紫外凝膠系統(tǒng)、紫外分光光度計(Bio-rad公司, 美國)。
1.4.1兔口腔潰瘍動物模型制備新西蘭大白兔隨機分為3 組,每組24 只:正常黏膜組(對照組),不做任何處理;口腔潰瘍模型黏膜組(模型組),用直徑為8 mm的玻棒蘸取濃度為40%的冰醋酸置于兔左右兩側(cè)距口角2 mm頰膜處燒灼60 s,生理鹽水沖洗1 min,使局部成灰白色,直徑8 mm的白色損害, 24 h后經(jīng)病理檢查證實兔口腔潰瘍動物模型建立成功[3]??谇粷兡P椭委熃M(治療組),造模成功后,每天給予口腔潰瘍散涂抹, 2 次/d, 療程7 d。觀察動物的精神狀態(tài)、飲食狀況及皮毛的變化等一般情況。在第3、 5、 7 天取各組口腔頰黏膜組織,每組各取6 只。
1.4.2實驗步驟 取各組口腔頰黏膜組織: ①HE染色切片檢測組織的炎癥細胞、血管數(shù)目,上皮增生情況; ②RT-PCR檢測口腔頰部黏膜組織中bFGF基因mRNA表達情況,Quantity One軟件計算比較RT-PCR產(chǎn)物條帶與β-actin條帶的吸光度的相對比值,通過分析,最終得出相對表達量; ③石蠟切片后,用免疫組織化學(xué)法檢測口腔頰黏膜bFGF的平均積吸光度值。采用計算機圖像分析技術(shù)對免疫組化結(jié)果進行半定量分析。通過ImaGe-pro-plus圖像系統(tǒng)半定量測定bFGF的表達,蛋白表達在胞漿,呈棕黃色顆粒。每張切片隨機取10 個互不重疊的視野(×400)測定積分吸光度值(integral optical density, IOD)和面積累加值(Area),IOD/Area得到平均吸光度值,結(jié)果以平均吸光度值表示。
1.4.3觀察指標bFGF在兔口腔潰瘍頰黏膜組織中的表達情況。
造模組大鼠冰醋酸燒灼后,逐漸出現(xiàn)進食量下降,部分體質(zhì)量與正常對照組相比明顯偏低。對照組大鼠生長較好,未出現(xiàn)死亡病例。24 h后經(jīng)病理檢查證實已建立兔口腔潰瘍模型(圖 1)。造模成功當天,黏膜上皮破損或糜爛,大量炎細胞浸潤。治療組用藥3 d后,炎細胞浸潤開始減輕,壞死組織減少,邊緣纖維細胞增生;用藥5 d后炎癥細胞明顯減少,無壞死組織,大量成纖維細胞增生;用藥7 d后形成癒痕組織。模型組僅在7 d后有愈合的趨向。
圖 1口腔黏膜HE染色圖片(×400)
Fig 1HE staining of oral mucos(×400)
造模成功當天, bFGF mRNA在正常黏膜組中少量表達(0.34±0.03),與模型組(0.60±0.06)、治療組(0.60±0.06)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),模型組與治療組比較,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在用藥的第3、 5、 7 天, 模型組、治療組中bFGF mRNA的表達水平逐漸升高,治療組高于模型組,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖 2, 表 1)。
圖 2口腔黏膜bFGF mRNA表達
Fig 2The expression of bFGF mRNA in oral mucosa
注: ①P<0.05vs對照組; ②P<0.05vs模型組, ③ 采用兩因素方差分析對各組和各時間點進行分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義后,再通過Duncan檢驗進行兩兩比較
光學(xué)高倍(×400)物鏡下: bFGF在正??谇粷凁つさ纳掀雍驼嫫映嗜醣磉_或不表達,陽性表達在胞質(zhì)。
bFGF在正常黏膜組中少量表達0.01±0.00,模型組第1 天的表達為0.02±0.01, 2 組比較,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。模型組與治療組比較,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在用藥的第3、 5、 7天, 模型組、 治療組中bFGF的表達水平逐漸升高,模型組bFGF的蛋白表達量低于治療組(P<0.01),且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖 3, 表 2)。
圖 3各組bFGF蛋白表達(免疫組化, ×400)
Fig 3The expression of bFGF protein in the groups(Immunohistochemistry×400)
注: ①P<0.05vs對照組; ②P<0.05vs模型組; ③ 采用兩因素方差分析對各組和各時間點進行分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義后,再通過Duncan檢驗進行兩兩比較
口腔潰瘍(oral ulcer,OU)俗稱“口瘡”,是一種常見的發(fā)生于口腔黏膜的潰瘍性損傷病癥,多見于唇內(nèi)側(cè)、舌頭、舌腹、頰黏膜、前庭溝、軟腭等部位,這些部位的黏膜缺乏角質(zhì)化層或角化較差。可分為輕型復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍和慢性口腔潰瘍。不論性別、年齡、人種均可發(fā)生,發(fā)病時疼痛劇烈,很難根治[4]。目前口腔潰瘍的病因及發(fā)病機制尚不完全清楚,經(jīng)研究認為其發(fā)病原因有多種,如環(huán)境因素、遺傳因素、心理因素、病毒感染、機體免疫等[5-6],多合并多種因素。由于口腔潰瘍產(chǎn)生的因素較多,目前的治療存在各種困難[7]。
就目前而言,基因治療是一種尚未廣泛應(yīng)用又極具前景的治療方案,可能對口腔潰瘍的治療產(chǎn)生革命性的變化,而bFGF是調(diào)控細胞生長、分化、凋亡和機體多種組織和器官形成的重要因子。在皮膚損傷、創(chuàng)面愈合中起著重要作用[8]。那么bFGF是否能促進口腔潰瘍創(chuàng)面的愈合呢?因此,bFGF進入了我們的思考范圍并引導(dǎo)設(shè)計了上述的對比試驗,以期能發(fā)現(xiàn)一些與口腔潰瘍相關(guān)的變化。
在創(chuàng)傷愈合過程中,血管再生是一個重要的環(huán)節(jié),細胞生長因子對這一過程的發(fā)生和發(fā)展具有重要的調(diào)節(jié)作用。bFGF是一種促進細胞生長較強的多肽生長因子,不僅能夠刺激內(nèi)皮細胞增殖和新生血管的生成,還能促進膠原蛋白的合成,肉芽組織的生成,改變免疫應(yīng)答[9]。Mullane 等[10]發(fā)現(xiàn)bFGF通過增加牙髓中的微血管密度,從而促進牙髓損傷的修復(fù)。Takamiya 等[11]研究銳器對皮膚損傷后,皮膚組織中出現(xiàn)bFGF蛋白表達,bFGF表達開始于損傷后0.5~1 h。 bFGF分布于體內(nèi)多種細胞,以自分泌和旁分泌方式促進細胞自身與周圍細胞的增殖、分化、蛋白質(zhì)合成等[9],是最有效的促血管生長因子之一[12]; 如果bFGF的數(shù)量異常、功能紊亂,則可能會出現(xiàn)組織、血管、神經(jīng)的修復(fù)、再生障礙,創(chuàng)面愈合受到抑制,而bFGF的存在,可能是口腔潰瘍愈合的原因之一,所以bFGF的表達是我們關(guān)注的重點。
在本試驗中觀察發(fā)現(xiàn),通過40%的冰醋酸燒灼兔口腔頰部成功建立兔口腔潰瘍模型,并且在實驗中通過使用RT-PCR、免疫組織化學(xué)等方法進行檢測,從而證實口腔潰瘍兔的潰瘍組織中bFGF出現(xiàn)了明顯的變化,治療組較模型組有明顯的增多,隨著創(chuàng)面的不斷愈合,表達在不斷升高,說明bFGF參與了口腔潰瘍創(chuàng)面的愈合過程。由此初步考慮如果bFGF的表達增加,從而促進組織、血管、神經(jīng)等的修復(fù)和再生,而潰瘍形成當天,bFGF的表達最低,機體處于損傷狀態(tài); 如果bFGF的表達持續(xù)低下,潰瘍創(chuàng)面則得不到恢復(fù)。目前所用治療口腔潰瘍的藥物存在種類繁多、治療效果不佳、副作用大等缺點,尚無通過基因治療口腔潰瘍的藥物。因此,bFGF基因表達變化的發(fā)現(xiàn),可能為基礎(chǔ)研究和臨床治療口腔潰瘍提供新的藥物治療靶點[13],找到一種新的治療手段和方向。
[1]Patton DW, Ali A, Davies R, et al. Oral rehabilitation and quality of life following the treatment of oral cancer[J]. Dent Update, 1994, 21(6): 231-234.
[2]馬曉喆, 李言君, 付愛麗, 等. IFN-γ R和sIL-2R在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者中的表達及意義[J]. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志,2015, 31(2): 94-97.
[3]劉敏, 邢樹國, 王勤濤,等. 口腔潰瘍含片治療復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍Ⅲ期臨床試驗[J]. 實用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 26(5): 664-667.
[4]李前進, 王宇翎, 尹艷艷, 等.一種簡便實用的口腔潰瘍實驗?zāi)P蚚J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2002, 37(4): 327-328.
[5]Eguia-del Valle A, Martinez-Conde-Llamosas R, López-Vicente J, et al. Salivary levels of tumour necrosis factor-alpha in patients with recurrent aphthous stomatitis[J]. Med Oral Patol Oral Cir Bucal, 2011, 16(1): e33-36.
[6]Boras VV, Lukac J, Brailo V, et al. Salivary interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha in patients with recurrent aphthous ulceration[J]. J Oral Pathol Med, 2006, 35(4): 241-243.
[7]Farid RM, Wen MM. Promote recurrent aphthous ulcer healing with low dose prednisolone bilayer mucoadhesive buccal film[J]. Curr Drug Deliv, 2017, 14(1): 123-135.
[8]Kirby AE, Middlebrooks JC. Unanesthetized auditory cortex exhibits multiple codes for gaps in cochlear implant pulse trains[J]. J Assoc Res Otolaryngol, 2012, 13(1): 67-80.
[9]Lucas C, Stanborough RW, Freeman CL, et al. Efficacy of low-level laser therapy on wound healing in human subjects: A systematic review[J]. Lasers Med Sci, 2000, 15(2): 84-93.
[10]Mullane EM, Dong Z, Sedgley CM, et al. Effects of VEGF and FGF2 on the revascularization of severed human dental pulps[J]. J Dent Res, 2008, 87(12): 1144-1148.
[11]Takamiya M, Saigusa K, Aoki Y. Immunohistochemical study of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor expression for age determination of cutaneous wounds[J]. Am J Forensic Med Pathol, 2002, 23(3): 264-267.
[12]Murakami M, Simons M. Fibroblast growth factor regulation of neovascularization[J]. Curr Opin Hematol, 2008, 15(3): 215-220.
[13]Choi SM, Ryu HA, Lee KM, et al. Development of stabilized growth factor-loaded hyaluronate-collagen dressing(HCD) matrix for impaired wound healing[J]. Biomater Res, 2016, 20: 9.