電化學發(fā)光法檢測胃泌素釋放肽前體的性能評價及臨床應用評估

沈雋霏， 吳文浩， 周佳燁， 王蓓麗， 郭 瑋， 潘柏申

（復旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032）

全國腫瘤登記中心最新的數(shù)據(jù)顯示，2012年全國惡性腫瘤發(fā)病率居第1位的是肺癌，每年新發(fā)病例約70.5萬。全國惡性腫瘤死亡率居第1位的也是肺癌，每年死亡病例約56.9萬[1]，其中小細胞肺癌（small-cell lung cancer，SCLC）約占新發(fā)肺癌病例的20%，雖然發(fā)病率遠不及非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC），但是SCLC惡性程度更高，侵襲性更強，易早期發(fā)生遠處轉移，預后極差[2]。因此，早期診斷SCLC是提高治療效果和改善預后的關鍵。傳統(tǒng)的影像學檢查難以發(fā)現(xiàn)早期SCLC微小的散在病灶，而組織活檢局限性更大，因此血清腫瘤標志物的檢測有著更大的優(yōu)勢，如無創(chuàng)、操作方便、成本低廉等。一直以來，輔助診斷SCLC的主要腫瘤標志物為神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE），但NSE的特異性不佳且易受溶血干擾，因此近年來胃泌素釋放肽前體（pro-gastrin-releasing peptide，ProGRP）作為一種輔助診斷SCLC的新腫瘤標志物受到了廣泛關注[3-5]。我們對電化學發(fā)光法檢測ProGRP的性能進行了評價并初步評估其臨床應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年1—12月復旦大學附屬中山醫(yī)院確診的SCLC患者48例，其中男45例、女3例，年齡38～77歲，所有患者均通過病理活檢或細胞學檢查[4-5]明確診斷；NSCLC患者79例，其中男47例、女32例，年齡33～81歲；肺部良性疾病患者40例，其中男17例、女23例，年齡24～84歲，包括社區(qū)獲得性肺炎、肺部血管瘤、間質性肺炎、肺部錯構瘤等；其他腫瘤患者60例，其中男34例、女26例，年齡40～84歲，包括食管癌、乳腺癌、肝細胞癌、胃癌、胰腺癌、結直腸癌等常見惡性腫瘤；自身免疫性疾病患者20例，其中男6例、女14例，年齡21～82歲，包括類風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性血管炎等。以上所有對象均排除合并腎臟疾病。另選取復旦大學附屬中山醫(yī)院同期體格檢查和相關實驗室檢查均無異常的表觀健康者120名作為正常對照組，其中男60名、女60名，年齡22～74歲。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采用BD促凝分離膠真空采血管（美國BD公司）采集所有對象的空腹靜脈血樣本。樣本采集后2 h內196×g離心10 min，分離血清后置-80 ℃保存，樣本復融后需在2 h內完成檢測。

1.2.2 檢測方法 分別采用電化學發(fā)光法、化學發(fā)光微粒子免疫法和酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測ProGRP，試劑盒分別由瑞士Roche公司、美國Abbott公司和CanAg診斷產品（北京）有限公司提供。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、NSE和細胞角蛋白19片段（cytokeratin 19-fragment，CYFRA21-1）試劑盒（電化學發(fā)光法）均由瑞士Roche公司提供。檢測儀器分別為 cobas e601全自動免疫分析儀（瑞士羅氏公司）、ARCHITECT i2000sr全自動免疫發(fā)光分析儀（美國雅培公司）和ST-360酶標儀（上海科華公司）。

1.2.3 精密度評價 以高、低2個水平的混合血清作為待測樣本，分別連續(xù)檢測20次，計算均值及變異系數(shù)（coefficient of variation，CV），以此作為批內精密度。將高、低2個水平的混合血清分裝后于-20 ℃保存，連續(xù)檢測20 d，計算均值及CV，以此作為批間精密度。

1.2.4 回收試驗 重復測定混合血清10次，取均值，以此作為基礎水平，在該基礎血清中分別按1∶1的比例加入高值（261.0 pg/mL）和低值（15.8 pg/mL）定值標準品作為回收樣本，每份回收樣本重復檢測3次，取均值并與理論值進行比較，計算回收率。

1.2.5 線性范圍驗證 參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP6-A2文件[6]，將系列稀釋后的5個水平的樣本按低值到高值和高值到低值分別檢測2次，計算均值后分別使用一次方程、二次方程和三次方程進行擬合，以評估是否呈線性。

1.2.6 參考區(qū)間驗證 參考CLSI EP28-A3c文件[7]，采用20名表觀健康者樣本驗證試劑盒給定參考區(qū)間的適用性。若20名表觀健康者的ProGRP檢測結果高于給定參考區(qū)間的人數(shù)≤2名，認定該參考區(qū)間適用；若＞2名則需要重新驗證或自行建立參考區(qū)間。

1.2.7 方法學比較 采用電化學發(fā)光法、化學發(fā)光微粒子免疫法和ELISA同時檢測40份血清樣本，剔除超過檢測上限需要稀釋的結果，通過Pearson相關分析和Bland-Altman偏差分析比較不同方法檢測結果的一致性，以x ±1.96s作為一致性界限。

1.2.8 臨床應用評價 比較SCLC組、NSCLC組、各疾病對照組及正常對照組ProGRP結果的差異。以臨床病理結果或細胞學診斷結果為金標準，評估ProGRP單項或聯(lián)合其他腫瘤標志物（CEA、NSE、CYFRA21-1）診斷SCLC的性能，比較不同檢測方法的診斷效能。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0和Medcalc 12.7軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均呈非正態(tài)分布，以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間差異比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估ProGRP單項或聯(lián)合其他腫瘤標志物診斷SCLC的性能及不同檢測方法的診斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 電化學發(fā)光法檢測ProGRP的方法學評價

2.1.1 精密度 電化學發(fā)光法檢測高、低2個水平ProGRP的批內精密度分別為0.8%和1.2%，批間精密度分別為0.9%和2.2%。見表1。

2.1.2 回收試驗 基礎血清ProGRP水平為226.2 pg/mL，分別與ProGRP高值、低值定值標準品1∶1混合后重新測定，回收率分別為99.86%和98.32%。見表2。

表1 電化學發(fā)光法檢測ProGRP的精密度結果

表2 電化學發(fā)光法檢測ProGRP的回收試驗結果

2.1.3 線性范圍驗證 一次多項式擬合方程為Y=0.995X+16.35，r2=1.0；二次多項式系數(shù)a的P值為0.731；三次多項式系數(shù)a的P值為0.669，b的P值為0.579。結果顯示二次、三次多項式系數(shù)與“0”差異無統(tǒng)計學意義，證明電化學發(fā)光法檢測ProGRP在33.13～4 796.00 pg/mL范圍內線性良好。

2.1.4 參考區(qū)間驗證 20名表觀健康者ProGRP檢測結果均在試劑盒聲明的參考區(qū)間內（0～69 .2 pg/mL），參考區(qū)間驗證通過。

2.1.5 方法學比較 Pearson相關分析顯示電化學發(fā)光法、化學發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP的結果相關性良好（電化學發(fā)光法與化學發(fā)光微粒子免疫法 r=0.988，P＜0.001；電化學發(fā)光法與ELISA r=1.000，P＜0.001；化學發(fā)光微粒子免疫法與ELISA r=0.989，P＜0.001）。Bland-Altman偏差分析顯示電化學發(fā)光法、化學發(fā)光微粒子免疫法和ELISA ProGRP結果在低值區(qū)域一致性良好，但隨著檢測結果的增加，偏差逐漸增大，當ProGRP＞500 pg/mL時出現(xiàn)趨勢性偏差，見圖1。

圖1 電化學發(fā)光法、化學發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP的Bland-Altman偏差分析

2.2 ProGRP的臨床應用評估

2.2.1 各組間ProGRP水平的比較 SCLC組、NSCLC組、肺部良性疾病組、其他腫瘤組、自身免疫性疾病組和正常對照組ProGRP水平分別為785.8（72.2～2 842.8）、43.1（31.2～50.0）、46.5（32.3～54.9）、32.5（17.1～48.6）、27.8（20.7～33.5）和30.8（17.3～42.5）pg/mL。SCLC組ProGRP水平明顯高于其他各組（P＜0.05），而其他各組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2.2 ProGRP診斷SCLC的性能 ProGRP診斷SCLC的ROC曲線的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.963[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）0.868～0.931]，最佳臨界值為66.65 pg/mL，敏感性為79.2%，特異性為95.3%，陽性預期值為71.68%（95%CI 57.64～ 83.20），陰性預期值為96.83%（95%CI 94.24～98.47）。見圖2。

圖2 ProGRP診斷SCLC的ROC曲線

2.2.3 ProGRP聯(lián)合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的性能 為進一步研究ProGRP聯(lián)合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的性能，以診斷結果為因變量，ProGRP、NSE、CEA、CYFRA21-1為自變量，使用二元Logistic回歸分析分別擬合ProGRP聯(lián)合NSE（ProGRP+NSE）的方程、4項指標聯(lián)合（ProGRP + NSE+ CEA+ CYFRA21-1）的方程來預測二分位結果，并將2次擬合后的預測值與ProGRP和NSE一同繪制ROC曲線。結果顯示，ProGRP+NSE診斷SCLC的AUC為0.957、敏感性為83.3%、特異性為96.2%、陽性預期值為81.6%、陰性預期值為96.6%，診斷性能明顯優(yōu)于單項檢測（P＜0.05）；與4項指標聯(lián)合檢測的診斷性能比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

2.2.4 電化學發(fā)光法、化學發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP診斷SCLC的ROC曲線比較 ROC曲線分析顯示，電化學發(fā)光法、化學發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP診斷SCLC的AUC（95%CI）分別為0.880（0.830～0.919）、0.892（0.844～0.929）、0.908（0.863～0.943），各方法間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖4。

表3 ProGRP聯(lián)合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的性能評估

圖3 ProGRP聯(lián)合CEA、NSE、CYFRA21-1診斷SCLC的ROC曲線

3 討論

胃泌素釋放肽（gastrin-releasing peptide，GRP）是一種重要的調節(jié)分子，與人體許多生理功能、病理狀態(tài)有關。GRP是一種胃腸激素，最初由MCDONALD等[8]從豬胃黏膜中分離，廣泛分布于哺乳動物的神經系統(tǒng)、胃腸道和呼吸道[9]。有研究顯示GRP在SCLC患者中呈高表達，且對腫瘤的生長和轉移有較大的意義[10-11]。然而，由于GRP的半衰期極短（約2 min），因此難以準確完成臨床檢測。相比之下，GRP的前體結構——ProGRP更為穩(wěn)定，其3種不同分子亞型的共同C端序列ProGRP（31～98）可作為輔助診斷SCLC的可靠腫瘤標志物[12]。

圖4 電化學發(fā)光法、化學發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP診斷SCLC的ROC曲線

本研究結果顯示電化學發(fā)光法檢測ProGRP的精密度、正確度、線性范圍、參考區(qū)間等各項性能指標均符合檢測要求。Pearson相關分析顯示電化學發(fā)光法、化學發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP的相關性良好，Bland-Altman偏差分析顯示電化學發(fā)光法、化學發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測結果的偏差總體在合理范圍內，3種方法在低值部分具有良好可比性，但偏差隨檢測結果的增加而增大，ProGRP＞500 pg/mL時可比性較差。

本研究結果顯示，SCLC組ProGRP水平明顯高于其他各組（P＜0.05），與文獻報道[13]基本一致；而NSCLC組、肺部良性疾病組、其他腫瘤組和正常對照組ProGRP水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。ProGRP診斷SCLC的敏感性為79.2%、特異性為95.3%、陽性預期值為71.68%、陰性預期值為96.83%，稍優(yōu)于NSE。NSE在檢測時易受溶血干擾，而ProGRP幾乎不受溶血影響，但患者腎功能不全會導致ProGRP水平升高，從而影響結果判斷[14]，因此ProGRP與NSE在輔助診斷SCLC時能互補。ProGRP與NSE聯(lián)合檢測診斷SCLC的敏感性為83.3%、特異性為96.2%、陽性預期值為81.6%、陰性預期值為96.6%，診斷性能明顯優(yōu)于單項檢測，且與4項指標聯(lián)合檢測的診斷性能無差異。

電化學發(fā)光法、化學發(fā)光微粒子免疫法和ELISA檢測ProGRP診斷SCLC時的AUC分別為0.880、0.892和0.908，三者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明3種方法的診斷效能基本相同，但電化學發(fā)光法和化學發(fā)光微粒子免疫法的檢測范圍相比ELISA更寬，檢測時間更短，具有更大的臨床應用價值。

綜上所述，ProGRP是輔助診斷SCLC的可靠指標，具有很好的敏感性及特異性，有助于肺癌的組織學分型，還能與NSE聯(lián)合檢測，有利于早期診斷SCLC，改善患者的預后，具有良好的臨床應用前景。此外，有文獻報道ProGRP對SCLC的療效監(jiān)測、復發(fā)評估以及預后評估均具有一定的價值[15]，有關這幾方面的情況將在今后的研究中進一步探討。

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