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    多位點(diǎn)序列分析法在白念珠菌性陰道炎唑類耐藥菌株分子流行病學(xué)研究中的運(yùn)用

    2018-03-29 09:06:56徐煒新
    檢驗(yàn)醫(yī)學(xué) 2018年3期
    關(guān)鍵詞:念珠菌性念珠菌陰道炎

    徐煒新, 孫 杰

    (上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 201800)

    念珠菌性陰道炎是婦女的一種常見病、多發(fā)病,其主要的病原體為白念珠菌。目前,白念珠菌已成為陰道炎的第二大致病因素,僅次于細(xì)菌感染[1]。白念珠菌性陰道炎如不及時(shí)進(jìn)行有效的治療,除會(huì)出現(xiàn)持續(xù)性陰道瘙癢,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量外,還可導(dǎo)致宮頸糜爛、輸卵管炎、盆腔炎等女性生殖道的多發(fā)性炎癥,繼而影響精子活力,誘發(fā)不孕,極少數(shù)患者甚至?xí)l(fā)生早產(chǎn)或胎兒發(fā)育不良等嚴(yán)重后果[2]。

    以氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑?yàn)榇淼倪蝾惪咕幬锸侵委煱啄钪榫躁幍姥椎某S盟幬?。然而,隨著臨床應(yīng)用的日益廣泛,唑類抗菌藥物的耐藥率逐漸升高[3],這種耐藥現(xiàn)象的增加往往伴隨著菌種基因型的變化?;蚍中褪欠治霾≡w種群結(jié)構(gòu)和流行性的常用方法,能有效進(jìn)行傳染源追蹤、暴發(fā)流行分析、種群動(dòng)力學(xué)研究等一系列流行病學(xué)研究。1998年,MAIDEN等[4]建立了多位點(diǎn)序列分析(multilocus sequence typing,MLST)法,能對(duì)核苷酸的序列多態(tài)性進(jìn)行高效分析。該方法現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的基因分型檢測(cè)。本研究采用MLST法對(duì)白念珠菌性陰道炎患者白帶樣本中分離出的白念珠菌臨床菌株進(jìn)行基因型分析,探究其分子生物學(xué)流行特征和遺傳變化趨勢(shì)。

    1 材料和方法

    1.1 菌株來源

    收集上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院婦產(chǎn)科2015年7月—2016年6月白念珠菌性陰道炎患者的白帶樣本中分離出的白念珠菌,其中60株對(duì)氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑中的1種或多種藥物耐藥;敏感菌株的入選采用隨機(jī)化原則,即選取菌株編號(hào)末尾為5的對(duì)3種唑類藥物均敏感的菌株,共38株。

    入選標(biāo)準(zhǔn):患者處于非月經(jīng)期,外陰有瘙癢感,外陰濕疹化,腫脹而有刺癢感,有瘙抓痕跡;白帶量多并有臭味,黏稠呈奶酪樣、豆腐渣樣或白色片狀;可有腫脹并有燒灼感,或有排尿困難和疼痛;陰道壁有白色偽膜狀物,且不易脫落;新鮮樣本不經(jīng)染色,在顯微鏡下用10%氫氧化鉀涂片鏡檢可見菌絲或孢子。

    排除標(biāo)準(zhǔn):患有腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全等器質(zhì)性疾病者;合并滴蟲、支原體、衣原體等感染者;就診前1個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過抗真菌治療的患者。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株的培養(yǎng)與鑒定 將白帶樣本接種于科瑪嘉顯色平板(法國CHROMagar公司)上,于35℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24~48 h,觀察結(jié)果。挑取科瑪嘉顯色平板上的翠綠色菌落,使用Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)進(jìn)行菌種鑒定。

    1.2.2 體外藥物敏感性試驗(yàn) 選用氟康唑(上海三維制藥廠)、伏立康唑(上海三維制藥廠)和伊曲康唑(美國Sigma公司)3種唑類藥物進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。以白念珠菌(ATCC 90028)和克柔念珠菌(ATCC 6258)作為質(zhì)控菌株。藥物敏感性試驗(yàn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。

    表1 氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的最低抑菌濃度折點(diǎn) (μg/mL)

    1.2.3 菌株DNA的提取、擴(kuò)增和測(cè)序 臨床分離的白念珠菌在沙保弱培養(yǎng)基(上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司)上復(fù)蘇培養(yǎng)后,采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒[生工生物工程(上海)有限公司]提取DNA,具體操作參照試劑說明書進(jìn)行。抽提完成后使用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific公司)測(cè)定抽提到的DNA濃度,并用雙蒸水將其終濃度稀釋至100~200 ng/μL,-20 ℃保存?zhèn)溆谩2捎冒啄钪榫?個(gè)管家基因進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,反應(yīng)體系為50 μL,包括DNA模板2 μL,正、反向引物各2 μL,2×PCR mix 25 μL,雙蒸水19 μL。擴(kuò)增條件:93 ℃預(yù)變性5 min,93 ℃變性30 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸4 min。反應(yīng)體系中除引物由生工生物工程(上海)有限公司合成外,其他試劑均由日本Takara公司生產(chǎn)。S100TM Thermal Cycler PCR儀由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證后,送至鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。7個(gè)管家基因的引物序列見表2。

    表2 白念珠菌7種管家基因的引物序列

    1.2.4 測(cè)序結(jié)果分析和序列類型(sequence type,ST)確定 采用Chromas 2軟件對(duì)所有菌株7個(gè)管家基因的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析,比對(duì)色譜圖和測(cè)序結(jié)果,找出雜合堿基,再將整理好的序列提交至MLST數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(https://pubmlst.org/calbicans/),與其相對(duì)應(yīng)的等位基因進(jìn)行比較,獲得每一個(gè)管家基因的位點(diǎn)編號(hào)。如此依次得到每一株菌株的全部7個(gè)管家基因的位點(diǎn)編號(hào),最后將這一組位點(diǎn)編號(hào)再次提交至該網(wǎng)站,獲得其給出的ST。

    1.2.5 遺傳多樣性和親緣性分析 (1)ST數(shù)與菌株數(shù)的相關(guān)性分析:采用SPSS 20.0軟件分別對(duì)耐藥菌株組和敏感菌株組的ST數(shù)與菌株數(shù)按季度分組,然后進(jìn)行一元線性回歸分析。分別計(jì)算2個(gè)組的ST數(shù)/菌株數(shù)比值,然后進(jìn)行χ2檢驗(yàn),判斷其是否有差異。(2)聚類樹的構(gòu)建:將所有菌株7個(gè)管家基因的等位基因位點(diǎn)編號(hào)組成數(shù)據(jù)組后錄入BioNumerics 7.6軟件,采用categorical法計(jì)算相似性系數(shù),采用非加權(quán)組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean,UPGMA)構(gòu)建聚類樹。(3)最小生成樹的構(gòu)建:采用BioNumerics 7.6軟件,以categorical法計(jì)算相似性系數(shù),構(gòu)建最小生成樹。在最小生成樹中,一個(gè)圈代表一個(gè)ST,圈的大小代表菌株數(shù)量的多少,圈旁的數(shù)字代表MLST type(ST),圈之間連線上的數(shù)字代表2個(gè)ST之間相同等位基因的數(shù)量,相同陰影下的圈屬于同一個(gè)ST群。

    2 結(jié)果

    2.1 MLST結(jié)果

    耐藥菌株組共有14種ST,其中9種共55株菌株MLST數(shù)據(jù)庫已登記,剩余5種共5株菌株可能為新的ST。耐藥菌株組主要的ST為ST310(18株)、ST1364(11株)、ST2551(11株)和ST135(9株),ST數(shù)/菌株數(shù)比值為0.23。敏感菌株組共有19種ST,其中12種共31株菌株MLST數(shù)據(jù)庫已登記,剩余7種共計(jì)7株菌株可能為新的ST。敏感菌株組主要的ST為ST2048(7株)和ST1474(6株),ST數(shù)/菌株數(shù)比值為0.50。將未從MLST數(shù)據(jù)庫獲得ST的菌株的ST暫命名為ST new1~ST new12,敏感菌株為ST new1~ST new7,耐藥菌株為ST new8~ST new12。2個(gè)組ST數(shù)/菌株數(shù)比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可見,耐藥菌株組ST的集中程度高于敏感菌株組。耐藥菌株組和敏感菌株組中MLST數(shù)據(jù)庫已登記的ST主要型別經(jīng)7個(gè)管家基因擴(kuò)增后得到的等位基因位點(diǎn)編號(hào)見表3。

    2.2 ST數(shù)與菌株數(shù)的相關(guān)性分析

    敏感菌株組和耐藥菌株組的ST數(shù)與菌株數(shù)在樣本不同收集時(shí)段(按季度分)的數(shù)量見表4。相關(guān)性分析顯示耐藥菌株組和敏感菌株組的ST數(shù)與菌株數(shù)均呈線性正相關(guān)關(guān)系(耐藥菌株組:r=0.995,P=0.005;敏感菌株組:r=0.989,P=0.011),見圖1。無論是敏感菌株還是耐藥菌株,其ST的種類均隨菌株數(shù)量的增加而增加,即耐藥菌株和敏感菌株的基因型均呈現(xiàn)出多克隆性的特征。

    表3 MLST數(shù)據(jù)庫已登記的ST經(jīng)7個(gè)管家基因擴(kuò)增后得到的等位基因位點(diǎn)編號(hào)

    2.3 親緣性分析

    敏感菌株組和耐藥菌株組ST的最小生成樹見圖2。由圖2可見,處于同一陰影下的ST其不同等位基因的數(shù)量不超過2個(gè),顯示其基因型具有較強(qiáng)的同源性。耐藥菌株組只形成了1個(gè)集中的陰影,而敏感菌株組形成了多個(gè)分散的陰影,且耐藥菌株組形成陰影覆蓋的高同源性ST的菌株數(shù)量高于敏感菌株組,提示耐藥菌株間的親緣性要近于敏感菌株。

    表4 各季度敏感菌株組和耐藥菌株組的ST型數(shù)與菌株數(shù)

    圖1 敏感菌株組和耐藥菌株組ST數(shù)與菌株數(shù)的相關(guān)性分析

    2.4 聚類分析

    耐藥菌株組等位基因及ST的聚類樹見圖3。在敏感菌株組中,ST2048和ST1474為優(yōu)勢(shì)型別,分別包含7株和6株菌株。在耐藥菌株組中,ST310、ST1364和ST2551為優(yōu)勢(shì)型別,分別包含18株、11株和11株菌株。由圖3可見,耐藥菌株的種群形成了多級(jí)分支,ST310、ST1364和ST2551同處于第1分支,ST135為第2分支,顯示其主要ST之間形成了較為明顯的聚類。

    圖2 敏感菌株組和耐藥菌株組ST的最小生成樹

    圖3 耐藥菌株組等位基因及ST的聚類樹

    3 討論

    MLST法是建立在管家基因測(cè)序基礎(chǔ)上的分型技術(shù),具有較高的分型能力、可分辨率和良好的重復(fù)性,可有效地分析出病原體的分子生物學(xué)種群特征和遺傳進(jìn)化的演進(jìn)過程。2002年,BOUGNOUX等[6]第1次將MLST法用于白念珠菌的分型研究。隨后,多次改進(jìn)其管家基因選擇的組成,在綜合了TAVANTI等[7]的研究成果后,BOUGNOUX等[8]得出了白念珠菌最佳的7個(gè)管家基因位點(diǎn)組合,即AAT1a+ACC1+ADP1+MPⅠb+SYA1+VPS13+ZWF1,這也成為以后大多數(shù)白念珠菌MLST研究采用的實(shí)驗(yàn)方案,同時(shí)也是本研究采用的方案。

    本研究采用MLST法對(duì)從上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院白念珠菌性陰道炎患者白帶樣本中分離的對(duì)唑類抗菌藥物耐藥的白念珠菌進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)的主要流行病學(xué)特征為:(1)無論是耐藥菌株還是敏感菌株,其基因型均表現(xiàn)為多克隆性,這與郭雅莉等[9]的研究結(jié)果較為一致,而且這2種菌株都表現(xiàn)出隨著菌株數(shù)量的增加,其基因型多樣化趨勢(shì)更為明顯的特征,個(gè)別ST在耐藥菌株組和敏感菌株組中均存在;(2)耐藥菌株ST數(shù)/菌株數(shù)比值低于敏感菌株,因此其基因型集中度高于敏感菌株,這與王志恒等[10]的研究結(jié)果較為一致;(3)耐藥菌株中幾個(gè)主要的基因型之間均存在較近的親緣性,而敏感菌株這個(gè)特征卻不太明顯,耐藥菌株組的ST76、ST310、ST1364和ST2551形成的覆蓋面較廣的菌株之間最多有2個(gè)位點(diǎn)不同的ST群,這個(gè)情況在有關(guān)分離自白念珠菌性陰道炎患者的對(duì)唑類抗菌藥物耐藥菌株的ST研究中未見相同報(bào)道[9-10];(4)聚類樹是根據(jù)數(shù)據(jù)組特征計(jì)算各個(gè)菌株數(shù)據(jù)組的相似度,根據(jù)相似度來進(jìn)行聚類,以此揭示菌株的ST及其聚類特征,并展示所有的菌株信息。聚類分析顯示耐藥菌株的第1聚類分支中的ST為ST310、ST1364和ST2551,這是菌株數(shù)量最多的3種ST。由此可見,本研究中對(duì)唑類抗菌藥物耐藥的白念珠菌的主要基因型別之間存在著較強(qiáng)的遺傳同源性,即各菌株間可能存在相同或相似的耐藥機(jī)制或耐藥基因[11]。

    MLST法最大的優(yōu)勢(shì)就是通過在互聯(lián)網(wǎng)上建立數(shù)據(jù)庫實(shí)現(xiàn)信息共享,使不同實(shí)驗(yàn)室之間可以不通過交換菌種,僅需通過比對(duì)數(shù)據(jù)庫內(nèi)的信息就可發(fā)現(xiàn)各自調(diào)查范圍內(nèi)的病原體的分子流行病學(xué)特征,并能通過新增數(shù)據(jù)信息,發(fā)布各自發(fā)現(xiàn)的新基因型。

    綜上所述,本研究采用MLST法分析了從上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院白念珠菌性陰道炎患者白帶樣本中分離的白念珠菌的分子流行病學(xué)特征,發(fā)現(xiàn)敏感菌株組與耐藥菌株組之間ST分布存在明顯差異,且2個(gè)組之間ST分布集中程度也不同。通過MLST數(shù)據(jù)庫將本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)本研究收集到的菌株,尤其是耐藥菌株的ST與其他研究發(fā)布的ST有一定的差異。由此可見,同種病原體在不同地域之間的流行特征有一定差異,可為臨床醫(yī)生診斷和治療該類疾病提供更多的參考。

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