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    熊果酸對肝纖維化大鼠NOX2/ROS/NLRP3炎性小體活化的影響

    2018-03-29 05:41:47黃晨愷甘達凱羅方云汪安江李弼民
    關(guān)鍵詞:小體果酸膠原

    黃晨愷,甘達凱,張 望,羅方云,陳 江,汪安江,李弼民*,朱 萱*

    (1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科;2.江西省消化研究所, 江西 南昌 330006)

    核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族吡啉結(jié)構(gòu)域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎性小體與肝纖維化相關(guān)[1]。NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)產(chǎn)生的活性氧簇(ROS)作為NLRP3炎性小體活化的重要因素之一,參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[2]。熊果酸(ursolic acid,UA)是從藥用植物中提煉出的一種天然三萜類化合物,具有抗菌、抗病毒和保護肝損傷等藥理活性。本課題組前期體外實驗證實,UA能抑制肝臟中TGF-β的表達,下調(diào)HSC-T6細胞中的NOX各亞基的表達,抑制NOX活性,進而下調(diào)下游促纖維化信號通路,減少I型膠原的產(chǎn)生[3- 4]。但UA是否通過抑制肝臟NOX2/ROS/NLRP3炎性小體活化而減少肝內(nèi)膠原沉積尚無文獻報道。因此,本文將進一步探討UA減少肝內(nèi)膠原沉積是否與其抑制肝臟NOX2/ROS/NLRP3炎性小體活化有關(guān)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑:熊果酸(ursolic acid,UA,Sigma公司);蛋白提取試劑盒(貝博生物有限公司);ALT檢測試劑盒和ROS檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所); mRNA引物(上海捷瑞生物工程有限公司);天狼星紅(Sirius-Red)染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司);總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(Tiangen公司); 兔抗鼠NLRP3多克隆抗體(CST公司);兔抗鼠NOX2多克隆抗體(Abcam公司)、兔抗鼠caspase- 1多克隆抗體(Abcam公司);兔抗鼠caspase- 1 p10多克隆抗體、兔抗鼠IL- 1β多克隆抗體(Santa-cruz公司);小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(中杉金橋有限公司)。

    1.1.2 實驗動物:SPF級雄性純系8周齡SD大鼠18只,體質(zhì)量250~300 g[萊克景達實驗動物有限公司提供,許可證號:SCXK(湘)2013- 0004]。將大鼠飼養(yǎng)于適宜環(huán)境中,自由采食和飲水。

    1.2 方法

    1.2.1 大鼠分組與處理:分為對照組(CON,n=6,2 mL/kg橄欖油灌胃8周,結(jié)束后繼續(xù)給予0.9%氯化鈉溶液灌胃4周),肝纖維化組(CCl4,n=6,2 mL/kg 20% CCl4灌胃8周,每周2次,結(jié)束后繼續(xù)給予0.9%氯化鈉溶液灌胃4周)[5]及熊果酸治療組(UA-T,n=6,完成肝纖維化造模后每天用40 mg/kg劑量熊果酸混懸液灌胃4周)。各組藥物處理結(jié)束72 h后,用真空采血管留取門脈血待用;取下肝臟,留取新鮮肝臟組織待用,將其余組織固定于10%甲醛固定液中,常規(guī)脫水包埋。

    1.2.2 大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的測定:按試劑盒說明書步驟操作,設(shè)置測定管與對照管,使用分光光度計在波長505 nm處測定各管吸光度(A)值。絕對(A)值=測定管(A)值-對照管(A)值。查標準曲線,求得各組樣本血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)含量(U/L)。

    1.2.3 HE及天狼星紅染色:控制切片厚度為6 μm,常規(guī)脫蠟。將切片進行HE染色,中性樹膠封固,顯微鏡下觀察,采用Ishak肝纖維化評分系統(tǒng)[6]對切片進行評分;天狼星紅染色液滴染1 h。流水沖洗。Mayer蘇木精染色液染細胞核8 min。流水沖洗10 min。常規(guī)脫水透明,中性樹膠封固。顯微鏡下觀察肝內(nèi)膠原沉積。

    1.2.4 RT-qPCR檢測Nox2、Nlrp3、caspase- 1及IL- 1β mRNA表達:分別取肝纖維化組及對照組小鼠的肝組織100 mg用吸附柱法提取肝組織總RNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性,并用分光法測定RNA 含量。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后以cDNA為模板進行qPCR反應(yīng)。步驟嚴格按說明書操作。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔,以每個組織樣本各指標的循環(huán)數(shù)計作Ct值,最終以2-ΔΔCt值評估相對表達量。引物序列見表1。

    表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Gene primer sequence for RT-qPCR

    1.2.5 Western blot檢測NOX2、NLRP3、caspase- 1、及IL- 1β蛋白表達:提取肝臟組織總蛋白后采用8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,條件為濃縮膠60 V、1 h,分離膠100 V、2 h。電泳完成后將凝膠中的蛋白通過濕法電轉(zhuǎn)移方法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上;將NC膜于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。將NC膜分別與抗NOX2 (1∶1 000)、抗NLRP3 (1∶1 000)、抗caspase- 1 p10(1∶1 000)和p45(1∶400)及抗IL- 1β(1∶200)多抗稀釋液或抗β-actin單抗(1∶1 000)稀釋液4 ℃孵育過夜。次晨將膜取出,用TBST洗膜3次,每次5 min。洗膜結(jié)束后與辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG稀釋液(1∶2 000)4 ℃孵育4 h,化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色。用Image lab分析系統(tǒng)進行曝光及灰度值掃描,將每組所測的蛋白條帶吸光度值分別與相對應(yīng)的β-actin的吸光度值相比較,計算出兩者的吸光度值比。

    1.2.6 免疫組化檢測NLRP3、caspase- 1及IL- 1β蛋白表達:切片常規(guī)脫蠟、水化,對各組肝臟組織切片進行預(yù)處理,檸檬酸鹽熱修復(fù);運用3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,孵育8 min;分別滴加兔抗鼠NLRP3、caspase- 1或IL- 1β多抗,4 ℃孵育過夜;滴加山羊抗兔IgG 37 ℃孵育30 min;在顯微鏡下進行DAB顯色,控制反應(yīng);雙蒸水沖洗終止反應(yīng);漂洗,復(fù)染,封片。在胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)黃、棕色顆粒判定為陽性細胞。每組任取6張切片,每張切片任意選取5個視野,將結(jié)果輸入image-proplus軟件,如陽性細胞少于5%,記0分;5%~25%,記1分;26%~50%,記2分;51%~75%,記3分;大于75%,記4分[7]。

    1.2.7 肝臟組織中ROS的測定:取新鮮肝臟組織300 mg配制蛋白上清液;按10 nmol/L DCFH-DA∶PBS=1∶9的比例配制成1 mmol/L DCFH-DA工作液,加入配制好的蛋白上清液,用等量PBS溶液設(shè)置對照孔。移液槍吸打混勻,37 ℃孵育30 min,激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長525 nm,測定其熒光強度。測定結(jié)果以熒光強度/毫克蛋白表示。ROS(熒光強度/毫克蛋白)= 熒光強度/(蛋白濃度×0.19)。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 UA對肝纖維化大鼠ALT的影響

    CCl4模型組血清ALT含量顯著高于對照組(P<0.05);UA治療組血清ALT含量明顯低于CCl4模型組(P<0.05)(表2)。

    表2 各組大鼠血清ALT含量Table 2 Serum ALT analysis of each n=6)

    *P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with CCl4group.

    2.2 UA對肝纖維化大鼠肝臟病理形態(tài)及膠原沉積的影響

    與對照組相比,CCl4模型組肝臟內(nèi)有纖維間隔形成,膠原沉積明顯;與CCl4模型組相比,UA治療組肝臟內(nèi)纖維間隔明顯減少,Ishak’s肝纖維化評分降低,膠原沉積減輕(P<0.05)(圖1,2)。

    2.3 UA對肝纖維化大鼠NOX2及NLRP3炎性小體mRNA表達的影響

    CCl4模型組,Nox2、Nlrp3、caspase1和IL- 1β mRNA表達均較對照組明顯上升(P<0.05);UA治療組Nox2、Nlrp3、caspase1和IL- 1β mRNA表達量均較CCl4模型組顯著下降(P<0.01)(圖3)。

    2.4 UA對肝纖維化大鼠NOX2/NLRP3炎性小體活化的影響

    各組WB吸光度值比較見圖4A。CCl4模型組肝組織內(nèi)NOX2蛋白的含量顯著高于對照組(P<0.01),UA治療組NOX2的表達量出現(xiàn)明顯下降(P<0.01)(圖4B);CCl4模型組NLRP3(P<0.01)及caspase- 1 p10(P<0.05)亞基的表達出現(xiàn)顯著上升;UA治療組兩者的表達均較模型組顯著下降(P<0.05)(圖4C,D); CCl4模型組的IL- 1β蛋白表達量也較正常組也出現(xiàn)顯著上升(P<0.01)(圖4F)。各組caspase- 1 P45結(jié)果并無差異(P>0.05)(圖4E)。各組肝臟免疫組化結(jié)果顯示,UA治療組NLRP3、caspase- 1及IL- 1β的表達均較CCl4模型組減少(P<0.05)(圖5)。

    HE (×100) and sirius-red staining (×200) were used to analysis the liver pathological characteristics and the collagen deposition in liver tissues, respectively

    圖1肝組織HE及天狼星紅染色
    Fig1HEandsirius-redstainingoflivertissues

    *P<0.05 compared with CCl4 model group圖2 各組大鼠肝纖維化Ishak評分Fig 2 Ishak’s fibrosis score of each group

    *P<0.05 compared with control group;#P<0.01 compared with CCl4model group

    圖3肝組織中Nox2、Nlrp3、caspase-1及
    IL-1βmRNA的表達

    A-F are Western blot of NOX2, NLRP3, caspase- 1 (p10 & p45), and IL- 1β protein levels;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.05,##P<0.01 compared with CCl4model group

    NLRP3 & IL- 1β were identified(×200); caspase- 1 was identified(×400)圖5 免疫組化檢測各組肝組織中NLRP3、caspase- 1及IL- 1β的表達Fig 5 Immunohistochemistry analysis of NLRP3, caspase- 1 and IL- 1β expression in each group

    2.5 UA對肝纖維化大鼠肝組織中ROS的影響

    CCl4模型組大鼠肝組織中ROS的水平顯著高于對照組(P<0.05);而與CCl4模型組相比,UA治療組中ROS水平顯著減少(P<0.05)(圖6)。

    *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with CCl4 model group圖6 各組新鮮肝組織內(nèi)ROS的熒光強度Fig 6 ROS fluorescence intensity of liver tissue

    3 討論

    UA對肝臟損傷有保護作用,但具體機制尚未闡明[8]。早期肝纖維化過程中細胞外基質(zhì)過度沉積是肝纖維化的標志之一,主要表現(xiàn)為肝內(nèi)纖維間隔的產(chǎn)生和膠原沉積[9]。本課題組大量前期研究發(fā)現(xiàn)熊果酸可以抑制肝星狀細胞中JAK2/STAT3[10]、PI3K/Akt[3]及ERK1/2信號通路[11],激活蛋白1(AP- 1)和核因子-κB(NF-κB)的表達而抑制HSC活化。本次體內(nèi)實驗中,肝纖維化大鼠血清ALT水平顯著上升,肝內(nèi)有大量纖維間隔產(chǎn)生,Ishak纖維化評分升高,膠原沉積明顯增多。在給予UA灌胃后肝纖維化大鼠血清ALT水平顯著降低,肝內(nèi)纖維間及膠原沉積得到明顯改善,Ishak纖維化

    評分下降。說明UA可以保護肝細胞,抑制肝內(nèi)膠原沉積,改善肝纖維化。

    NOX2/ROS/NLRP3炎性小體活化是肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中重要的信號通路之一[12],在肝纖維化中的作用尚未闡明。NLRP3炎性小體是一種NLRP3、CARD區(qū)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,包括CARD,ASC)及半胱天冬酶1前體(pro-caspase- 1)組合而成的蛋白質(zhì)復(fù)合體[13]。NOX2通過DAMP途徑產(chǎn)生的ROS是導(dǎo)致NLRP3炎性小體活化的重要因子之一[14]。當胞內(nèi)NLRP3受到胞內(nèi)ROS刺激后會使無活性的caspase- 1前體(pro-caspase- 1)活化為有活性的caspase- 1,而caspase- 1可以將無活性IL- 1β前體(pro-IL- 1β)及IL- 18前體(pro-IL- 18)剪切為IL- 1β及IL- 18并釋放到胞外,從而引發(fā)下游炎性效應(yīng)[15]。實驗顯示,UA可以抑制NOX2產(chǎn)生的ROS,使下游NLRP3炎性小體中caspase- 1活化及釋放受限,導(dǎo)致IL- 1β成熟及釋放減少。這說明UA很可能通過NOX2/ROS/NLRP3炎性小體活化信號通路改善肝內(nèi)膠原沉積。另一方面,在RT-qPCR實驗中,肝臟內(nèi)Nox2、Nlrp3、Il- 1β的mRNA水平與蛋白印記結(jié)果一致,但UA治療組caspase1的mRNA水平被顯著抑制,而caspase- 1 p45亞基(pro-caspase- 1)的蛋白印記結(jié)果各組間對比后并無統(tǒng)計學(xué)差異(圖4E)。據(jù)此推測,UA不只在mRNA水平抑制caspase1的轉(zhuǎn)錄翻譯過程,可能是在蛋白質(zhì)水平抑制NLRP3炎性小體中caspase- 1的成熟活化過程。但這仍需要進一步驗證。

    綜上所述,UA能發(fā)揮肝臟保護作用,改善肝纖維化,其機制可能是通過調(diào)控NOX2/ROS/NLRP3活化,減少IL- 1β的釋放,保護肝細胞,減少肝內(nèi)膠原沉積實現(xiàn)的。

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    新聞點擊

    懷孕可能會刺激婦女的腦部變化

    據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 12- 20)報道,新手媽媽經(jīng)常說她們自己是“嬰兒大腦”,這似乎是伴隨著懷孕與分娩的一種新想法,而新研究認為這是正確的。

    西班牙研究者報告指出,懷孕引起婦女腦部的長期變化,或許是為了提高她保護和養(yǎng)育孩子的能力。

    研究者使用MRI掃描比較25名婦女在第一次懷孕前后的腦部結(jié)構(gòu)。

    研究發(fā)現(xiàn),分娩后,婦女腦部與社會互動有關(guān)的灰質(zhì)區(qū)域顯著減少,這些腦部區(qū)域與母親看自己嬰兒圖像時活化的腦部區(qū)域重疊。

    共同作者Erika Barba認為,這些變化的腦部區(qū)域,與面對當母親的挑戰(zhàn)所必需的功能相關(guān)。

    雖然有些母親預(yù)期會抱怨自己思維不清晰,研究者報告指出,孕婦在記憶或其他思考功能方面沒有改變。這意味著,灰質(zhì)的損失不會導(dǎo)致這些區(qū)域的問題。

    研究作者認為,腦部的變化會持續(xù)到分娩后至少兩年,或許可幫助她們適應(yīng)母親的角色。

    研究共同負責(zé)人Oscar Vilarroya認為,研究結(jié)果指出一個適應(yīng)過程,其幫助關(guān)乎更佳地辨識孩子的需要,如確定新生兒的情緒狀態(tài)。此外,他們提供了有關(guān)母親的神經(jīng)基礎(chǔ)、產(chǎn)期前后的心理健康和腦部的一般可塑性等主要線索。

    研究的共同第一作者Elseline Hoekzema指出,這些變化至少有一部分可以反映出“突觸修剪機制”,弱的突觸被消除,將路徑轉(zhuǎn)給更有效和特定的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

    無論婦女是自然懷孕還是通過生育治療受孕,這些變化是相似的。

    該研究發(fā)表于2016- 12- 19NatureNeuroscience。

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