乳腺癌組織中JARID1B/KDM5B的表達(dá)與血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞相關(guān)性

趙麗華，位 嘉，槐英麗，張曉敬，張 超，林秋蘭，王克杰，閆紅燕，郭家良，李秋穎

(民航總醫(yī)院 病理科，北京 100123)

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤，尋找一種無創(chuàng)、敏感的方法監(jiān)測腫瘤進(jìn)展情況，及時(shí)調(diào)整治療方案是目前治療中亟待解決的問題。

1896 年在一例因腫瘤死亡的患者外周血中發(fā)現(xiàn)了類似腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞， 并提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)這一概念。 CTC 的定義為自發(fā)或因診治過程中導(dǎo)致原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移病灶播散進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[1]。在外周血中約每106～107個白細(xì)胞中可能僅有1個CTC[2]。CTC檢測被看作液體活檢，對于腫瘤患者的預(yù)后判斷、療效評價(jià)以及個體化治療均有重要的指導(dǎo)作用[3]。

本研究應(yīng)用將FISH與免疫熒光抗體技術(shù)相結(jié)合，探討檢測乳腺癌腫瘤組織中JARID1B/KDM5B的表達(dá)是否可以作為患者腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)監(jiān)測的指標(biāo)之一。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象：收集2014—2016年民航總醫(yī)院術(shù)前37例影像學(xué)診斷可疑乳腺癌患者，患者年齡介于32～61歲，平均年齡43歲，經(jīng)知情同意告入選此課題，患者術(shù)前未做任何治療，于術(shù)前抽取5 mL外周靜脈血，應(yīng)用imFISH方法進(jìn)行外周血液循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測，術(shù)中行冰凍病理檢查，其中35例患者確診為浸潤性乳腺癌，術(shù)后腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測腫瘤組織中組蛋白去甲基化酶JARID1B/KDM5B的表達(dá)，該項(xiàng)目已通過民航總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑：鼠抗P16單抗和S-P免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；鼠抗JARID1B/KDM5B單抗(DAKO生物試劑公司)。

1.2 方法

1.2.1 病理診斷依據(jù)：所有病理切片由兩位副高級以上病理學(xué)專家依據(jù)2016版WHO標(biāo)準(zhǔn)診斷。

1.2.2 病理診斷標(biāo)準(zhǔn)：兩名醫(yī)師依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO，2016版)的分類系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤組織分型及分級，所有患者根治性術(shù)后石蠟病理診斷為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ-Ⅲ級。

1.2.3 免疫組化S-P法檢測和結(jié)果判定：JARID1B/KDM5B陽性物質(zhì)定位于細(xì)胞核，JARID1B/KDM5B陽性細(xì)胞絕對值計(jì)數(shù)時(shí)注意選取陽性細(xì)胞高度密集的區(qū)域，并且取顯微鏡下4個高倍鏡視野的平均值。依據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)：0級：≤10%；1級：10%～25%；2級：25%～50%；3級：50%～75%；4級：>75%。依據(jù)染色強(qiáng)度：1)弱陽性；2)中等強(qiáng)度陽性；3)強(qiáng)陽性。IHC最終得分：0：陰性(-)；1～4：弱陽性(+)；5～8：中等強(qiáng)度陽性(++)；9～12：強(qiáng)陽性(+++)。病理切片由兩名以上副主任醫(yī)師閱片，進(jìn)行病例的篩選、分組及免疫組化等陽性結(jié)果的判定。

1.2.4 imFISH(免疫熒光原位雜交)法檢測:陰性富集：每例患者的采血抽取外周血至ACD抗凝管中，立即顛倒混勻8次,采用萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司的陰性富集法對外周血3.2mL進(jìn)行獲取CTC處理，具體操作如下：1)離心去除血漿蛋白：用CS1溶液將離心管內(nèi)液體體積分別補(bǔ)充至45 mL(650×g離心5 min)，去上清至12 mL；2)去除紅細(xì)胞：兩管分別加CS2溶液至45 mL。將離心管置于垂直混勻儀混勻，室溫8 min(650×g離心5 min)，棄上清至1～2 mL；3)去除白細(xì)胞：按每管100 μL的比例，將偶聯(lián)了抗人白細(xì)胞表面抗原單克隆抗體組合群的免疫磁微粒緩慢加入上述樣本中，固定于搖床上，室溫?fù)u動20 min；4)涂片：最后經(jīng)離心、富集，去除上清液后，剩余100 μL細(xì)胞懸液，將細(xì)胞涂于特殊載玻片上，使用固定液CF1對標(biāo)本固定，過夜干燥。

imFISH鑒別CTC:熒光原位雜交選用CEP8/CEP17兩種標(biāo)志物(雅培)。標(biāo)本脫水后，加入預(yù)混的CEP8/CEP17探針10 μL，蓋上蓋玻片，放入雜交儀(DAKO)，進(jìn)行75 ℃變性5 min、雜交1.5 h。CD45免疫熒光染色1 h，滴加DAPI，封片。

在自動掃描及分析系統(tǒng)(Cyttel PathfinderTM系統(tǒng))下對標(biāo)本區(qū)進(jìn)行自動掃描及分析，CEP8/CEP17均以信號點(diǎn)≥3個為陽性，而滿足CEP8+/CD45-/DAPI+或CEP17+/CD45-/DAPI+的細(xì)胞視為陽性細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0(SPSS Inc. Chicago, IL, USA)軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗(yàn)Spearman’s等級相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

35例確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者中CTC檢測陽性病例(CTC數(shù)目≥2)27例，陰性病例(CTC數(shù)目<2)8例，上述病例相對應(yīng)癌組織中的JARID1B/KDM5B免疫組化結(jié)果見表1，JARID1B/KDM5B的陽性表達(dá)強(qiáng)度與患者血液學(xué)患腫瘤細(xì)胞數(shù)(CTC)呈正相關(guān)(P<0.01)(圖1A～C)。

表1 KDM5B的表達(dá)與循環(huán)腫瘤細(xì)胞相關(guān)性的分析

rs=0.509,*P<0.01.

3 討論

通常把進(jìn)入人體外周血的腫瘤細(xì)胞稱為CTC，迄今已有證據(jù)表明惡性腫瘤在早期就有癌細(xì)胞脫落進(jìn)入到循環(huán)系統(tǒng)，這些脫落的癌細(xì)胞自原發(fā)灶脫落后進(jìn)入到血循環(huán)，再穿透血管壁到繼發(fā)部位種植，但它們必須逃避機(jī)體的免疫監(jiān)測，并在多種因子作用下刺激腫瘤血管生成才可能形成轉(zhuǎn)移灶。血循環(huán)中檢測到CTC 并不意味著有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，但轉(zhuǎn)移的概率會大大增加[4]。CTC檢測技術(shù)應(yīng)用于多種腫瘤的檢測中，對138例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者在治療前和治療后10周進(jìn)行影像學(xué)評估，發(fā)現(xiàn)20例(14%)影像學(xué)進(jìn)展且CTC<5的患者中位OS明顯長于22例(16%)影像學(xué)進(jìn)展且CTC≥5的患者；影像學(xué)評價(jià)在2位影像科醫(yī)師之間的變異率為15.2%，而CTC在不同實(shí)驗(yàn)室評價(jià)的變異率僅為0.7%。結(jié)果顯示CTC評估比現(xiàn)有影像學(xué)方法更早、重復(fù)性更好用于指示疾病情況[5]。在前瞻性、雙盲和多中心大型臨床研究中[6]，第一次證實(shí)了CTC檢測在中國轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的應(yīng)用價(jià)值，研究證實(shí)CTC水平與轉(zhuǎn)移部位、激素受體狀態(tài)及HER- 2狀態(tài)相關(guān)，首次隨訪的CTC數(shù)目也可預(yù)測PFS及OS。CTC檢測作為標(biāo)準(zhǔn)的影像學(xué)檢查手段之外的輔助評估方法， 其優(yōu)勢在于能更早判斷疾病進(jìn)展，為患者及時(shí)調(diào)整治療方案提供更多幫助。

A.invasive breast carcinoma HE high magnification； B.the strong expression of JARID1B/KDM5B in cancer tissues S-P method high magnification； C.CTC 7 imFISH high magnification

圖1乳腺癌組織學(xué)及循環(huán)腫瘤細(xì)胞
Fig1BreastcarcinomatissueandCTC(×200)

組蛋白去甲基化酶JARID1B/KDM5B最初是在乳腺癌中過度表達(dá)而分離得到的， JARID1B/KDM5B在乳腺癌中的表達(dá)與ER陽性具有很強(qiáng)的相關(guān)性，廣泛地表達(dá)在ER陽性的乳腺癌和乳腺癌細(xì)胞系，有研究證實(shí)JARID1B/KDM5B蛋白的陽性表達(dá)率與乳腺癌腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、R&B評分呈正相關(guān)性[7]。

本研究應(yīng)用imFISH方法初步證實(shí)聯(lián)合CTC的檢測及乳腺癌組織中JARID1B/KDM5B的表達(dá)，對判斷腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移具有一定的預(yù)測價(jià)值，鑒于JARID1B/KDM5B在乳腺癌組織與正常組織中表達(dá)的差異性，JARID1B/KDM5B也可能會成為乳腺癌治療的一個新靶標(biāo)。

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新聞點(diǎn)擊

孤獨(dú)會降低乳腺癌幸存率

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 12- 19)報(bào)道，最新研究指出，孤獨(dú)可能會降低乳腺癌幸存率。

研究人員發(fā)現(xiàn)，在治療幾年后，相較于愛交朋友或支持網(wǎng)絡(luò)的女性來說，那些沒有強(qiáng)烈社會關(guān)系的女性比較容易癌癥復(fù)發(fā)或死亡。

研究人員評估了近10 000萬名乳癌患者的資料后發(fā)現(xiàn)，相較于與喜歡社交的女性來說，孤立的女性癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加40%。

美國癌癥協(xié)會的主任Kassandra Alcaraz認(rèn)為，人是社交性動物，從與他人的關(guān)系中獲益，成為群落中的一部分并不令人意外。我們知道社交關(guān)系對健康來說很重要。

但這一結(jié)果并不代表孤獨(dú)的人注定會早死，也不是說孤獨(dú)與幸存率差有因果關(guān)系。

這篇報(bào)告刊登在2016- 12- 19的《癌癥》中。