微量采血法較常規(guī)采血法的技術(shù)與優(yōu)勢(shì)

吳筱琴，鐘 聲，孫 鍇，黃孫峰，張 怡，欣 堅(jiān)，崔 立

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240； 2.上海羅氏創(chuàng)新中心，上海 201203)

小鼠體型小，生長(zhǎng)繁殖快，成本低，易于操作和控制，是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)尤其是藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)常用動(dòng)物。在各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，為了評(píng)價(jià)藥物、新化合物等的藥理學(xué)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征，常在一定時(shí)間內(nèi)多次采集動(dòng)物血液[1]。目前，小鼠常用的采血方法有眼眶后靜脈叢采血法，眼球摘除采血法，心臟采血法，尾靜脈采血法等[2]。據(jù)研究報(bào)道，采血本身會(huì)引起動(dòng)物應(yīng)激，某些采血方法甚至?xí)饎?dòng)物局部組織的嚴(yán)重?fù)p傷甚至是動(dòng)物死亡[3-4]。其中，小鼠眼眶后靜脈叢采血是目前最常用的小鼠連續(xù)多次采血方法[5]，其采血量可滿足藥代、藥效等常用指標(biāo)的分析。但在實(shí)際應(yīng)用中，眼眶靜脈叢采血會(huì)造成動(dòng)物眼睛局部的嚴(yán)重?fù)p傷、甚至是失明，采血過(guò)程中動(dòng)物表現(xiàn)明顯痛苦，需要麻醉，且所需動(dòng)物數(shù)量較大、采血量較多，因此該采血方法不完全符合動(dòng)物福利3R原則。近年來(lái)，生物分析儀器靈敏度有大幅提高。以本實(shí)驗(yàn)使用的三重四極桿質(zhì)譜靈敏度為例，Triple Quad 5500比API 4000靈敏度提到了5～10倍。這就從技術(shù)上實(shí)現(xiàn)了能夠支持微量血液樣品的生物分析[6]。但目前，以微量采血進(jìn)行生物分析及藥代動(dòng)力學(xué)研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。而在這一研究領(lǐng)域，于小鼠后肢隱靜脈采血國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次建立了小鼠后肢隱靜脈微量采血的新方法。該方法所需動(dòng)物數(shù)量顯著減少，同時(shí)動(dòng)物表現(xiàn)痛苦小，無(wú)需麻醉，對(duì)動(dòng)物局部組織的損傷較小，并可重復(fù)采血，采血量小。與常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法比較，所獲得的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)一致，無(wú)明顯差異。因此在小鼠藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中隱靜脈微量采血法完全可以替代現(xiàn)有的常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法，且更加符合動(dòng)物福利3R原則。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性CD-1小鼠92只，6～8周齡，體重20～25 g；由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[SCXK (滬) 2012-0002]。本實(shí)驗(yàn)在上海美迪西生物醫(yī)藥有限公司SPF動(dòng)物房進(jìn)行[SYXK (滬) 2015-0026]，動(dòng)物房恒溫恒濕(溫度21℃～23℃，濕度40%～60%)，光照時(shí)間8:00～20:00。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，小鼠在動(dòng)物房中適應(yīng)至少5 d。本實(shí)驗(yàn)由上海羅氏創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)號(hào)：RICS-20150921。

1.2 主要試劑與儀器

給藥溶液的配置：靜脈注射溶液由5%(w/v)二甲基亞砜(DMSO)、40%(w/v)聚乙二醇(PEG 400)和55%(w/v)生理鹽水配制；口服溶液由2%(w/v)羥丙基纖維素、0.1%(w/v)聚山梨醇酯(polysorbate 80)和0.1%(w/v)對(duì)羥基苯甲酸甲酯的水溶液配制；色譜級(jí)乙腈、甲醇：Thermo Fisher公司；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑純度均為色譜級(jí)別。

麻醉機(jī)：Matrx公司，型號(hào)91805060；超高效液相色譜儀(UPLC-MS/MS)：Shimadzu公司，型號(hào)Nexera LC System；三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：AB SCIEX公司，型號(hào)5500；Chromolith FastGradient RP-18 Endcapp(50×2.0 mm)色譜柱：默克公司；離心機(jī)：梅特勒公司，型號(hào)5424，Beckman公司，型號(hào)Allegra 64R；電子天平：梅特勒公司，型號(hào)XP205DR；微量采血毛細(xì)管：Sarstedt Ag & Co.公司，型號(hào)Minivette POCT；滅菌注射針及注射器：上海米沙瓦公司，型號(hào)4.5和6號(hào)；一次性抗凝管及一次性血樣采集針：江蘇康健公司；酒精棉球等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將92只CD-1小鼠分別隨機(jī)編號(hào)并稱重，分為16組。分別單次給予靜脈注射(intravenous injection，IV)1 mg/kg以及口服灌胃(oral gavage，PO)10 mg/kg的模型化合物A、B、C、D。

① 常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法：靜脈注射每組9只動(dòng)物，口服灌胃每組8只動(dòng)物；

② 后肢隱靜脈微量采血法：靜脈注射、口服灌胃每組均3只動(dòng)物。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.2 采血時(shí)間點(diǎn)

靜脈給藥組：于給藥后5 min、15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、7 h、24 h采集樣品，共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

口服給藥組：于給藥后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、7 h、24 h采集樣品，共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

對(duì)于常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法，因采血量較大(每只各時(shí)間點(diǎn)150 μL)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行間隔采血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采用3只動(dòng)物，每只動(dòng)物最多采集不超過(guò)3次，具體采血安排見(jiàn)表2。

對(duì)于隱靜脈微量采血法，采血量小(每只各時(shí)間點(diǎn)30 μL)，在全部3只動(dòng)物中采集所有時(shí)間點(diǎn)的樣品。

表2 動(dòng)物間隔采血安排Tab.2 Time points of blood collection

注：“√”為該采血點(diǎn)所使用動(dòng)物。

Note. “√” indicates the animals for blood collection at that time point.

1.3.3 采血方法

(1)常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法：將小鼠放入異氟烷麻醉箱進(jìn)行吸入麻醉后，左手抓緊小鼠頸部皮膚固定頭部，并輕輕向下壓迫頸部?jī)蓚?cè)，以突出小鼠眼球并使眼球充血，右手用事先準(zhǔn)備好的一次性血樣采集針針頭頂端(針尖斜面朝內(nèi))垂直插入外眥，見(jiàn)針管有血液后，保持此位置連接離心管，血液便會(huì)連續(xù)不斷地滴入，當(dāng)血液量達(dá)到150 μL時(shí)拔出采集針立即用滅菌干棉球壓迫止血。

(2)隱靜脈微量采血法：小鼠無(wú)需麻醉，實(shí)驗(yàn)前先將小鼠后肢部位剃毛，將小鼠放入合適的固定器中，露出后肢，酒精棉球擦拭采血部位消毒后，將滅菌注射針頭迅速刺入后肢隱靜脈，血液流出，用微量采血毛細(xì)管收集30 μL血液于離心管中。采血結(jié)束，立即用滅菌干棉球壓迫止血。

1.3.4 小鼠疼痛評(píng)估

小鼠在隱靜脈微量采血過(guò)程中，根據(jù)國(guó)際NC3RS“小鼠痛苦表情評(píng)分”及遵循AAALAC《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南(第八版)》，通過(guò)觀察小鼠的表情、外貌表現(xiàn)(被毛、理毛行為、眼睛、軀干體姿、呼吸)、飲食和排泄、行為(合群情況、運(yùn)動(dòng)、性格、聲音)及臨床癥狀(心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng))評(píng)估和判定小鼠的疼痛程度。此評(píng)估僅適用于清醒動(dòng)物，因常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法動(dòng)物表現(xiàn)明顯痛苦，實(shí)施麻醉，未進(jìn)行疼痛評(píng)分。

1.3.5 血漿樣品處理

(1)常規(guī)采血法血漿樣品處理：取小鼠血漿樣品20 μL，加入60 μL冰乙腈進(jìn)行1∶4(v/v)蛋白沉淀，渦旋使其充分混合后在4℃條件下以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后，取上清液進(jìn)樣到AB Sciex Triple Quad 5500 MS/MS系統(tǒng)使用電噴霧離子化模式進(jìn)行分析。進(jìn)樣體積均為2 μL。

(2)微量采血法血漿樣品處理：取小鼠血漿樣品5 μL，加入95 μL冰乙腈進(jìn)行1∶20(v/v)蛋白沉淀，渦旋使其充分混合后在4℃條件下以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后，取上清液進(jìn)樣到AB Sciex Triple Quad 5500 MS/MS系統(tǒng)使用電噴霧離子化模式進(jìn)行分析。進(jìn)樣體積均為1 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Phoenix軟件計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括AUC(藥時(shí)曲線下面積)、t1/2z(消除半衰期)、Cmax(峰濃度)、Tmax(達(dá)峰時(shí)間)、MRT(平均駐留時(shí)間)、CLz(清除率)和Vz(分布容積)。

2 結(jié)果

在采血過(guò)程中，通過(guò)對(duì)比NC3RS的“小鼠痛苦表情評(píng)分”以及AAALAC《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南(第八版)》，小鼠表現(xiàn)均為正常(所有評(píng)分項(xiàng)目為“0”-正常)，表明的確將動(dòng)物損傷降至了最低。對(duì)于A、B、C、D四種化合物在小鼠中分別單次給藥，采用兩種采血方法計(jì)算所得的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3～6，藥時(shí)曲線見(jiàn)圖1～4。結(jié)果表明，與常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法相比，采用隱靜脈微量采血所獲得的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)一致，無(wú)明顯差異。因此在小鼠藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中隱靜脈微量采血法完全可以替代現(xiàn)有的常規(guī)眼眶后靜脈叢采血法。

表3 小鼠單次給予靜脈注射及口服灌胃模型化合物A后微量和常規(guī)采血方法的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.3 Pharmacokinetics parameters of compound A in the CD-1 mice following an intravenous injection or gastric gavage

注：*表示不適用。下同。

Note.*indicates not applicable (NA). The same below.

注：a：小鼠單次給予靜脈注射1 mg/kg模型化合物；b：小鼠單次給予口服灌胃10 mg/kg模型化合物。下同。圖1 微量和常規(guī)采血法測(cè)得模型化合物A的平均藥時(shí)曲線Note. a: Mouse intravenous injection of 1 mg/kg of model compound each time. b: Mouse oral gavage of 10 mg/kg of model compound each time. The same below.Fig.1 Comparison of mean plasma concentration-time curves of model compound A in mice by regular blood sampling or micro-sampling method

采血方法Bloodcollectionmethods給藥途徑Adminis?trationroutes劑量(mg/kg)Dose藥時(shí)曲線下面積(μg/L?h)AUC(0?t)藥時(shí)曲線下面積(μg/L?h)AUC(0-∞)平均滯留時(shí)間(h)MRT(0-∞)消除半衰期(h)t1/2z達(dá)峰時(shí)間(h)Tmax分布容積(L/kg)Vz清除率[mL/(min?kg)]CLz峰濃度(μg/L)Cmax微量采血Micro?sampling常規(guī)采血Regularsampling靜脈注射IV1412414060800832940386245946507100083313591005微量采血Micro?sampling常規(guī)采血Regularsampling口服灌胃PO10246024652832025NA?NA?1247198021982431025NA?NA?1410

圖2 微量和常規(guī)采血法測(cè)得模型化合物B的平均藥時(shí)曲線Fig.2 Comparison of mean plasma concentration-time curves of model compound B in mice by regular blood sampling or micro-sampling method

采血方法Bloodcollectionmethods給藥途徑Adminis?trationroutes劑量(mg/kg)Dose藥時(shí)曲線下面積(μg/L?h)AUC(0?t)藥時(shí)曲線下面積(μg/L?h)AUC(0-∞)平均滯留時(shí)間(h)MRT(0-∞)消除半衰期(h)t1/2z達(dá)峰時(shí)間(h)Tmax分布容積(L/kg)Vz清除率[mL/(min?kg)]CLz峰濃度(μg/L)Cmax微量采血Micro?sampling常規(guī)采血Regularsampling靜脈注射IV116917706050083419412991421580707008365106259微量采血Micro?sampling常規(guī)采血Regularsampling口服灌胃PO10132147171205NA?NA?79496122412805NA?NA?432

圖3 微量和常規(guī)采血法測(cè)得模型化合物C的平均藥時(shí)曲線Fig.3 Comparison of mean plasma concentration-time curves of model compound C in mice by regular sampling or micro-sampling method

采血方法Bloodcollectionmethods給藥途徑Adminis?trationroutes劑量(mg/kg)Dose藥時(shí)曲線下面積(μg/L?h)AUC(0?t)藥時(shí)曲線下面積(μg/L?h)AUC(0-∞)平均滯留時(shí)間(h)MRT(0-∞)消除半衰期(h)t1/2z達(dá)峰時(shí)間(h)Tmax分布容積(L/kg)Vz清除率[mL/(min?kg)]CLz峰濃度(μg/L)Cmax微量Micro?sampling常規(guī)Regularsampling靜脈注射IV125625804090083526477462392410303008321692669微量Micro?sampling常規(guī)Regularsampling口服灌胃PO107828372117025NA?NA?7547437962117025NA?NA?741

圖4 微量和常規(guī)采血法測(cè)得模型化合物D的平均藥時(shí)曲線Fig.4 Comparison of mean plasma concentration-time curves of model compound D in the mice by regular sampling or micro-sampling method

3 討論

本研究在國(guó)內(nèi)外首次建立了小鼠后肢隱靜脈微量采血法，并利用高靈敏度的質(zhì)譜技術(shù)生物分析方法，成功實(shí)施了藥代動(dòng)力學(xué)研究。微量采血法的應(yīng)用得益于生物分析儀器靈敏度的大幅提高。通過(guò)表7可以發(fā)現(xiàn)，同樣濃度的血漿樣品在使用不同質(zhì)譜進(jìn)行定量時(shí)的靈敏度(色譜峰高)存在明顯差異。對(duì)于藥物研發(fā)早期的藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)，LLOQ(low limit of quantitation)值通常為1 ng/mL。雖然使用相對(duì)老舊型號(hào)的質(zhì)譜也可滿足此要求，但往往需要使用更多的血漿以及其他生物樣品(20～50 μL)用于方法開(kāi)發(fā)以及樣品測(cè)定，而新型儀器可以明顯降低動(dòng)物血漿以及其他生物樣品的使用量(5～10 μL)。

表7 同一濃度血漿樣品(化合物B，1500 ng/mL)使用不同質(zhì)譜儀分析時(shí)的靈敏度比較Tab.7 Sensitivity evaluation by different mass spectrometers using of the samples at the same concentration (compound B, 1500 ng/mL)

小鼠常用的采血方法有眼球摘除采血法、心臟采血法、眼眶后靜脈叢采血法、尾靜脈采血法等，這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。例如眼球摘除采血法采血量約為300～400 μL，而且易致小鼠失明、易感染，止血不嚴(yán)密時(shí)還可致小鼠死亡[7]；心臟采血法采血量可達(dá)800 μL，但由于小鼠個(gè)體小、心臟小、心臟搏動(dòng)快、采血時(shí)位置較難固定，因而操作難度系數(shù)大，且需要麻醉[8-9]。這兩種方法均不可重復(fù)采血，不適用于目前的藥代動(dòng)力學(xué)研究。眼眶后靜脈叢與尾靜脈采血法可重復(fù)采血，常用于藥代動(dòng)力學(xué)研究，但采用眼眶后靜脈叢采血容易混入組織液，且需要麻醉，有可能造成眼球后組織損傷及鼻骨的破壞，甚至導(dǎo)致動(dòng)物窒息死亡[10]。國(guó)外有報(bào)道采用尾靜脈微量采血法進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究[6,11]，但尾靜脈采血法易凝血，常須采用暖燈或者溫水浴加熱尾部以確保重復(fù)采血操作正常進(jìn)行。小鼠隱靜脈血管豐富，位置淺表[12]。因此本研究在國(guó)內(nèi)外首次采用了小鼠后肢隱靜脈采血實(shí)施藥代動(dòng)力學(xué)研究。該方法無(wú)需麻醉，操作方法簡(jiǎn)單易學(xué)，采血位置和深度易把握，動(dòng)物所承受痛苦降至最低。同時(shí)采血量減少了80%，動(dòng)物使用量減少了65%。此外，因所有采血時(shí)間點(diǎn)來(lái)源于同一動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加優(yōu)化。該采血方法更加符合動(dòng)物福利3R原則，在藥代動(dòng)力學(xué)及其他醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)該予以推廣。

[1] 梁月琴, 楊波. 大鼠、小鼠給藥及采血的幾點(diǎn)體會(huì) [J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 31(1): 92-93.

[2] 宗阿南, 鄒悅, 任萍萍. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)中不同采血方法的比較 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2008, l8(2): 74-75.

[3] Diehl KH, Hull R, Morton D, et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes [J]. J Appl Toxicol, 2001, 21(1): 15-23.

[4] Tse FL, Nickerson DF, Aun R. Effect of isoflurane anesthesia on antipyrine pharmacokinetics in the rat [J]. Pharm Res, 1992, 9(11): 1515-1517.

[5] 陳霆, 李楓棣, 鄧巍, 等. 小鼠內(nèi)眥靜脈叢注射與尾靜脈注射比較 [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 24(1): 72-73.

[6] Jonsson O, Palma Villar R, Nilsson LB, et al. Capillary microsampling of 25 μL blood for the determination of toxicokinetic parameters in regulatory studies in animals [J]. Bioanalysis, 2012, 4(6): 661-674.

[7] 孫奎, 梅丹, 姜華, 等. 實(shí)驗(yàn)鼠采血方法及特點(diǎn) [J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)吉林軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 25(1): 31-32.

[8] 吳曉晴, 郝晨霞. 160只小鼠心臟采血的操作體會(huì) [J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理, 2004, 21(1): 53-54.

[9] 呂春燕, 馬躍榮. 小鼠心臟穿刺采血并存活的幾點(diǎn)注意事項(xiàng) [J]. 瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2006, 29(3): 206.

[10] Said R, Abdel-Rehim M, Sadeghi B, et al. Cyclophosphamide pharmacokinetics in mice: a comparison between retro orbital sampling versus serial tail vein bleeding [J]. The Open Pharmacology Journal, 2007(1): 30-35.

[11] Hui YH, Huang NH, Ebbert L, et al. Pharmacokinetic comparisons of tail-bleeding with cannula- or retro-orbital bleeding techniques in rats using six marketed drugs [J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 2007, 56(2): 256-264.

[12] Jonsson O, Villar RP, Nilsson LB, et al. Validation of a bioanalytical method using capillary microsampling of 8 μL plasma samples: application to a toxicokinetic study in mice [J]. Bioanalysis, 2012, 4(16): 1989-1998.