親和吸附材料特異性清除外源性內(nèi)毒素有效性的研究

向勇平，崔 輝，劉理金，張金紅，劉 丹，于 杰，周立冬，楊建明，劉愛兵*

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)武警總醫(yī)院研究培養(yǎng)基地，北京 100039； 2.武警總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心，北京 100039；3.災(zāi)害救援醫(yī)學(xué)北京市重點實驗室，北京 100039； 4.天津市陽權(quán)醫(yī)療器械有限公司，天津 300350；5.天津市港口醫(yī)院，天津 300350)

內(nèi)毒素血癥(endotoxemia，ETM)是由于細(xì)菌釋放大量的內(nèi)毒素進(jìn)入機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)，或輸入含有大量內(nèi)毒素感染的液體，從而引發(fā)的一種病理表現(xiàn)[1]。內(nèi)毒素血癥可致全身炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)、彌漫性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)等嚴(yán)重病癥。研究表明，血液中內(nèi)毒素濃度的增高與休克事件的發(fā)生有關(guān)，進(jìn)入血液的內(nèi)毒素濃度越高休克發(fā)生可能性越大[2]。機(jī)體有細(xì)菌存在或有高度可疑感染灶所釋放內(nèi)毒素可致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，病死率約為30%～60%[3]。血液灌流(hemoperfusion，HP)技術(shù)可以通過吸附作用清除血液中的內(nèi)毒素、凈化血液，以達(dá)到治療相應(yīng)疾病的效果。Shoji[4]對多例MODS患者多次進(jìn)行灌流治療后，患者內(nèi)毒素水平從治療前的76 ng/L降至21 ng/L。先前有研究顯示，不同的灌流材料對內(nèi)毒素的清除作用不同[5]。本實驗采用本課題組研發(fā)的高分子親和吸附材料，制備一次性血液灌流器，特異性清除實驗犬體內(nèi)高內(nèi)毒素，用以驗證該親和吸附材料對清除高內(nèi)毒素血癥的有效性和特異性，為臨床上治療內(nèi)毒素血癥提供新方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級比格犬(性別不限)15只，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，無孕，1～2歲，體重(39±1.8) kg [SCXK (軍) 2012-0002]。在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心[SYXK (軍) 2012-004]飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗，實驗前12 h禁食不禁水，實驗過程中按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

內(nèi)毒素(Sigma)；內(nèi)毒素檢測鱟試劑盒(廈門鱟試劑實驗廠有限公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 ELISA試劑盒(上海酶聯(lián))。心電監(jiān)護(hù)儀(深圳邁瑞ipM12)；大型動物麻醉機(jī)(北京眾實迪創(chuàng)ZS-M)；ELX808酶標(biāo)儀(廈門鱟試劑生物科技有限公司)；DTX880酶標(biāo)儀(美國貝克曼)。

親和吸附材料及灌流器：本課題組由天津市陽權(quán)醫(yī)療器械有限公司研發(fā)低密度聚合物特異親和高分子吸附材料，制成一次性使用血液灌流器(DHC-II-340型)，該灌流器供本課題犬血液灌流使用。

1.3 實驗方法

1.3.1 內(nèi)毒素動物模型的建立

犬禁食12 h，在麻醉前15 min給予0.25 mL阿托品肌肉注射，并使用氯胺酮4 mg/kg加胃復(fù)安10 mg肌肉注射進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，待犬昏迷后取仰臥位固定四肢，麻醉機(jī)維持麻醉。在左頸靜脈處靜脈留置針穿刺以備抽取血液標(biāo)本。鈍性分離左側(cè)股靜脈，進(jìn)行靜脈插管，內(nèi)毒素0.45 mg/kg溶于生理鹽水100 mL，經(jīng)靜脈在30 min內(nèi)完成輸注。

1.3.2 灌流通路的肝素化

啟動血泵，用生理鹽水300 mL+肝素10 mg，以100 mL/min的速度沖洗灌流器，排除管道內(nèi)的空氣，進(jìn)行灌流通路的肝素化，最后用生理鹽水250 mL+肝素50 mg在灌流通路中閉式循環(huán)10 min后備用。

1.3.3 血液灌流

鈍性分離犬右側(cè)股動脈，連接灌流導(dǎo)管、血泵和灌流器，形成閉合體外循環(huán)通路。由血泵提供動力，血液經(jīng)過灌流器后返回體內(nèi)。造模后45 min治療組用本課題組研發(fā)的灌流器灌流，對照組不用該灌流器。灌流開始后用肝素泵持續(xù)并追加肝素12 mg/h，在灌流結(jié)束前30 min停止使用肝素。灌流120 min后，采用空氣回血法讓血液流回犬體內(nèi)，縫合傷口。

1.3.4 測定指標(biāo)

(1)內(nèi)毒素檢測：分別于灌流開始前、灌流120 min時抽取靜脈血2 mL，經(jīng)離心后取血清，用動態(tài)濁度法測定犬血液中內(nèi)毒素水平。內(nèi)毒素清除率計算方法：R(%)=(C0- Ct)/C0× 100%，C0、Ct分別為內(nèi)毒素的初始濃度及t時間吸附后的濃度。

(2)細(xì)胞因子測定：用ELISA法測定灌流開始(造模后45 min)、灌流120 min血清中的細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)的水平。

(3)生命體征監(jiān)測：實驗過程中監(jiān)測犬的生命體征，包括體溫(body temperature)、脈率(pulse rate，PR)、呼吸頻率(respiratory rate，RR)、收縮壓(systolic arterial pressure，SAP)，記錄灌流開始(造模后45 min)、灌流60 min、灌流120 min實驗動物的生命體征。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素清除效果

造模成功后，治療組在灌流開始前、灌流120 min后血液內(nèi)毒素水平分別為(118.63±27.98)、(0.039±0.009) EU/mL，對照組在灌流開始前、灌流120 min后血液內(nèi)毒素水平分別為(117.16±22.95)、(131.98±7.01) EU/mL。治療組灌流開始與灌流120 min比較，差異有顯著性(P< 0.05)，內(nèi)毒素平均清除率R=94.07%；對照組灌流開始、灌流120 min比較，差異無顯著性(P> 0.05)。

2.2 對細(xì)胞因子的清除效果

治療組、對照組灌流開始、120 min時血清中細(xì)胞因子測定結(jié)果見表1。

從表1中看出治療組灌流120 min后血清中各細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)的水平都有顯著下降，與灌流開始時比較差異有顯著性(P< 0.05)；對照組中各指標(biāo)灌流120 min后都有所上升，且與灌流開始比較差異有顯著性(P< 0.05)。

2.3 對生命體征的影響

兩組灌流中，分別記錄灌流開始、灌流60 min、灌流120 min三個時間點的生命體征，數(shù)據(jù)見表2。

Tab.1Clearance effect of cytokines before and after perfusion

治療組(n=10)Treatmentgroup對照組(n=5)Controlgroup灌流開始Beginningofperfusion灌流120minAfterperfusionfor120min灌流開始Beginningofperfusion灌流120minAfterperfusionfor120minTNF?α153±027013±006?153±006226±015?IL?1β1282±166070±036?1305±0181512±018?IL?65477±398162±080?5458±0196254±093?IL?8025±032001±000?028±006073±093?

注：與灌流開始相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the beginning of perfusion,*P< 0.05.

Tab.2Changes of vital signs during perfusion

治療組(n=10)Treatmentgroup對照組(n=5)Controlgroup灌流開始Beginningofperfusion灌流60minAfterperfusionfor60min灌流120minAfterperfusionfor120min灌流開始Beginningofperfusion灌流60minAfterperfusionfor60min灌流120minAfterperfusionfor120min體溫(℃)Bodytemperature385±0．94375±0．84?369±0．63?387±019388±009?392±026?呼吸頻率(每分鐘次數(shù))Respiratoryrate(timesperminute)290±1．13250±1．38?270±0．69?300±110320±148350±130?脈率(每分鐘次數(shù))Pulserate(timesperminute)850±4．10800±4．58840±3．34870±297890±179?920±158?收縮壓(mmHg)Systolicarterialpressure1630±11．251580±11．511600±11．551630±3051630±1921640±130

注：單因素方差分析，*P< 0.05。

Note. Single factor analysis of variance,*P< 0.05.

從表2看出，治療組灌流開始時實驗犬體溫最高，隨著灌流治療的延續(xù)體溫逐漸下降，灌流60 min、120 min與灌流開始比較差異有顯著性(P< 0.05)；灌流60 min、120 min的呼吸頻率與灌流開始比較差異有顯著性(P< 0.05)。對照組體溫、脈率隨著灌流的進(jìn)行逐漸上升，灌流60 min、120 min分別與灌流開始比較差異有顯著性(P< 0.05)；呼吸頻率隨灌流的進(jìn)行逐漸上升，灌流開始與灌流120 min比較差異有顯著性(P< 0.05)。兩組在灌流中收縮壓都保持平穩(wěn)。

3 討論

隨著材料技術(shù)和免疫學(xué)的快速發(fā)展，吸附材料的發(fā)展也日新月異，在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用也展現(xiàn)出不錯的前景。目前，由于膜吸附材料具有脂溶性，對清除高分子溶質(zhì)、脂溶性好或蛋白結(jié)合的毒物作用有限；聚乙烯基咪唑?qū)θ梭w產(chǎn)生不良反應(yīng)；多粘菌素B容易從載體上脫落加重腎的負(fù)擔(dān)。本課題組選擇親水單烯和疏水芳香雙烯單體制得“雙親性”大孔共聚物，再引入間隔臂將此共聚物與含大量氨基酸的配基相連制成“雙親型”親和吸附材料，這種吸附材料無毒、無味、可降解且具有良好的血液相容性，也能夠高效地清除血液中的內(nèi)毒素及內(nèi)毒素作用下機(jī)體產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)，并且能夠在使用中具有良好的穩(wěn)定性。

本課題組研發(fā)的親和吸附材料所制成的一次性灌流器，在犬內(nèi)源性內(nèi)毒素血癥的研究中已取得極好的效果[6]。本實驗將其應(yīng)用于犬的外源性內(nèi)毒素血癥的清除治療中，并探討該材料清除內(nèi)毒素的有效性。本實驗治療組對內(nèi)毒素的平均清除率可達(dá)94.07%，對清除內(nèi)毒素作用機(jī)體產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)也作用十分顯著。對照組中內(nèi)毒素及相應(yīng)細(xì)胞因子的水平保持上升。研究證明，當(dāng)機(jī)體受內(nèi)毒素刺激后，機(jī)體的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和炎性反應(yīng)細(xì)胞被激活，會釋放大量的炎性因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等最終導(dǎo)致瀑布樣炎癥級聯(lián)反應(yīng)[7-8]。目前的研究認(rèn)為，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎癥因子所導(dǎo)致的瀑布樣炎癥級聯(lián)反應(yīng)與體內(nèi)內(nèi)毒素的濃度密切相關(guān)[9-10]，因此阻斷瀑布樣炎癥級聯(lián)反應(yīng)，是關(guān)于高內(nèi)毒素血癥的靶標(biāo)治療[11]。本實驗治療組通過血液灌流，清除血液中的內(nèi)毒素，及時阻止炎癥因子的釋放，從而達(dá)到減少內(nèi)毒素對機(jī)體單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和炎性反應(yīng)細(xì)胞的刺激，進(jìn)一步加大了本實驗清除內(nèi)毒素的有效性。內(nèi)毒素可直接作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞或白細(xì)胞，使其釋放內(nèi)源性致熱原，引起發(fā)熱反應(yīng)[12]。治療組中犬的體溫隨著體內(nèi)內(nèi)毒素的清除而下降是因為減少了致熱原的產(chǎn)生而阻斷了發(fā)熱反應(yīng)；在灌流過程中呼吸頻率、收縮壓等生命體征有輕微的波動，但都在正常范圍之中趨于平穩(wěn)。對照組中犬的體溫、脈率、呼吸頻率都有相應(yīng)的變化，可能是體內(nèi)內(nèi)毒素水平持續(xù)升高所導(dǎo)致的，但收縮壓保持平穩(wěn)，說明內(nèi)毒素及灌流治療對血壓沒有影響，待進(jìn)一步的探討。

實驗結(jié)果表明，本課題研發(fā)的高分子親和吸附材料能高效地清除血液中內(nèi)毒素及內(nèi)毒素作用機(jī)體產(chǎn)生的炎癥因子，可以及時降低內(nèi)毒素對機(jī)體的危害。

[1] 蔣慶軍. 內(nèi)毒素檢測在內(nèi)毒素血癥治療中的應(yīng)用 [J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2008, 17(33): 5229-5232.

[2] Shimizu T, Obata T, Sonoda H, et al. Diagnostic potential of endotoxin scattering photometry for sepsis and septic shock [J]. Shock, 2013, 40(6): 504-511.

[3] 嚴(yán)靜. 成人嚴(yán)重感染與感染性休克血流動力學(xué)監(jiān)測與支持指南(2006) [J]. 中國實用外科雜志, 2007, 27(1): 7-13.

[4] Shoji H. Extracorporeal endotoxin removal for the treatment of sepsis: endotoxin adsorption cartridge (Toraymyxin) [J]. Ther Apher Dial, 2003, 7(1): 108-114.

[5] Anisimova NY, Gromova EG, Kuznetsova LS, et al. Dynamics of elimination of bacterial endotoxins and cytokines from the blood of tumor patients with sepsis in hemoperfusion using carbon adsorbents [J]. Bull Exp Biol Med, 2011, 151(5): 622-624.

[6] 向勇平, 崔輝, 劉丹, 等. 親和吸附材料特異性清除腸源性內(nèi)毒素有效性和安全性探討 [J]. 中國實驗動物學(xué)報, 2018, 26(1): 52-56.

[7] Chen J, Zhu RL, Nakayama M, et al. Expression of the apoptosis-effector gene,Bax, is up-regulated in vulnerable hippocampal CA1 neurons following global ischemia [J]. J Neurochem, 1996, 67(1): 64-71.

[8] Ohashi H, Kawasaki N, Komatsu H, et al. Microdialysis detection of lactate in subcutaneous tissue as a reliable indicator of tissue metabolic disorders in an animal sepsis model [J]. J Smooth Muscle Res, 2011, 47(1): 37-46.

[9] 任珊, 趙鶴齡. 拯救膿毒癥運動: 2012嚴(yán)重膿毒癥和膿毒癥性休克管理指南要點 [J]. 河北醫(yī)藥, 2013, 35(8): 1233-1236.

[10] Vanden Berghe T, Demon D, Bogaert P, et al. Simultaneous targeting of IL-1 and IL-18 is required for protection against inflammatory and septic shock [J]. Am J Respir Crit Care Med, 2014, 189(3): 282-291.

[11] Modell JH, Gravenstein N, Morey TE. Body temperature change during anesthesia for electroconvulsive therapy: implications for quality incentives in anesthesiology [J]. Anesth Analg, 2008, 107(5): 1618-1620.

[12] Janelidze S, Hu BR, Siesj? P, et al. Alterations of Akt1 (PKBα) and p70S6Kin transient focal ischemia [J]. Neurobiol Dis, 2001, 8(1): 147-154.