基于16S rDNA可變區(qū)測序技術對抗生素治療后的6月齡內肺炎嬰兒的呼吸道菌群現況調查

洪慧慧 王立波 祁媛媛

肺炎是兒童常見疾病，發(fā)病率高［1］，也是兒童死亡的主要原因，占兒童死亡原因的15．5%［2］，小嬰兒發(fā)病率及病死率更高。以往認為肺炎的發(fā)病機制是單種病原體入侵并在肺部生長，而新近研究認為上、下呼吸道是一個復雜且相連的微生物生態(tài)系統(tǒng)，在其穩(wěn)態(tài)遭到破壞時導致肺炎發(fā)生［3］。生命早期呼吸道菌群紊亂可能與呼吸道感染易感性、嚴重程度和兒童哮喘的發(fā)生相關［4，5］。Vissing等報告，新生兒期咽部肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的定植增加了早期肺炎發(fā)生的風險［6］。Sakwinska等比較了肺炎兒童與健康兒童的鼻咽部菌群變化，發(fā)現非病毒性肺炎患兒鼻咽部肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的豐度增高［7］。這些研究僅關注了咽部的菌群變化對發(fā)生肺炎的風險的影響，由于兒童下呼吸道標本獲取困難，使得下呼吸道菌群情況尤其是感染時的狀況知之甚少;而且，研究結果提示不同疾病時上、下呼吸道菌群存在不同的變化［8］。研究顯示，＞6月齡的肺炎兒童誘導痰與咽拭子的一些特定菌群與肺炎的病程相關［9］。＜6月齡嬰兒的菌群有其特殊性，且生命早期的菌群狀況對免疫系統(tǒng)成熟和呼吸系統(tǒng)發(fā)育影響巨大，本文觀察＜6月齡肺炎嬰兒的上、下呼吸道菌群狀況。

1 方法

1．1 研究設計 橫斷面調查。選擇＜6月齡的肺炎患兒，同時采集口咽拭子和支氣管肺泡灌洗液(BALF)標本，利用16S rDNA可變區(qū)測序技術分析呼吸道微生物群落結構，比較上、下呼吸道菌群變化。

1．2 納入標準 2017年1月1日至8月31日在復旦大學附屬兒科醫(yī)院(我院)呼吸科住院，有咳嗽、咳痰等呼吸道癥狀，胸部X線檢查發(fā)現肺部有滲出影，病程＞2周，抗生素治療＞5 d，被診斷為肺炎的＜6月齡患兒。

1．3 排除(剔除)標準 診斷為肺炎同時伴以下情況:支氣管肺發(fā)育不全，閉塞性細支氣管炎，嚴重先天性心臟病，嚴重氣道狹窄或軟化，其他氣道結構異常，真菌、支原體等特定病原體感染，有機械通氣史。

1．4 知情同意和倫理 采集上、下呼吸道標本和行相關檢測均得到患兒家長或監(jiān)護人的知情同意，本研究獲我院倫理委員會審核批準(復兒倫審［2013］039號)。

1．5 樣本采集 上呼吸道選取口咽拭子樣本，于入院后第2 d清晨，采用3M快速涂抹棒，樣本采集后4℃保存。下呼吸道標本選取BALF，根據臨床需要行纖維支氣管鏡檢查，并使用生理鹽水進行支氣管肺泡沖洗，沖洗液回收，4℃保存。咽拭子及BALF均在4 h內完成DNA抽提。

1．6 DNA抽提 咽拭子采集管渦旋震蕩10 s后轉移培養(yǎng)液到無菌離心管中，咽拭子培養(yǎng)液和BALF以14 000 r·min－1離心 10 min，棄上清液，沉淀物以 200 μL 無菌 PBS 重懸。采用德國QIAGEN公司Blood＆Tissue Kit試劑盒，根據說明書對懸浮物進行DNA抽提。

1．7 測序及結果分析 DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量;用 338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和 806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對細菌的16S rDNA V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增，用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，USA)進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST(Promega，USA)進行檢測定量。檢測合格的樣本根據Illumina MiSeq平臺(Illumina，USA)標準操作規(guī)程構建PE 2*300的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。原始測序序列使用Trimmomatic軟件質控，使用FLASH軟件進行拼接，使用的UPARSE軟

件(version 7．1)根據97%的相似度對序列進行OTU聚類;使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva128/16s_bacteria數據庫，設置比對閾值為0．8。微生物群落豐富度評估采用sobs指數、chao指數和ace指數，sobs指數反映實際觀測到的OTU數目，chao指數和ace指數為估計的OTU數目，3個豐富度指數均用于評估樣本的物種總數;群落多樣性評估采用shannon指數和simpson指數，多樣性指數綜合評估樣本的群落豐富度和均勻度，shannon值越大說明群落多樣性越高，simpson值越大說明多樣性越低。采用I-Sanger生物信息學分析云平臺進行物種組成分析。

1．8 臨床資料收集 采集患兒入院時年齡、性別、體重、出生方式等基本信息，采集治療信息等。

1．9 統(tǒng)計方法 Alpha多樣性指數組間差異性檢驗及物種差異分析的組間差異性檢驗采用配對符號秩檢驗，使用SPSS 23．0進行統(tǒng)計分析;評估不同樣本的相似性和差異關系的Beta多樣性分析采用主成分分析(PCA分析)，使用R語言PCA統(tǒng)計分析;所有統(tǒng)計檢驗均為雙尾檢驗，以p＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 一般情況 符合本文納入標準的29例患兒，排除(剔除)聲門下血管瘤、舌根囊腫、支原體感染、真菌感染和機械通氣史各1例，24例肺炎患兒進入本文分析，男18例(75．0%)，年齡 49～ 177［130．5(88．8，164．5)］d，平均體重(6．5±1．7)kg;剖宮產 7 例(29．2%)，早產 3 例(12．5%);母乳喂養(yǎng)8例(33．3%)、奶粉喂養(yǎng)5例(20．8%)、混合喂養(yǎng)11例(45．8%);標本采集前均曾經靜脈抗生素治療，抗生素使用時間 6～43(15．6±7．5)d;伴有喘息 18 例;接受靜脈激素治療14例;7例(29．2%)采用呼吸支持，其中1例接受高流量鼻導管吸氧，6例接受鼻導管、面罩或頭罩吸氧;住院時間中位數為8(6，11)d。

2．2 呼吸道菌群概況 24例咽拭子和BALF樣本共得到1 766 363個有效序列數，791 005 442個有效堿基數，序列平均長度為447．82，最小樣本序列數為30 179。對OTU原始序列表按最小樣本序列數進行抽平，后續(xù)的所有分析均以抽平后的序列表為基礎進行聚類分析。如圖1所示，在現有序列數下sobs指數及shannon指數的稀釋曲線均趨于平坦，說明每個樣本的測序數據量足夠大，可以反映樣本中的微生物信息。

圖1 OTU水平稀釋曲線

2．3 呼吸道菌群組成分析

2．3．1 門水平 上呼吸道菌群的分類數為16，下呼吸道菌群的分類數為27，其中共有菌為13種，上、下呼吸道微生物分布見表1，上呼吸道菌群豐度前5位的依次是厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門，下呼吸道菌群豐度前5位的依次是變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和衣原體門(未分類細菌除外)。上、下呼吸道中序列數總和前7位的物種均為上、下呼吸道共有菌，占上、下呼吸道總細菌數的99．16%，全部共有菌占上、下呼吸道總細菌數的99．23%。未分類細菌在上、下呼吸道所占比例分別為0．16%和1．27%(表中未列出)。

2．3．2 屬水平 上呼吸道菌群的分類數為134，下呼吸道菌群的分類數為247，上、下呼吸道共有的菌屬為120種，表2顯示，上呼吸道菌群豐度前5位的依次是鏈球菌屬、假單胞菌屬、普氏菌屬-7、韋榮球菌屬和埃希氏-志賀菌屬，下呼吸道菌群豐度前5位的依次是假單胞菌屬、鏈球菌屬、普氏菌屬-7、克雷伯菌屬和羅氏菌屬。上、下呼吸道中序列數總和前42位的物種均為上、下呼吸道共有菌，占上、下呼吸道總細菌的98．63%，全部共有菌占上、下呼吸道總細菌數的98．99%。與上呼吸道相比，下呼吸道的獨有細菌更多。

表1 門水平的上、下呼吸道微生物群落分布(%)

表2 屬水平的上、下呼吸道微生物群落分布(%)

2．4 呼吸道菌群多樣性比較 上、下呼吸道菌群Beta多樣性的比較顯示(圖2)，上呼吸道菌群除了2個離散樣本外分布較集中，下呼吸道菌群樣本的分布較離散。

上、下呼吸道微生物群落Alpha多樣性的比較顯示(圖3)，下呼吸道菌群豐富度顯著高于上呼吸道，上呼吸道菌群多樣性顯著高于下呼吸道(p＜0．05)。

圖2 OTU水平的上、下呼吸道菌群主成分分析

圖3 上、下呼吸道菌群的豐富度和多樣性分析

3 討論

近年來，呼吸道微生物對免疫及疾病的作用越來越受到重視。研究提示，生命早期呼吸道菌群的變化參與了后期哮喘和過敏等疾病的發(fā)生，而慢性肺疾病如慢性呼吸道阻塞性疾病(COPD)中，呼吸道菌群紊亂伴隨著疾病的急性惡化［10，11］。近來的研究也開始關注急性呼吸道感染時的菌群變化，但多數只對上呼吸道樣本進行分析，急性肺炎時下呼吸道菌群的變化仍不清楚，更缺乏生命早期的菌群狀況資料。

本研究報告了經過治療的＜6個月肺炎患兒上、下呼吸道的菌群狀況。有研究表明［12］，健康嬰兒上呼吸道菌群屬水平豐度前5位依次為鏈球菌屬、奈瑟菌屬、韋榮球菌屬、芽孢桿菌屬和普氏菌屬(未分類除外)。細支氣管炎嬰兒的上呼吸道菌群中假單胞菌屬等的相對豐度高于健康嬰兒(1．44%vs 0．19%)［12］。本研究中，上呼吸道菌群奈瑟菌屬和芽孢桿菌屬的豐度降低，假單胞菌比例較高。目前尚無健康嬰兒BALF的菌群狀況的研究資料，6月至5歲的肺炎兒童的誘導痰菌群豐度前5位依次為鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、巴斯德氏菌屬、普氏菌屬和韋榮球菌屬［9］，健康成人BALF菌群豐度前5位依次為普氏菌屬、鏈球菌屬、奈瑟菌屬、巴斯德氏菌屬和梭桿菌屬［13］，本研究中肺炎患兒肺部菌群中假單胞菌屬、克雷伯菌屬和羅氏菌屬豐度增加，假單胞菌屬(變形菌門)在肺部占73．06%，普氏菌屬、鏈球菌屬和奈瑟菌屬的豐度降低。

既往研究報道假單胞菌屬是最不易受抗生素影響的菌屬之一［14］，本研究嬰兒的呼吸道中假單胞菌豐富度較高，可能患兒病程長、抗生素大量使用，對抗生素敏感的菌群被抑制有關。有研究顯示，慢性呼吸系統(tǒng)疾病如COPD患者急性發(fā)作期的下呼吸道菌群以變形菌門為主，哮喘的急性發(fā)作也伴有變形菌門含量增加［15］;HIV患者BALF菌群變形菌門增加［16］。這種相似的菌群變化是疾病發(fā)生發(fā)展的因素還是治療所致?生命早期的菌群改變對呼吸系統(tǒng)預后的影響如何?尚需更深入的研究。

本研究發(fā)現，咽拭子與BALF中相對豐度較高的細菌均為共有菌，占菌群的98%以上。除假單胞菌屬、鏈球菌屬和羅氏菌屬外，其他共有菌在上、下呼吸道中的相對含量差異均無統(tǒng)計學意義。這一結果提示，上呼吸道菌群可在一定程度反映下呼吸道菌群，為通過上呼吸道菌群研究分析下呼吸道菌群的作用提供了理論依據。與上呼吸道菌群比較，＜6個月肺炎嬰兒的BALF有較多的獨有菌，菌群豐富度高于上呼吸道，而多樣性低于上呼吸道。這與既往對于上、下呼吸道菌群的比較結果略有不同，Bassis等［13］報告，健康成人的上呼吸道菌群的豐富度及多樣性均高于下呼吸道;Marsh等［8］的研究顯示，慢性肺病(遷延性細菌性支氣管炎和慢性化膿性肺疾病)患兒的口咽拭子菌群豐富度及多樣性高于支氣管BALF菌群;Pittman等［17］對囊性纖維化的小嬰兒的BALF及口咽拭子菌群的研究顯示，肺部菌群多樣性高于口咽部;國內學者［18］對成人肺占位性疾病患者的研究顯示，肺部菌群的多樣性及豐富度均高于口腔。上、下呼吸道菌群的狀態(tài)可能受年齡、疾病狀態(tài)、地域環(huán)境及治療手段等多種因素的影響，這種菌群狀況在疾病中的作用仍不清楚。

本文研究對象在標本采集前均已接受了抗生素治療，會對上、下呼吸道菌群產生影響，無法真實反映肺炎患兒上、下呼吸道菌群的狀況，也不能反映引起肺炎的菌群是來自于定植菌還是外來菌。依照倫理和現有的實驗手段，診斷為肺炎患兒，幾乎不存在沒經過抗生素治療狀況下，可以采集到下呼吸道標本的可能。然而抗生素使用是非病毒性肺炎的主要治療手段，抗生素治療背景下的菌群也可一定程度反映肺炎患兒的菌群狀況。

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