蕓豆籽粒中胰蛋白酶抑制劑的研究進展

葛平珍,余 莉,王昭禮,吳憲志,何友勛,張時龍

(畢節(jié)市農(nóng)業(yè)科學研究所,貴州畢節(jié) 551700)

蕓豆,學名菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.sp),是普通菜豆和多花菜豆的總稱,屬豆科(Leguminosae)菜豆屬(PhaseolusL.)的小宗雜糧作物[1]。我國常年栽培面積約800萬畝,總產(chǎn)量約80～90萬噸,主要分布在黑、內(nèi)蒙古、冀、晉、甘、新、川、滇、黔等地。蕓豆也是我國重要的出口商品,每年出口50～70萬t,占我國糧食出口的10%左右,位居第4位。蕓豆籽粒主要由碳水化合物和蛋白質(zhì)組成,含有少量抗營養(yǎng)因子(如蛋白酶抑制劑、植物凝集素等),Ca、Fe含量分別是雞肉的7倍和4倍,且黑蕓豆和紅蕓豆中的天然色素含量較高。有實驗表明,蕓豆蛋白質(zhì)含量為17.91%～22.03%,脂肪含量為2.56%～8.46%,總糖(可溶性)含量為4.50%～5.42%[2]。

胰蛋白酶抑制劑是由多個氨基酸組成的多肽或小分子蛋白質(zhì)。胰蛋白酶抑制劑通過削弱或阻斷昆蟲腸道蛋白質(zhì)的消化而導致昆蟲非正常發(fā)育或死亡;胰蛋白酶抑制劑能抑制蛋白酶水解作用,能有效防止肉類產(chǎn)品軟化,能抑制乳腺癌細胞MCF7增殖和治療糖尿病,還有輻射保護、抗炎等作用[3-9]。由于胰蛋白酶抑制劑既是抗營養(yǎng)因子又是生理活性蛋白,且不同品種、病害程度差異及不同的生理狀況影響胰蛋白酶抑制劑的亞基結(jié)構[10]。因此,國內(nèi)外學者對其結(jié)構、性質(zhì)、提取純化工藝及其作用進行了研究,同時部分學者探討了深加工技術對蕓豆胰蛋白酶抑制劑的影響。

本文將介紹蕓豆胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構、提取純化工藝、功能作用及加工技術對其影響的研究現(xiàn)狀,以期為蕓豆胰蛋白酶抑制劑的研究提供理論基礎及為蕓豆加工技術選擇提供指導。

1 胰蛋白酶抑制劑的分類

根據(jù)蛋白酶抑制劑所作用的靶酶類型不同,可將其分為四類:絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑及酸性蛋白酶抑制劑[11]。胰蛋白酶抑制劑主要作用于含絲氨酸的蛋白酶,屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑[12]。

豆類中胰蛋白酶抑制劑主要有兩類:Kunitz型(KTIs)和Bowman-Birk型(BBIs),其中KTIs劑屬于典型絲氨酸蛋白酶抑制劑,由170～200個氨基酸組成,分子量為18～22 kDa,含有高度保守的N端區(qū)域,且4個半胱氨酸殘基形成2個鏈內(nèi)二硫鍵,此抑制劑只有一個活性中心,主要抑制含絲氨酸的蛋白酶,此抑制劑有調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白酶、抗蟲、抗癌、抗炎等作用;BBIs由60～80個氨基酸組成,分子量為8～10 kDa,其中14個半胱氨酸殘基形成7個二硫鍵,此抑制劑含有兩個活性中心,分別對胰蛋白酶及其類似物、彈性蛋白酶及其類似物和胰凝乳蛋白酶及其類似物有抑制作用[13-16],此抑制劑有抗癌、抗蟲等活性,且可作為選擇性輻射保護劑[17]。

棕色蕓豆中胰蛋白酶的N端氨基酸序列為SGHRHESTDEPS,與菜豆中雙頭胰蛋白酶抑制劑的部分氨基酸序列相似,分子量約為17 kDa,推測棕色蕓豆中的胰蛋白酶抑制劑為Bowman-Birk型抑制劑[3];紅蕓豆中胰蛋白酶抑制劑分子量約為18 kDa,對胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的抑制活性分別為18.76及12.62 U/mg protein[4];小黑蕓豆中胰蛋白酶抑制劑分子量約為24.3 kDa,初步斷定其為Kunitz型胰蛋白酶抑制劑[18]。

2 蕓豆胰蛋白酶抑制劑的提取、分離及純化

從蕓豆中提取胰蛋白酶抑制劑分為粗提和純化兩部分,但脫脂蕓豆浸出液中胰蛋白酶抑制劑的活性較高,因此在粗提前需對蕓豆進行脫脂處理。通過優(yōu)化實驗選擇合適的提取溶劑(酸、堿、鹽、緩沖溶液及去離子水等)和最佳的提取條件(溫度、時間和pH),隨后通過熱變性處理或硫酸銨分級沉淀等方法除去雜蛋白以得到粗提液,再通過凝膠過濾層析、離子交換層析或親和色譜層析等進行純化,最后用高效液相色譜法(HPLC)及SDS-PAGE電泳法測定純化后胰蛋白酶抑制劑的純度和分子量。不同品種的蕓豆籽粒,其含有的胰蛋白酶抑制劑分子量存在差異,國內(nèi)外學者開展了對不同蕓豆品種籽粒胰蛋白酶的提取、分離及純化的研究。

Sriket等[4]在粗提前用正乙烷脫脂,脫脂干燥后的紅蕓豆粉用0.15 mol/L的NaCl溶液(1∶10,w/V)室溫下振蕩提取3 h,經(jīng)過冷凍干燥、90 ℃加熱10 min、冰水冷卻,得到分子量為18 kDa的胰蛋白酶抑制劑,能抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。Mittal等[5]以0.1% NaCl(1∶40,w/V)為浸提溶劑,脫脂蕓豆粉在60 ℃振蕩浸提52 min,冷凍干燥得粗提物;粗提物經(jīng)20%～70%的硫酸銨沉淀、0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)透析、DEAE-纖維素陰離子交換層析、Sephadex G-100 凝膠柱層析、陽離子交換柱層析、CM-Sephadex C-50 凝膠柱層析等進行純化,通過高效液相色譜分析及SDS-PAGE分析,得到分子量為15 kDa的胰蛋白酶抑制劑。Chan等[3]以棕色蕓豆為研究對象,浸泡過夜后經(jīng)去離子水浸提,用Tris-HCl緩沖液調(diào)節(jié)浸提液,上清液經(jīng)Affi-gel藍膠親和層析、Q-Sepharose 和 Mono Q的陰離子交換層析、Superdex 75 凝膠層析進行純化,通過SDS-PAGE及氨基酸序列分析,得到分子量為17 kDa且N端氨基酸序列為SGHRHESTDEPS的胰蛋白酶抑制劑。劉盈盈[19]以紫花蕓豆為材料,經(jīng)乙醚脫脂、酸抽提、熱變性、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析等,得到表觀分子量約為59 kDa的胰蛋白酶抑制劑,含有3個亞基(34、16、15 kDa),等電點為pH5.25。Wati等[20]通過熱處理(70 ℃,10 min)和硫酸銨沉淀從紅蕓豆中分離胰蛋白酶抑制劑,經(jīng)SDS-PAGE分析得到其分子量為118 kDa;其IV組分能抑制羅非魚肌肉的降解。

3 蕓豆胰蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定性

蕓豆胰蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定性主要由其特定的亞基決定的,具有良好的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性,部分金屬離子能增強其抑制活性(如Hg2+、Na+、Zn2+及Ca2+等),但有的金屬離子卻能降低其抑制活性(如Fe3+、Mn2+和Co2+等)。蕓豆胰蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定性研究對其應用具有重要意義,現(xiàn)階段已有學者對不同品種蕓豆的胰蛋白酶抑制劑穩(wěn)定性進行了研究。

Mittal等[5]對蕓豆胰蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定性進行研究,發(fā)現(xiàn)其在pH為3～11、溫度為40～60 ℃均能保持活性,K+、Hg2+、Na+、Zn2+、Ni+、Cd2+及Ca2+等能增強其活性,Fe3+、Mn2+及Co2+等降低其活性,酪蛋白、CaCl2、BSA和蔗糖能增強其穩(wěn)定性,且是解離常數(shù)為1.85 μmol/L的競爭性抑制劑。張倫等[21]發(fā)現(xiàn)紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑在100 ℃處理60 min活性僅喪失30%,具有良好的熱穩(wěn)定性;同時,劉盈盈等[22]發(fā)現(xiàn)還原劑(如DTT)和變性劑(如尿素、鹽酸胍等)能改變紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構。Chan等[3]發(fā)現(xiàn)棕色蕓豆胰蛋白酶抑制劑具有良好的熱穩(wěn)定性(90 ℃以下其均有活性)及pH穩(wěn)定性(pH為0～14其均能保持活性)。俞紅恩等[23]在極端環(huán)境(酸、堿、鹽、熱及振蕩等)處理蕓豆粗提液,其胰蛋白酶抑制劑殘余活性、亞基相對含量及亞基數(shù)目變化的結(jié)果一致,表明胰蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定特性是由具備相應穩(wěn)定特性的亞基決定的。

4 蕓豆胰蛋白酶抑制劑的功能研究

蕓豆胰蛋白酶抑制劑是一類抗營養(yǎng)因子,但其也能作為活性蛋白參與生理代謝活動的調(diào)控,如抗癌細胞增殖、抗蟲及降糖作用等,其應用范圍較廣且前景良好。

Chan等[3]發(fā)現(xiàn)棕色蕓豆的胰蛋白酶抑制劑能較好抑制乳腺癌細胞MCF7增殖(IC50為71.52 μmol/L),對肝癌細胞HepG2和胎肝細胞WRL68的增殖也有一定的抑制作用(IC50為110 μmol/L)。Mittal等[5]探討蕓豆胰蛋白酶抑制劑抗蟲的作用機理,發(fā)現(xiàn)蕓豆蛋白酶抑制劑能抑制鈴夜蛾屬(Helicoverpa)棉鈴蟲(H.armigera)和斜紋夜蛾屬(Spodoptera)斜紋夜蛾(S.litura)腸道類似胰蛋白酶的蛋白酶,其抑制活性分別為59.5%～91.7%及4.7%～29%;蕓豆胰蛋白酶抑制劑飼喂棉鈴蟲及斜紋夜蛾幼蟲,將會降低幼蟲體重及導致幼蟲死亡,致死率分別為46.7%和13.3%,且將延長幼蟲的化蛹時間;當用蕓豆胰蛋白酶抑制劑飼喂棉鈴蟲及斜紋夜蛾成蟲,其致死率分別為60%及13.3%。蕓豆胰蛋白酶抑制劑對鱗翅目昆蟲有一定的抑制作用,可將蕓豆胰蛋白酶抑制劑的基因轉(zhuǎn)移到其他植物中,提高植物對鱗翅目昆蟲的抗性。王靜等[6]探討紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑的降糖作用,發(fā)現(xiàn)紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑能降低四氧嘧啶誘導的血糖升高,且能降低總膽固醇(TC),對治療糖尿病有一定作用。

5 不同加工方式對蕓豆胰蛋白酶抑制劑的影響

蕓豆中胰蛋白酶抑制劑一方面限制了蕓豆的利用方式,但另一方面又能參與機體生理代謝活性,因此需選擇恰當?shù)募庸し绞浇档突蛉コ|豆胰蛋白酶抑制劑。為了拓展蕓豆的利用范圍,可采用多種加工處理方法(如浸泡、烹煮、高壓滅菌、電離輻射、烹調(diào)、烘烤、脫殼、萌芽、發(fā)酵、化學物質(zhì)處理、酶處理及擠壓蒸煮等)降低及去除胰蛋白酶抑制劑。這些加工方式主要是增強種皮滲透性,使胰蛋白酶抑制劑遷移到介質(zhì)中(如浸泡、萌發(fā)等),或改變胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構(如擠壓蒸煮等),從而降低或去除蕓豆胰蛋白酶抑制劑。

El-Hag等[24]對紅蕓豆進行萌發(fā)處理,發(fā)現(xiàn)萌發(fā)使紅蕓豆的胰蛋白酶抑制劑降低了約50%。El-Hady等[25]探討浸泡后不同擠壓條件(滾筒溫度、進料水分含量)對蕓豆胰蛋白酶抑制劑的影響,發(fā)現(xiàn)浸泡后蕓豆胰蛋白酶抑制劑活性降低1.5%,擠壓后無抑制活性。Wang等[26]研究蒸煮對蕓豆胰蛋白酶抑制劑的影響,用去離子水室溫下浸泡蕓豆24 h(蕓豆∶水(w/w)=1∶4),用自動Mattson蒸煮器對蕓豆進行蒸煮,發(fā)現(xiàn)蒸煮后蕓豆胰蛋白酶抑制活性從10.9 mg/g干物質(zhì)降至1.02 mg/g干物質(zhì)。Khattab等[27]發(fā)現(xiàn)浸泡、熱處理(蒸煮、烘烤、微波烹飪及高壓滅菌)、發(fā)酵、微粉化等都能降低蕓豆胰蛋白酶抑制劑含量。Shimelis等[28]探討浸泡、萌發(fā)、蒸煮、高壓滅菌及其組合對蕓豆抗營養(yǎng)因子的影響,發(fā)現(xiàn)蒸煮及高壓滅菌能有效降低蕓豆中的胰蛋白酶抑制劑含量,浸泡后進行高壓滅菌的組合處理效果更佳。

6 總結(jié)與展望

中國西北地區(qū)和西南地區(qū)蕓豆種植面積較廣,現(xiàn)階段主要進行粗加工,精深加工產(chǎn)品較少,抗營養(yǎng)因子—胰蛋白酶抑制劑限制了蕓豆的利用范圍,對蕓豆胰蛋白酶抑制劑的性質(zhì)、分類、提取純化、功能特性等的研究現(xiàn)狀進行概述,將為去除蕓豆中抗營養(yǎng)因子——胰蛋白酶抑制劑提供理論基礎。全面了解蕓豆胰蛋白酶抑制劑從提取、純化到功能特性的研究近況,充分利用其抗蟲、降糖、抑制癌細胞增殖活性,將其運用于生物農(nóng)藥及臨床治療。

學者進行了不同加工技術對蕓豆胰蛋白酶抑制劑的影響研究,不僅充分認識這些加工技術是如何影響胰蛋白酶抑制劑含量,還為蕓豆前處理加工技術的選擇提供理論指導。通過學者研究發(fā)現(xiàn)不同加工技術對蕓豆胰蛋白酶抑制劑的影響存在輕微差異,但主要通過改變蕓豆種皮的通透性及改變蕓豆胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構,從而降低蕓豆籽粒中胰蛋白酶抑制劑含量。

[1]吳躍. 雜糧特性與綜合加工利用[M]. 北京:科學出版社,2016:164-176.

[2]韓晶,鄭文彬,王穎,等. 黑龍江蕓豆主栽品種營養(yǎng)價值的評價[J]. 食品科技,2016,41(3):99-104.

[3]Chan YS,Zhang Y,Ng TB. Brown kidney bean bowman-birk trypsin inhibitor is heat and pH stable and exhibits anti-proliferative Activity[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology,2013,169(4):1306-1314.

[4]Sriket C,Benjakul S,Visessanguan W,et al. Effect of legume seed extracts on the inhibition of proteolytic activity and muscle degradation of fresh water prawn(Macrobrachiumrosenbergii)[J].Food Chemistry,2011,129(3):1093-1099.

[5]Mittal A,Kansal R,Kalia V,et al. A kidney bean trypsin inhibitor with an insecticidal potential against Helicoverpa armigera,and Spodoptera litura[J]. Acta Physiologiae Plantarum,2014,36(2):525-539.

[6]王靜,朱慶華,陳杰. 紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑的分離純化及降糖作用研究[J]. 臨床合理用藥雜志,2015(9):126-127.

[7]Sun LC,Yoshida A,Cai QF,et al. Mung bean trypsin inhibitor is effective in suppressing the degradation of myofibrillar proteins in the skeletal muscle of blue scad(Decapterusmaruadsi)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(24):12986-12992.

[8]宋欣欣,段小娟,徐穎,等. 豆類種籽中胰蛋白酶抑制劑研究進展[J]. 糧食與油脂,2016,29(6):1-4.

[9]俞紅恩,康玉凡. 豆類胰蛋白酶抑制劑研究進展[J]. 食品工業(yè),2017(4):265-269.

[10]ElShamei Z,Wu JW,Haard NF. Influence of wound injury on accumulation of proteinase inhibitors in leaf and stem tissues of two processing tomato cultivars[J]. Journal of Food Biochemistry,2010,20(5):155-171.

[11]王榮春,孫建華,何述棟,等. 胰蛋白酶抑制劑的結(jié)構與功能研究進展[J]. 食品科學,2013,34(9):364-368.

[12]張兵,趙明沂,張嶸. 絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究進展[J]. 沈陽藥科大學學報,2014(10):836-842.

[13]Bhattacharyya A,Mazumdar S,Leighton SM,et al. A Kunitz proteinase inhibitor from Archidendron ellipticum seeds:purification,characterization,and kinetic properties[J]. Phytochemistry,2006,67(3):232-241.

[14]羅玉嬌,李濱,舒衡平,等. Kunitz型胰蛋白酶抑制劑的研究進展[J]. 中國生化藥物雜志,2012,33(3):316-319.

[15]趙洪錕,李啟云,王玉民,等. 大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑(SKTI)研究進展[J]. 大豆科學,2002,21(3):218-222.

[16]Onesti S,Brick P,Blow DM. Crystal structure of a Kunitz-type trypsin inhibitor from Erythrina caffra seeds[J]. Journal of Molecular Biology,1991,217(1):153-176.

[17]王長良,張永忠,孫志剛. Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制劑研究進展[J]. 大豆科學,2007,26(5):757-761.

[18]趙現(xiàn)明. 豆類胰蛋白酶抑制劑的提取分離及純化[D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學,2013.

[19]劉盈盈,洪江,楊玲,等. 紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑的分離和純化[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學,2009,37(15):6869-6871.

[20]Wati RK,Theppakorn T,Benjakul S,et al. Trypsin inhibitor from 3 legume seeds:fractionation and proteolytic inhibition study[J]. Journal of Food Science,2010,75(3):C223-C228.

[21]張倫,劉盈盈,楊玲,等. 紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑粗提條件優(yōu)化及穩(wěn)定性研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報,2009,22(4):927-930.

[22]劉盈盈,楊玲,楊建光,等. 紫花蕓豆胰蛋白酶抑制劑部分性質(zhì)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學,2011,39(16):9473-9476.

[23]俞紅恩,康玉凡. 豆類胰蛋白酶抑制劑亞基特性研究[J].食品工業(yè)科技,2017,38(9):133-138.

[24]El-Hag N,Haard NF,Morse RE. Influence of sprouting on the digestibility coefficient,trypsin inhibitor and globulin proteins of red kidney beans[J]. Journal of Food Science,1978,43(6):1874-1875.

[25]Abd Eihady EA,Habiba RA. Effect of soaking and extrusion conditions on antinutrients and protein digestibility of legume seeds[J]. LWT-Food Science and Technology,2003,36(3):285-293.

[26]Wang N,Hatcher DW,Tyler RT,et al. Effect of cooking on the composition of beans(PhaseolusvulgarisL.)and chickpeas(CicerarietinumL.)[J]. Food Research International,2010,43(2):589-594.

[27]Khattab RY,Arntfield SD. Nutritional quality of legume seeds as affected by some physical treatments:Part 2.Antinutritional factors[J]. LWT-Food Science and Technology,2009,42(6):1113-1118.

[28]Shimelis EA,Rakshit SK. Effect of processing on antinutrients andinvitroprotein digestibility of kidney bean(PhaseolusvulgarisL.)varieties grown in East Africa[J]. Food Chemistry,2007,103(1):161-172.