單料米醋和雙料米醋的揮發(fā)性成分分析

祁勇剛，李攀恒，毛志海，胡 勇，孫 俊，高 冰，黃 煌*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430068；2.湖北華信制藥有限公司，湖北 赤壁 437400；3.南京天匯生物技術(shù)裝備有限公司，江蘇 南京 210009）

食醋作為一種全球享用的酸性調(diào)味品，由于其低廉的價格、食用安全無污染的特性，深受消費者喜愛。我國的谷物醋作為世界三大食醋品種[1]（谷物醋、果醋、酒醋）之一，由于其具有來源廣泛，微生物種類多、工藝獨特，色澤誘人、口感柔和、香型協(xié)調(diào)，低糖、營養(yǎng)豐富等得天獨厚的優(yōu)勢，受到了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，并展開科學(xué)研究[2-5]。

目前，我國已經(jīng)形成一批有競爭力的食醋品牌，尤其是代表四大名醋的企業(yè)品牌，但食醋市場仍以每年8%的速度增長，行業(yè)發(fā)展?jié)摿θ匀痪薮骩6-10]。一方面，由于食醋行業(yè)機械化、自動化程度低，受原材料價格上漲、人力成本的提高；另一方面，面對食醋日益增長的需求，矛盾逐漸顯現(xiàn)，大多數(shù)企業(yè)部分丟棄了傳統(tǒng)的食醋發(fā)酵方法[11]，改用半機械化的方式釀醋，從而導(dǎo)致食醋品質(zhì)的降低[12]，而這與人們對食醋日益多樣的高品質(zhì)消費需求反差越來越大。因此，越來越多的學(xué)者開始對食醋品質(zhì)的提高進行了深入而廣泛地研究[13-15]，包括微生物、糖化發(fā)酵劑、工藝、設(shè)備、陳釀、香氣成分、功效成分等方面。后來旺等[13]研究了食醋大曲培養(yǎng)溫度對食醋品質(zhì)的影響，表明大曲培養(yǎng)溫度為32℃時，大曲中細菌最多、放線菌最少，霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)適當，釀造的食醋在色澤、滋氣味、體態(tài)等方面最佳；蔣忠等[14]研究了以大米為原料，采用乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵制備酒醪，優(yōu)化了發(fā)酵工藝條件，再經(jīng)液態(tài)深層發(fā)酵制備的食醋，不揮發(fā)酸和酯類含量較優(yōu)化前分別提高了10.25倍和1.62倍，改善了食醋品質(zhì)；趙敏等[15]采用自吸式發(fā)酵罐液態(tài)深層半連續(xù)法結(jié)合傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，篩選原料、添加糖化曲、多菌種協(xié)同發(fā)酵釀造食醋，總酸≥6.0g/100mL、不揮發(fā)酸≥0.5g/100mL，達到固態(tài)醋的國標要求；黃文韜[16]研究了溫度、微波、超聲波對食醋陳化的影響，通過合理處理，顯著提高了食醋總酯的含量。

有關(guān)食醋的研究大多數(shù)是針對釀造微生物、發(fā)酵工藝、陳釀技術(shù)、質(zhì)量、揮發(fā)性成分等方面進行的研究[17-21]，少見有對食醋的釀造原料對食醋品質(zhì)與香氣成分進行系統(tǒng)的研究，也未有專用于釀醋的原料[22]。為了釀造口感更柔和、香氣更濃郁、氨基酸態(tài)氮含量更高的高品質(zhì)米醋，特分別以大米、大米與豆粕為原料，選用麥曲作為糖化發(fā)酵劑，采用固態(tài)發(fā)酵罐分別釀造了單料米醋和雙料米醋，采用頂空固相微萃?。╤ead space-solidphase micro-extraction，HS-SPME）和氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析了兩種米醋的揮發(fā)性成分，探索和比較原料營養(yǎng)成分對米醋香氣成分的影響，驗證采用大米和豆粕為原料可提高米醋品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大米、豆粕、麩皮、谷殼：市售；麥曲：河南界中醋業(yè)集團有限公司。

1.1.2 試劑

乙酸乙酯、苯乙醇、乙酸、2-辛醇、乳酸乙酯（均為色譜純）：美國Sigma公司。

1.1.3 菌種與培養(yǎng)基

安琪釀酒高活性干酵母、安琪生香釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌AS1.01：廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

醋酸菌活化培養(yǎng)基：1%葡萄糖、1%酵母膏、2%瓊脂，115℃滅菌15 min后冷卻至50℃加入1%碳酸鈣和體積分數(shù)為3%的乙醇溶液。

醋酸菌液體種子培養(yǎng)基：1%葡萄糖、1%酵母膏、115℃滅菌15 min后冷卻至50℃加入體積分數(shù)4%的乙醇溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

SPME手動進樣器、75 μm CAR-PDMS、100 μm PDMS萃取頭：美國Supelco公司；7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國安捷倫公司；PC-420磁力恒溫攪拌器：美國Corning公司；HRN32手持折射儀：德國托摩根公司；SW-CJ-2D凈化工作臺：廣州瑞智科學(xué)儀器有限公司；LHS-250SC型智能型恒溫恒濕箱：上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；SLY-2112B型立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床：金壇市盛藍儀器制造有限公司；YM系列A型立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；QDWZⅠ3000-7D濕法粉碎機：無錫輕大食品有限公司；50 L自動機械攪拌控溫發(fā)酵罐、500 L自動機械攪拌控溫發(fā)酵罐、0.5 t固態(tài)醋酸發(fā)酵罐：南京天匯生物技術(shù)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米醋的釀造工藝流程及操作要點

單料米醋工藝流程：

操作要點：

原料粉碎：單料米醋以大米為主要糖源，雙料米醋以大米、豆粕（質(zhì)量比為8∶2）為主要糖源，原料均采用濕法粉碎機粉碎。

糊化、糖化：采用蒸汽加熱，蒸煮糊化，50℃保溫，加入麥曲糖化。

活化酵母：按說明書活化安琪釀酒高活性干酵母和安琪生香釀酒高活性干酵母。

酒精發(fā)酵：將活化好的酵母菌，加入大米糖化醪，混合均勻，33℃保溫、密封，開始酒精發(fā)酵，至酒精度不再上升時，發(fā)酵結(jié)束，得酒醪。

種子液制備：按照工業(yè)用醋酸菌培養(yǎng)步驟[15]，制備醋酸菌種子液。

固態(tài)醋酸發(fā)酵：將100kg麩皮和125kg谷殼混合均勻加入0.5t固態(tài)醋酸發(fā)酵罐內(nèi)，加入酒醪，攪拌均勻，35℃保溫，接著均勻撒入制備好的醋酸菌種子液10 L，2 h后開始發(fā)酵，每隔24h翻醅，當總酸含量不變時，發(fā)酵結(jié)束。

后處理：封醅1個月后，醋醅與水按1∶1的質(zhì)量比淋醋，淋出的醋液煮沸15 min，陶罐陳釀3個月。

1.3.2 樣品處理

將5 mL米醋樣品置于15 mL樣品瓶中，加入2.5 g氯化鈉，將SPME萃取頭通過瓶蓋插入到樣品的頂空部分，退出纖維頭，50℃頂空吸附40 min，攪拌轉(zhuǎn)速250 r/min，萃取完成后抽回纖維頭，從樣品瓶中拔出萃取頭，再將萃取頭插入氣相色譜進樣口進行解吸。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：DB-WAX毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣（He）；流速：1 mL/min，不分流；進樣口溫度250℃；柱溫：起始溫度32℃，以3℃/min升溫至120℃，再以10℃/min升溫至250℃，保持10 min。進樣量：5 μL。

質(zhì)譜條件：接口溫度250℃，離子源溫度230℃，電離方式為電子電離（electronionization，EI）源，電子能量為70eV，四級桿溫度為150℃，傳輸線溫度為280℃，掃描質(zhì)量范圍33～450 amu。

1.3.4 指標測定

糖度：使用HRN32手持折射儀測定；酒精度：采用國標GB/T13662—2008《黃酒》中的酒精度方法測定；總酸、不揮發(fā)酸、可溶性無鹽固形物：采用國標GB 18187—2000《釀造食醋》中的方法測定；還原糖：采用國標GB/T5009.7—2008《食品中還原糖的測定》中的方法測定；氨基酸態(tài)氮：采用國標GB 18186—2000《釀造醬油》中的方法測定；總酯：采用國標GB/T 19777—2013《地理標志產(chǎn)品山西老陳醋》中的方法測定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

通過NIST08標準譜庫自動檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，按照標準譜圖及保留指數(shù)對機檢結(jié)果進行核對和確認，列舉揮發(fā)性成分的鑒定結(jié)果并比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單料米醋和雙料米醋的質(zhì)量評價

單料和雙料發(fā)酵釀造的米醋在感官指標上基本一致，深褐色、有光澤，體態(tài)均一、較濃稠，有少許沉淀，滋味柔和，但在口感和香氣方面有差別，單料米醋口感純凈，酯香濃郁，香氣持久；而雙料米醋口感醇厚，酯香、焦香、醬香協(xié)調(diào)，香氣持久。

單料和雙料發(fā)酵釀造的米醋的理化指標見表1。

表1 兩種米醋的理化指標測定結(jié)果Table 1 Determination results of physical and chemical indexes of two kinds of rice vinegar

由表1可知，以大米和豆粕為主料發(fā)酵釀造的雙料米醋的不揮發(fā)酸、氨基酸態(tài)氮、可溶性無鹽固形物和總酯的含量（2.15g/100mL、0.35g/100mL、6.51g/100mL、0.43g/100mL）明顯高于以大米為主料制備的單料米醋，正是由于不揮發(fā)酸、氨基酸態(tài)氮和可溶性無鹽固形物的高含量，使得雙料米醋滋味更柔和，口感醇厚，酯香、焦香、醬香等香氣協(xié)調(diào)。

2.2 單料米醋和雙料米醋的揮發(fā)性風味成分分析

單料米醋和雙料米醋的揮發(fā)性風味成分的GC-MS總離子流色譜圖見圖1，對所有成分經(jīng)譜庫檢索和其他方法核實，從制備的2種米醋中共鑒定出51種揮發(fā)性化合物，結(jié)果見表2，占到各自總揮發(fā)性成分的94.46%和92.65%。

圖1 單料米醋（A）和雙料米醋（B）揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in rice vinegar fermented by single raw material(A)and two raw materials(B)

表2 單料米醋和雙料米醋揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Table 2 Results of volatile components in rice vinegar fermented by single raw material and two raw materials analysis by GC-MS

續(xù)表

由圖1（A）和表1可知，單料米醋中的揮發(fā)性成分36種，占其總揮發(fā)性成分的94.46%。其中醇類3種、醛類6種、酮類2種、酸類4種、酯類11種、烴類4種、吡嗪類4種、其他2種，各類成分分別占總揮發(fā)性成分的比例為4.22%、55.44%、1.24%、29.55%、4.97%、1.94%、0.71%和1.39%。含量超過1%的揮發(fā)性成分為苯乙醇（3.83%）、糠醛（49.30%）、3-羥基-2-丁酮（1.02%）、乙酸（27.18%）、3-甲基丁酸（1.51%）、乙酸乙酯（1.02%）、乙酸異戊酯（1.06%）、乳酸乙酯（1.13%）、正十一烷（1.71%）、2-甲氧基-4-甲基苯酚（1.27%）。

由圖1（B）和表1可知，雙料米醋中的揮發(fā)性成分48種，占總揮發(fā)性成分的92.65%。其中醇類5種、醛類9種、酮類3種、酸類5種、酯類12種、烴類3種、吡嗪類4種、其他7種，各類成分分別占總揮發(fā)性成分的比例為4.47%、48.34%、1.65%、27.27%、7.19%、1.83%、1.10%和0.80%。含量超過1%的揮發(fā)性成分為苯乙醇（3.11%）、糠醛（47.06%）、3-羥基-2-丁酮（1.35%）、乙酸（25.45%）、3-甲基丁酸（1.51%）、乳酸乙酯（1.04%）、丙酸-2-苯乙酯（2.17%）、己酸乙酯（1.21%）、正十一烷（1.61%）。

2.3 單料米醋和雙料米醋的揮發(fā)性風味成分對比分析

單料米醋以大米為糖源，而雙料米醋以大米和豆粕為糖源，兩者均采用固態(tài)醋酸發(fā)酵方法釀造，原料的不同可能對米醋的揮發(fā)性成分產(chǎn)生一定的影響。由表1可知，兩種米醋揮發(fā)性成分差異較大，雙料米醋的揮發(fā)性成分有48種，而單料米醋的揮發(fā)性成分只有36種。二者相同的揮發(fā)性成分共有33種，其中醇類3種，醛類5種，酮類2種，酸類4種，酯類10種，烴類3種，吡嗪類4種，其他2種。由于兩種米醋均由大米作為主要原料，且釀造工藝一致，所以他們大部分的揮發(fā)性成分種類相同。

兩種米醋中，含量較高的相同揮發(fā)性成分為苯乙醇（單料米醋 3.83%、雙料米醋3.11%）、糠醛（49.30%、47.06%）、3-羥基-2-丁酮（1.02%、1.35%）、乙酸（27.18%、25.45%）、3-甲基丁酸（1.51%、1.19%）、乳酸乙酯（1.13%、1.04%）、正十一烷（1.71%、1.61%），兩種醋中糠醛的含量均最高，根據(jù)對醋酸發(fā)酵過程中的糠醛含量的定期測定，發(fā)現(xiàn)糠醛含量在醋酸發(fā)酵過程中其含量緩慢增加，在封醅、煮制、淋醋和陳釀的過程中含量增速提高。

單料米醋特有的成分有3種，分別為2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-羧醛（0.05%）、3-羥基-2-丁酮-乙酸酯（0.17%）、苯乙烯（0.02%），總量為0.24%；雙料米醋中特有成分有15種，分別為糠醇（0.13%）、苯甲醇（0.11%）、己醛（0.06%）、辛醛（0.03%）、5-甲基呋喃醛（0.22%）、2-吡咯甲醛（0.04%）、4-（2-呋喃基）-3-丁烯-2-酮（0.03%）、辛酸（0.05%）、丙酸-2-苯乙酯（2.17%）、己酸辛酯（0.19%）、2-乙?；秽?.25%）、5-甲基-2-乙?；秽?.05%）、鄰甲氧基苯酚（0.04%）、2-乙?；量?.02%）、4-乙基苯酚（0.02%），總量為3.41%。相比單料米醋，雙料米醋中的揮發(fā)性成分減少3種，新增15種，其中新增醇類2種、醛類4種、酮類1種、酸類1種、酯類2種、其他5種，包括鄰甲氧基苯酚（愈創(chuàng)木酚），揮發(fā)性成分種類增多，可能是由于豆粕的加入，提供了蛋白、脂質(zhì)、纖維素等營養(yǎng)成分，降解后，經(jīng)過復(fù)雜的代謝和生化反應(yīng)而生成的。

單料米醋中，典型的揮發(fā)性成分有苯乙醇、糠醛、3-羥基-2-丁酮-乙酸酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯，這些為米醋特有的香氣成分，其中3-羥基-2-丁酮-乙酸酯（乙偶姻）為合成川芎嗪的前體物質(zhì)。雙料米醋中，由于豆粕的加入，揮發(fā)性成分發(fā)生顯著的變化，其中苯乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯百分含量降低，而乙酸異丁酯、己酸乙酯、丁酸乙酯顯著提高，新增丙酸-3-苯乙酯、己酸辛酯、鄰甲氧基苯酚等香氣成分，提高了米醋的香氣，豐富了米醋的香型，提升了米醋的品質(zhì)。

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定了分別以大米、大米和豆粕為原料釀造的單料米醋和雙料米醋中的揮發(fā)性成分，分別從2種米醋中檢測出48種和36種揮發(fā)性成分，占各自總揮發(fā)性成分的94.46%和92.65%。2種方法制備的米醋中，都含有醇類、醛類、酮類、酸類、酯類、烴類、吡嗪類、苯酚和呋喃類物質(zhì)，醛類、酸類、酯類和吡嗪類是米醋中主要的揮發(fā)性成分。

單料米醋中含有3種雙料米醋中未有的揮發(fā)性成分；雙料米醋比單料米醋多12種揮發(fā)性成分，且有更高含量的游離氨基酸，米醋口感更柔和、提高了香氣、豐富了香型，提升了產(chǎn)品品質(zhì)，豆粕原料來源廣、處理簡單、因此，選用大米和豆粕釀造的高品質(zhì)雙料米醋值得推廣應(yīng)用。

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