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    3種動物源性成分陽性質(zhì)粒構(gòu)建及檢測研究

    2018-03-24 03:01:18郭穎慧鄭世超霍勝楠
    食品研究與開發(fā) 2018年6期
    關(guān)鍵詞:狐貍靈敏度質(zhì)粒

    郭穎慧,鄭世超,霍勝楠

    (山東省食品藥品檢驗研究院,山東濟南250101)

    近年來,我國食品業(yè)進入了飛速發(fā)展的黃金時期,禽畜類肉制品及其制品豐富了廣大人民群眾的餐桌,然而狐貍?cè)狻ⅠR肉冒充牛肉、驢肉等事件不斷出現(xiàn),對我國動物源性食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了極大的誠信危機,對食品安全性日常監(jiān)管、檢測技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。當(dāng)前,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)為基礎(chǔ)的核酸檢測技術(shù)在動物源性成分檢測方法上日趨成熟。PCR技術(shù)主要是通過熱循環(huán),實現(xiàn)對目的基因片段的大量擴增。因其具有快速、靈敏、特異性高等特點,已被廣泛應(yīng)用于食品成分摻假鑒別檢測中[1]。意大利研究者利用PCR技術(shù)檢測牛線粒體脫氧核糖核酸(Deoxyribose Nucleic Acid,DNA)片段以檢測動物源性飼料中牛源性成分并對PCR產(chǎn)物進行測序確證,檢測靈敏度可達0.125%[2],美國也建立了應(yīng)用PCR技術(shù)快速檢測動物源性飼料中牛源性成分的方法[3]。

    在應(yīng)用PCR方法進行動物源性成分檢測時,通常需要陽性材料作為質(zhì)控對照。然而,典型的陽性材料經(jīng)常難以獲取,而附有證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜、價格昂貴等問題,已成為檢測方法建立和應(yīng)用的瓶頸[4]。為了解決這一難題,眾多機構(gòu)都在研究用陽性質(zhì)粒分子替代基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[5]。陽性質(zhì)粒分子具有很多優(yōu)點:1)可以根據(jù)需要進行設(shè)計,同一個標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時包含多個外源目的基因;2)不需要煩瑣的動物基因提取和分子鑒定;3)可以通過微生物進行大量培養(yǎng),容易操作和保存;4)質(zhì)粒DNA純度較高;5)在轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測過程中,陽性質(zhì)粒分子根據(jù)分子量大小與動物基因組DNA分子換算,也可以完成樣品的定量分析[6]。

    試劑盒作為一種新型快速檢測分析方法,其作為商品化定型產(chǎn)品的屬性被長期忽略,多數(shù)試劑盒產(chǎn)品并非等同國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)指標(biāo),尤其是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物技術(shù)在試劑盒研發(fā)中的廣泛使用,使試劑盒的應(yīng)用、結(jié)果判定工作缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、令人信服的技術(shù)依據(jù),相應(yīng)的評價技術(shù)研究和發(fā)展普遍滯后于檢測技術(shù)。本研究針對以上存在問題,完成了狐貍、驢、馬檢測陽性質(zhì)粒分子的構(gòu)建,進行了方法特異性、靈敏度的驗證,同時對國內(nèi)3種品牌DNA聚合酶檢測效果進行對比。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 質(zhì)粒的合成

    通過NCBI網(wǎng)站BLAST序列比對分析,選擇狐貍線粒體色素氧化酶I亞基基因(COI)、驢線粒體ATPase6基因、馬線粒體ATPase6基因特異序列[7-9],合成DNA序列,鏈接pGEM-T Easy載體,構(gòu)建相應(yīng)陽性質(zhì)粒DNA分子。序列合成由濟南博尚生物技術(shù)有限公司完成。

    1.1.2 實時熒光PCR檢測引物、探針的合成

    通過NCBI網(wǎng)站BLAST序列比對分析,選擇狐貍線粒體色素氧化酶I亞基基因(COI)、驢線粒體ATPase6基因、馬線粒體ATPase6基因特異序列,合成引物、探針[7-9]。序列合成由濟南博尚生物技術(shù)有限公司完成。

    1.1.3 實時熒光PCR檢測試劑的選購

    DNA 聚合酶:BioFlux公司 BioReady rTaq、TIANGEN 公司 Taq DNA Polymerase(Mg2+free)、TaKaRa公司 TaqTM(with Mg2+free Buffer);dNTP、PCR 反應(yīng)預(yù)混液:BioFlux公司、TIANGEN公司、TaKaRa公司。檢測用其他試劑,均為分析純。

    1.2 主要儀器

    NanoDrop 2000c紫外可見分光光度計:美國Thermo公司;7500 FAST實時熒光PCR儀:美國ABI公司;5424R小型臺式冷凍離心機:德國Eppendorf公司。

    1.3 實時熒光PCR檢測

    1.3.1 狐貍成分檢測實時熒光PCR法反應(yīng)體系

    體積為 25 μL,樣品 DNA(10 μg/mL~100 μg/mL)2 μL,狐貍引物各(10 μmol/L)0.5 μL,狐貍探針(10 μmol/L)0.5 μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.3 μL,dNTP(各 2.5 mmol/L)2 μL,10×PCR 緩沖液 2.5 μL,水16.7 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 2 min;95℃變性15 s,60℃退火40 s,60℃收集熒光,45個循環(huán)。

    1.3.2 驢成分檢測實時熒光PCR法反應(yīng)體系

    體積為25 μL,包括實時熒光PCR反應(yīng)混合液12.5 μL(DNA 聚合酶 2 U,熒光 PCR 緩沖液,Mg2+2.5 mmol/L,dNTP0.25mmol/L)。引物對及探針(10nmol/L)各 1 μL,模板 DNA(100 ng±50 ng)2 μL,補足雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性30 s,60℃退火40 s,60℃收集熒光,40個循環(huán)。

    1.3.3 馬成分檢測實時熒光PCR法反應(yīng)體系

    體積為25 μL,包括實時熒光PCR反應(yīng)混合液12.5 μL(DNA 聚合酶 2 U,熒光 PCR 緩沖液,Mg2+2.5 mmol/L,dNTP 0.25mmol/L)。引物對及探針(10 nmol/L)各 1 μL,模板 DNA(100 ng±50 ng)2 μL,補足雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性30 s,60℃退火40 s,60℃收集熒光,40個循環(huán)。

    試驗結(jié)果應(yīng)用ABI 7500 FAST Software v2.0.1進行分析處理。依據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)判定CT值小于或等于35的擴增陽性結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗證

    按照1.3方法,對所構(gòu)建的狐貍、驢、馬陽性質(zhì)粒分子進行特異性驗證,同時選取狐貍?cè)狻ⅢH肉、馬肉基因組DNA作為陽性對照品,雞肉基因組DNA作為陰性對照品,水作為空白對照,進行3種陽性質(zhì)粒分子特異性驗證。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),所構(gòu)建的3種質(zhì)粒分子均可以作為實時熒光PCR反應(yīng)陽性對照品來使用,方法特異性良好(圖1~圖3)。

    2.2 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗證

    將3種陽性質(zhì)粒分子按10倍遞增逐級稀釋,自100 ng/μL濃度稀釋至10-4ng/μL,分別做方法靈敏度驗證(圖 4~圖 6)。

    圖1 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗證結(jié)果(狐貍)Fig.1 Results of the specificity of positive plasmid(fox)

    圖2 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗證結(jié)果(驢)Fig.2 Results of the specificity of positive plasmid(donkey)

    圖3 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗證結(jié)果(馬)Fig.3 Results of the specificity of positive plasmid(horse)

    檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)3種質(zhì)粒濃度從100 ng/μL~10-4ng/μL時,均可在40個循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)實時熒光PCR顯著擴增曲線。

    一般認為,當(dāng)檢測Ct值小于35時可判斷實時熒光PCR檢測結(jié)果為陽性,以能夠測出樣品最低模板濃度為相應(yīng)反應(yīng)的檢測下限[10]。因此,狐貍、驢、馬陽性質(zhì)粒分子的檢測方法靈敏均為10-4ng/μL。

    2.3 3種品牌DNA聚合酶實時熒光PCR反應(yīng)效果比較

    將3種陽性質(zhì)粒分子按10倍遞增逐級稀釋,自100 ng/μL 濃度稀釋至 10-4ng/μL,分別選取 BioFlux公司BioReady rTaq、TIANGEN公司Taq DNA Polymerase(Mg2+free)、TaKaRa 公司 TaqTM(with Mg2+free Buffer)DNA聚合酶及其配套實時熒光PCR檢測試劑,進行實時熒光PCR反應(yīng)效果比較分析,結(jié)果見圖7~圖9。

    圖4 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗證結(jié)果(狐貍)Fig.4 Results of the sensitivity of positive plasmid(fox)

    圖5 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗證結(jié)果(驢)Fig.5 Results of the sensitivity of positive plasmid(donkey)

    圖6 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗證結(jié)果(馬)Fig.6 Results of the sensitivity of positive plasmid(horse)

    檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)3種質(zhì)粒濃度從100 ng/μL~1 ng/μL時,3個品牌DNA聚合酶實時熒光PCR檢測體系均可在40個循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)典型擴增曲線。總體上所有曲線的拐點清楚,指數(shù)增長期明顯,基線平穩(wěn)無上揚現(xiàn)象[11]。曲線指數(shù)期斜率大,表明擴增效率高,實際靈敏度、引物和探針效果好[12];擴增曲線的整體平行性好,重復(fù)性好,相鄰濃度標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線與曲線之間的間距都十分接近,是擴增效率都高的反應(yīng)。且圖中,基線起峰范圍適當(dāng),各檢測結(jié)果都在12~35之間,保證了定量的準(zhǔn)確性[11]。

    圖7 3種品牌DNA聚合酶狐貍陽性質(zhì)粒實時熒光PCR反應(yīng)效果比較Fig.7 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three brands of DNA polymerase for fox

    圖8 3種品牌DNA聚合酶驢陽性質(zhì)粒實時熒光PCR反應(yīng)效果比較Fig.8 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three brands of DNA polymerase for donkey

    圖9 3種品牌DNA聚合酶馬陽性質(zhì)粒實時熒光PCR反應(yīng)效果比較Fig.9 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three brands of DNA polymerase for horse

    根據(jù)圖 7 結(jié)果,分別利用 BioFlux、TaKaRa、TIANGEN公司DNA聚合酶進行實時熒光PCR反應(yīng),狐貍陽性質(zhì)粒實時熒光PCR檢測重復(fù)性較好,靈敏度的檢出下限分別為 1、10-4、10-2ng/μL,顯然,TaKaRa 公司DNA聚合酶的檢出限最低,靈敏度最高,而TIANGEN公司的DNA聚合酶相對于其他兩種品牌聚合酶反應(yīng)效率有一定的波動性。

    分別用BioFlux、TaKaRa、TIANGEN公司DNA聚合酶進行實時熒光PCR反應(yīng),驢陽性質(zhì)粒實時熒光PCR檢測重復(fù)性好,靈敏度的檢出下限分別為10-1、10-2、10-2ng/μL。因此,3個品牌公司的DNA聚合酶靈敏度與反應(yīng)效率均相差不大,TaKaRa、TIANGEN公司的DNA聚合酶比BioFlux公司的DNA聚合酶檢出下限低一個濃度梯度,且在質(zhì)粒模板含量為10-2ng/μL時,TaKaRa公司的DNA聚合酶反應(yīng)效率高于TIANGEN公司的DNA聚合酶反應(yīng)效率。

    分別利用 BioFlux、TaKaRa、TIANGEN 公司 DNA聚合酶進行實時熒光PCR反應(yīng),馬陽性對照質(zhì)粒實時熒光PCR檢測靈敏度的檢出下限分別為1、10-3、10-1ng/μL。可見,TaKaRa公司DNA聚合酶的檢出限最低,靈敏度高于BioFlux與TIANGEN公司的DNA聚合酶,并且,TIANGEN公司的DNA聚合酶靈敏度高于 BioFlux公司的 DNA聚合酶靈敏度,TaKaRa、BioFlux公司的DNA聚合酶重復(fù)性與反應(yīng)效率略優(yōu)于TIANGEN公司的DNA聚合酶。

    3 討論與結(jié)論

    高質(zhì)量的PCR反應(yīng)液是進行基因檢測和研究的前提。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)在食品檢測方面的廣泛應(yīng)用[13],各大實驗室和研究機構(gòu)都積極致力于靈敏度更高、效率更高、更準(zhǔn)確的實時熒光PCR反應(yīng)。本研究構(gòu)建了狐貍、驢、馬源性成分檢測的3種陽性質(zhì)粒分子,對3種質(zhì)粒分子的方法特異性、靈敏度進行了驗證,并對其關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)-PCR反應(yīng)液進行了驗證,對比不同廠家PCR反應(yīng)液實時熒光PCR反應(yīng)效率,驗證快速檢測方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性、與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法一致性等關(guān)鍵指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),3種廠家的實時熒光PCR反應(yīng)液均有較高的重復(fù)性和特異性,對于不同的陽性質(zhì)粒,不同品牌的DNA聚合酶在不同反應(yīng)中表現(xiàn)出不同的優(yōu)勢,總體來說,TaKaRa品牌的反應(yīng)液靈敏度要高于TIANGEN與BioFlux品牌的靈敏度。出現(xiàn)該結(jié)果的原因,除了不同品牌質(zhì)量參差不一,還可能由于以下原因造成:1)3種陽性質(zhì)粒的熒光定量PCR反應(yīng)體系中各組分終濃度不同,比如在以狐貍質(zhì)粒為模板的PCR反應(yīng)中,Taq DNA聚合酶的活力要求為 5 U/μL 取 0.3 μL(即 1.5U),而以驢、馬質(zhì)粒為模板的PCR反應(yīng)中,DNA聚合酶活力要求為2U;2)3種陽性質(zhì)粒的熒光定量PCR反應(yīng)條件不同;3)作為模板,3種陽性質(zhì)粒狐貍、驢、馬本身質(zhì)粒片段大小與長度不同。因此,為避免誤判,在進行分子實驗前需進行預(yù)實驗,優(yōu)化組合,選擇滿足實驗結(jié)果判定要求的DNA反應(yīng)液進行正式實驗。本研究結(jié)果為進行實時熒光定量PCR的反應(yīng)液選擇提供了一定的依據(jù),可促進檢驗基礎(chǔ)薄弱、技術(shù)能力有限的食品檢驗機構(gòu)動物源性成分檢測能力的提升,研究成果的應(yīng)用推廣將對保障我國食品安全監(jiān)督監(jiān)管發(fā)揮重要的作用,對于肉及肉制品中動物源性成分準(zhǔn)確可靠的鑒定具有重要意義和應(yīng)用前景。

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    [8]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 3730.4-2013食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第4部分:驢成分檢測實時熒光PCR法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014:1-5

    [9]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 3730.5-2013食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第5部分:馬成分檢測實時熒光PCR法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014:1-5

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