• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    3種動物源性成分陽性質(zhì)粒構(gòu)建及檢測研究

    2018-03-24 03:01:18郭穎慧鄭世超霍勝楠
    食品研究與開發(fā) 2018年6期
    關(guān)鍵詞:狐貍靈敏度質(zhì)粒

    郭穎慧,鄭世超,霍勝楠

    (山東省食品藥品檢驗研究院,山東濟南250101)

    近年來,我國食品業(yè)進入了飛速發(fā)展的黃金時期,禽畜類肉制品及其制品豐富了廣大人民群眾的餐桌,然而狐貍?cè)狻ⅠR肉冒充牛肉、驢肉等事件不斷出現(xiàn),對我國動物源性食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了極大的誠信危機,對食品安全性日常監(jiān)管、檢測技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。當(dāng)前,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)為基礎(chǔ)的核酸檢測技術(shù)在動物源性成分檢測方法上日趨成熟。PCR技術(shù)主要是通過熱循環(huán),實現(xiàn)對目的基因片段的大量擴增。因其具有快速、靈敏、特異性高等特點,已被廣泛應(yīng)用于食品成分摻假鑒別檢測中[1]。意大利研究者利用PCR技術(shù)檢測牛線粒體脫氧核糖核酸(Deoxyribose Nucleic Acid,DNA)片段以檢測動物源性飼料中牛源性成分并對PCR產(chǎn)物進行測序確證,檢測靈敏度可達0.125%[2],美國也建立了應(yīng)用PCR技術(shù)快速檢測動物源性飼料中牛源性成分的方法[3]。

    在應(yīng)用PCR方法進行動物源性成分檢測時,通常需要陽性材料作為質(zhì)控對照。然而,典型的陽性材料經(jīng)常難以獲取,而附有證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜、價格昂貴等問題,已成為檢測方法建立和應(yīng)用的瓶頸[4]。為了解決這一難題,眾多機構(gòu)都在研究用陽性質(zhì)粒分子替代基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[5]。陽性質(zhì)粒分子具有很多優(yōu)點:1)可以根據(jù)需要進行設(shè)計,同一個標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時包含多個外源目的基因;2)不需要煩瑣的動物基因提取和分子鑒定;3)可以通過微生物進行大量培養(yǎng),容易操作和保存;4)質(zhì)粒DNA純度較高;5)在轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測過程中,陽性質(zhì)粒分子根據(jù)分子量大小與動物基因組DNA分子換算,也可以完成樣品的定量分析[6]。

    試劑盒作為一種新型快速檢測分析方法,其作為商品化定型產(chǎn)品的屬性被長期忽略,多數(shù)試劑盒產(chǎn)品并非等同國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù)指標(biāo),尤其是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物技術(shù)在試劑盒研發(fā)中的廣泛使用,使試劑盒的應(yīng)用、結(jié)果判定工作缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、令人信服的技術(shù)依據(jù),相應(yīng)的評價技術(shù)研究和發(fā)展普遍滯后于檢測技術(shù)。本研究針對以上存在問題,完成了狐貍、驢、馬檢測陽性質(zhì)粒分子的構(gòu)建,進行了方法特異性、靈敏度的驗證,同時對國內(nèi)3種品牌DNA聚合酶檢測效果進行對比。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 質(zhì)粒的合成

    通過NCBI網(wǎng)站BLAST序列比對分析,選擇狐貍線粒體色素氧化酶I亞基基因(COI)、驢線粒體ATPase6基因、馬線粒體ATPase6基因特異序列[7-9],合成DNA序列,鏈接pGEM-T Easy載體,構(gòu)建相應(yīng)陽性質(zhì)粒DNA分子。序列合成由濟南博尚生物技術(shù)有限公司完成。

    1.1.2 實時熒光PCR檢測引物、探針的合成

    通過NCBI網(wǎng)站BLAST序列比對分析,選擇狐貍線粒體色素氧化酶I亞基基因(COI)、驢線粒體ATPase6基因、馬線粒體ATPase6基因特異序列,合成引物、探針[7-9]。序列合成由濟南博尚生物技術(shù)有限公司完成。

    1.1.3 實時熒光PCR檢測試劑的選購

    DNA 聚合酶:BioFlux公司 BioReady rTaq、TIANGEN 公司 Taq DNA Polymerase(Mg2+free)、TaKaRa公司 TaqTM(with Mg2+free Buffer);dNTP、PCR 反應(yīng)預(yù)混液:BioFlux公司、TIANGEN公司、TaKaRa公司。檢測用其他試劑,均為分析純。

    1.2 主要儀器

    NanoDrop 2000c紫外可見分光光度計:美國Thermo公司;7500 FAST實時熒光PCR儀:美國ABI公司;5424R小型臺式冷凍離心機:德國Eppendorf公司。

    1.3 實時熒光PCR檢測

    1.3.1 狐貍成分檢測實時熒光PCR法反應(yīng)體系

    體積為 25 μL,樣品 DNA(10 μg/mL~100 μg/mL)2 μL,狐貍引物各(10 μmol/L)0.5 μL,狐貍探針(10 μmol/L)0.5 μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.3 μL,dNTP(各 2.5 mmol/L)2 μL,10×PCR 緩沖液 2.5 μL,水16.7 μL。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 2 min;95℃變性15 s,60℃退火40 s,60℃收集熒光,45個循環(huán)。

    1.3.2 驢成分檢測實時熒光PCR法反應(yīng)體系

    體積為25 μL,包括實時熒光PCR反應(yīng)混合液12.5 μL(DNA 聚合酶 2 U,熒光 PCR 緩沖液,Mg2+2.5 mmol/L,dNTP0.25mmol/L)。引物對及探針(10nmol/L)各 1 μL,模板 DNA(100 ng±50 ng)2 μL,補足雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性30 s,60℃退火40 s,60℃收集熒光,40個循環(huán)。

    1.3.3 馬成分檢測實時熒光PCR法反應(yīng)體系

    體積為25 μL,包括實時熒光PCR反應(yīng)混合液12.5 μL(DNA 聚合酶 2 U,熒光 PCR 緩沖液,Mg2+2.5 mmol/L,dNTP 0.25mmol/L)。引物對及探針(10 nmol/L)各 1 μL,模板 DNA(100 ng±50 ng)2 μL,補足雙蒸水。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃變性30 s,60℃退火40 s,60℃收集熒光,40個循環(huán)。

    試驗結(jié)果應(yīng)用ABI 7500 FAST Software v2.0.1進行分析處理。依據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn)判定CT值小于或等于35的擴增陽性結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗證

    按照1.3方法,對所構(gòu)建的狐貍、驢、馬陽性質(zhì)粒分子進行特異性驗證,同時選取狐貍?cè)狻ⅢH肉、馬肉基因組DNA作為陽性對照品,雞肉基因組DNA作為陰性對照品,水作為空白對照,進行3種陽性質(zhì)粒分子特異性驗證。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),所構(gòu)建的3種質(zhì)粒分子均可以作為實時熒光PCR反應(yīng)陽性對照品來使用,方法特異性良好(圖1~圖3)。

    2.2 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗證

    將3種陽性質(zhì)粒分子按10倍遞增逐級稀釋,自100 ng/μL濃度稀釋至10-4ng/μL,分別做方法靈敏度驗證(圖 4~圖 6)。

    圖1 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗證結(jié)果(狐貍)Fig.1 Results of the specificity of positive plasmid(fox)

    圖2 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗證結(jié)果(驢)Fig.2 Results of the specificity of positive plasmid(donkey)

    圖3 陽性質(zhì)粒分子檢測方法特異性驗證結(jié)果(馬)Fig.3 Results of the specificity of positive plasmid(horse)

    檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)3種質(zhì)粒濃度從100 ng/μL~10-4ng/μL時,均可在40個循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)實時熒光PCR顯著擴增曲線。

    一般認為,當(dāng)檢測Ct值小于35時可判斷實時熒光PCR檢測結(jié)果為陽性,以能夠測出樣品最低模板濃度為相應(yīng)反應(yīng)的檢測下限[10]。因此,狐貍、驢、馬陽性質(zhì)粒分子的檢測方法靈敏均為10-4ng/μL。

    2.3 3種品牌DNA聚合酶實時熒光PCR反應(yīng)效果比較

    將3種陽性質(zhì)粒分子按10倍遞增逐級稀釋,自100 ng/μL 濃度稀釋至 10-4ng/μL,分別選取 BioFlux公司BioReady rTaq、TIANGEN公司Taq DNA Polymerase(Mg2+free)、TaKaRa 公司 TaqTM(with Mg2+free Buffer)DNA聚合酶及其配套實時熒光PCR檢測試劑,進行實時熒光PCR反應(yīng)效果比較分析,結(jié)果見圖7~圖9。

    圖4 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗證結(jié)果(狐貍)Fig.4 Results of the sensitivity of positive plasmid(fox)

    圖5 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗證結(jié)果(驢)Fig.5 Results of the sensitivity of positive plasmid(donkey)

    圖6 陽性質(zhì)粒分子檢測方法靈敏度驗證結(jié)果(馬)Fig.6 Results of the sensitivity of positive plasmid(horse)

    檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)3種質(zhì)粒濃度從100 ng/μL~1 ng/μL時,3個品牌DNA聚合酶實時熒光PCR檢測體系均可在40個循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)典型擴增曲線。總體上所有曲線的拐點清楚,指數(shù)增長期明顯,基線平穩(wěn)無上揚現(xiàn)象[11]。曲線指數(shù)期斜率大,表明擴增效率高,實際靈敏度、引物和探針效果好[12];擴增曲線的整體平行性好,重復(fù)性好,相鄰濃度標(biāo)準(zhǔn)品擴增曲線與曲線之間的間距都十分接近,是擴增效率都高的反應(yīng)。且圖中,基線起峰范圍適當(dāng),各檢測結(jié)果都在12~35之間,保證了定量的準(zhǔn)確性[11]。

    圖7 3種品牌DNA聚合酶狐貍陽性質(zhì)粒實時熒光PCR反應(yīng)效果比較Fig.7 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three brands of DNA polymerase for fox

    圖8 3種品牌DNA聚合酶驢陽性質(zhì)粒實時熒光PCR反應(yīng)效果比較Fig.8 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three brands of DNA polymerase for donkey

    圖9 3種品牌DNA聚合酶馬陽性質(zhì)粒實時熒光PCR反應(yīng)效果比較Fig.9 Comparation of the effective of real-time fluorescence PCR reaction of three brands of DNA polymerase for horse

    根據(jù)圖 7 結(jié)果,分別利用 BioFlux、TaKaRa、TIANGEN公司DNA聚合酶進行實時熒光PCR反應(yīng),狐貍陽性質(zhì)粒實時熒光PCR檢測重復(fù)性較好,靈敏度的檢出下限分別為 1、10-4、10-2ng/μL,顯然,TaKaRa 公司DNA聚合酶的檢出限最低,靈敏度最高,而TIANGEN公司的DNA聚合酶相對于其他兩種品牌聚合酶反應(yīng)效率有一定的波動性。

    分別用BioFlux、TaKaRa、TIANGEN公司DNA聚合酶進行實時熒光PCR反應(yīng),驢陽性質(zhì)粒實時熒光PCR檢測重復(fù)性好,靈敏度的檢出下限分別為10-1、10-2、10-2ng/μL。因此,3個品牌公司的DNA聚合酶靈敏度與反應(yīng)效率均相差不大,TaKaRa、TIANGEN公司的DNA聚合酶比BioFlux公司的DNA聚合酶檢出下限低一個濃度梯度,且在質(zhì)粒模板含量為10-2ng/μL時,TaKaRa公司的DNA聚合酶反應(yīng)效率高于TIANGEN公司的DNA聚合酶反應(yīng)效率。

    分別利用 BioFlux、TaKaRa、TIANGEN 公司 DNA聚合酶進行實時熒光PCR反應(yīng),馬陽性對照質(zhì)粒實時熒光PCR檢測靈敏度的檢出下限分別為1、10-3、10-1ng/μL。可見,TaKaRa公司DNA聚合酶的檢出限最低,靈敏度高于BioFlux與TIANGEN公司的DNA聚合酶,并且,TIANGEN公司的DNA聚合酶靈敏度高于 BioFlux公司的 DNA聚合酶靈敏度,TaKaRa、BioFlux公司的DNA聚合酶重復(fù)性與反應(yīng)效率略優(yōu)于TIANGEN公司的DNA聚合酶。

    3 討論與結(jié)論

    高質(zhì)量的PCR反應(yīng)液是進行基因檢測和研究的前提。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)在食品檢測方面的廣泛應(yīng)用[13],各大實驗室和研究機構(gòu)都積極致力于靈敏度更高、效率更高、更準(zhǔn)確的實時熒光PCR反應(yīng)。本研究構(gòu)建了狐貍、驢、馬源性成分檢測的3種陽性質(zhì)粒分子,對3種質(zhì)粒分子的方法特異性、靈敏度進行了驗證,并對其關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)-PCR反應(yīng)液進行了驗證,對比不同廠家PCR反應(yīng)液實時熒光PCR反應(yīng)效率,驗證快速檢測方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性、與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法一致性等關(guān)鍵指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),3種廠家的實時熒光PCR反應(yīng)液均有較高的重復(fù)性和特異性,對于不同的陽性質(zhì)粒,不同品牌的DNA聚合酶在不同反應(yīng)中表現(xiàn)出不同的優(yōu)勢,總體來說,TaKaRa品牌的反應(yīng)液靈敏度要高于TIANGEN與BioFlux品牌的靈敏度。出現(xiàn)該結(jié)果的原因,除了不同品牌質(zhì)量參差不一,還可能由于以下原因造成:1)3種陽性質(zhì)粒的熒光定量PCR反應(yīng)體系中各組分終濃度不同,比如在以狐貍質(zhì)粒為模板的PCR反應(yīng)中,Taq DNA聚合酶的活力要求為 5 U/μL 取 0.3 μL(即 1.5U),而以驢、馬質(zhì)粒為模板的PCR反應(yīng)中,DNA聚合酶活力要求為2U;2)3種陽性質(zhì)粒的熒光定量PCR反應(yīng)條件不同;3)作為模板,3種陽性質(zhì)粒狐貍、驢、馬本身質(zhì)粒片段大小與長度不同。因此,為避免誤判,在進行分子實驗前需進行預(yù)實驗,優(yōu)化組合,選擇滿足實驗結(jié)果判定要求的DNA反應(yīng)液進行正式實驗。本研究結(jié)果為進行實時熒光定量PCR的反應(yīng)液選擇提供了一定的依據(jù),可促進檢驗基礎(chǔ)薄弱、技術(shù)能力有限的食品檢驗機構(gòu)動物源性成分檢測能力的提升,研究成果的應(yīng)用推廣將對保障我國食品安全監(jiān)督監(jiān)管發(fā)揮重要的作用,對于肉及肉制品中動物源性成分準(zhǔn)確可靠的鑒定具有重要意義和應(yīng)用前景。

    [1]趙琳娜,王丹,胡鳳月,等.食用植物油中動物源性成分PCR檢測方法的建立[J].現(xiàn)代食品科技,2012,28(5):588-591

    [2]Tartaglia M,Saulle E,Pestalozza S,et al.Deatction of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds:a molecular approach to test for the presence of bovine derived materials[J].Journal of Food Protein,1998,61:513-518

    [3]Wang R F,Myers M J,Campbell W,et al.A rapid method for PCR detection of bovine material in animal feedstuffs[J].Molecular and Cellular Probes,2000,14:1-5

    [4]Taverniers l,Van Bockstaele E,De Loose M.Cloned plasmid DNA fragments ascalibrators for controlling GMOs:different real-time duplex quantitative PCR methods[J].Anal Bioanal Chem,2004,378:1198-1207

    [5]李俊,劉信,曹應(yīng)龍,等.植酸酶基因定性PCR檢測方法及陽性質(zhì)粒分子的構(gòu)建[J].作物學(xué)報,2012,38(4):639-647

    [6]胡尚杰,吳剛,武玉花,等.轉(zhuǎn)基因作物篩查用陽性質(zhì)粒分子的構(gòu)建及應(yīng)用研究[J].中國油料作物學(xué)報,2010,32(2):173-179

    [7]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 3730.3-2013食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第3部分:狐貍成分檢測實時熒光PCR法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014:1-5

    [8]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 3730.4-2013食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第4部分:驢成分檢測實時熒光PCR法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014:1-5

    [9]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.SN/T 3730.5-2013食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第5部分:馬成分檢測實時熒光PCR法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014:1-5

    [10]李杰,闞飆,張京云.含擴增內(nèi)對照的霍亂毒素基因ctx和不耐熱腸毒素基因elt三重real-time PCR檢測體系的建立[J].中華流行病學(xué)雜志,2014,35(6):720-723

    [11]高東,孫宏偉,劉雪清,等.水稻MOC1 mRNA TaqMan實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].分子植物育種,2008,6(6):1197-1203

    [12]高東,王云月,何霞紅,等.TaqMan熒光定量檢測水稻RAc1基因mRNA方法的建立[J].云南植物研究,2009,31(1):75-81

    [13]霍勝楠,孟靜,楊振東,等.3種食源性致病菌的實時熒光PCR快速檢測[J].食品研究與開發(fā),2016,37(16):143-147

    猜你喜歡
    狐貍靈敏度質(zhì)粒
    導(dǎo)磁環(huán)對LVDT線性度和靈敏度的影響
    短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
    地下水非穩(wěn)定流的靈敏度分析
    狐貍和貓
    狐貍
    穿甲爆破彈引信對薄弱目標(biāo)的靈敏度分析
    重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
    狐貍便當(dāng)
    Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y的作用
    BAG4過表達重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細胞的鑒定
    18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品久久久精品久久久| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产三级在线视频| 99久久九九国产精品国产免费| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久久久九九精品影院| 乱人视频在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产亚洲精品av在线| 国产片特级美女逼逼视频| 97超视频在线观看视频| 亚洲自拍偷在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美日韩在线观看h| 婷婷色麻豆天堂久久| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 午夜免费观看性视频| 亚洲在线观看片| 99热这里只有是精品50| 高清毛片免费看| 韩国高清视频一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产| 美女cb高潮喷水在线观看| 男女视频在线观看网站免费| 两个人视频免费观看高清| 91久久精品国产一区二区三区| 精品久久国产蜜桃| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 久久久久久久久久黄片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 草草在线视频免费看| 国产真实伦视频高清在线观看| 一区二区三区高清视频在线| www.av在线官网国产| 搞女人的毛片| 麻豆成人av视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品久久久噜噜| 成人综合一区亚洲| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美潮喷喷水| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 免费看av在线观看网站| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产亚洲一区二区精品| 少妇人妻精品综合一区二区| 日本欧美国产在线视频| 一级二级三级毛片免费看| 美女黄网站色视频| 久久久成人免费电影| 哪个播放器可以免费观看大片| 神马国产精品三级电影在线观看| 中文天堂在线官网| ponron亚洲| 中文字幕av成人在线电影| 国产高潮美女av| 高清午夜精品一区二区三区| 女人久久www免费人成看片| 精品酒店卫生间| 国产成人一区二区在线| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 一个人看视频在线观看www免费| 国产亚洲精品av在线| 亚洲性久久影院| 欧美bdsm另类| 日韩精品青青久久久久久| 大陆偷拍与自拍| 最近中文字幕2019免费版| 在线a可以看的网站| 熟女电影av网| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久这里只有精品中国| 日日撸夜夜添| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲av日韩在线播放| 日韩精品青青久久久久久| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久久午夜欧美精品| 国产一区二区三区av在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日韩欧美三级三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲av成人av| 欧美性感艳星| 国产综合精华液| 国产免费视频播放在线视频 | 免费黄网站久久成人精品| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 可以在线观看毛片的网站| 日韩一区二区视频免费看| 伦精品一区二区三区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲经典国产精华液单| 99视频精品全部免费 在线| 欧美精品一区二区大全| 边亲边吃奶的免费视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产精品人妻久久久影院| or卡值多少钱| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产高清国产精品国产三级 | 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲色图av天堂| 欧美xxⅹ黑人| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久精品人妻少妇| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲自偷自拍三级| 欧美性感艳星| 丰满少妇做爰视频| 熟女人妻精品中文字幕| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 深夜a级毛片| 成人国产麻豆网| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产成人精品婷婷| 日本av手机在线免费观看| 男插女下体视频免费在线播放| 51国产日韩欧美| 特大巨黑吊av在线直播| 一级爰片在线观看| 亚洲精品一二三| 欧美激情国产日韩精品一区| 99久久九九国产精品国产免费| 日本-黄色视频高清免费观看| 大陆偷拍与自拍| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美成人精品欧美一级黄| 一区二区三区免费毛片| 日韩电影二区| 精品久久久久久久久久久久久| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 欧美一区二区亚洲| 两个人视频免费观看高清| 精品一区二区三区视频在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 日韩电影二区| 国产精品.久久久| 在线观看av片永久免费下载| 免费高清在线观看视频在线观看| 草草在线视频免费看| xxx大片免费视频| 国产精品三级大全| 成人漫画全彩无遮挡| 精品久久久久久久末码| 99久久精品国产国产毛片| 人妻系列 视频| 亚洲国产精品国产精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品人妻久久久久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 精品熟女少妇av免费看| freevideosex欧美| 美女大奶头视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产av不卡久久| 欧美性感艳星| 精品久久久精品久久久| 久久精品夜色国产| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲在线观看片| 国产成人freesex在线| 亚洲经典国产精华液单| 国内精品美女久久久久久| 亚洲精品亚洲一区二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲国产av新网站| 一级a做视频免费观看| 69av精品久久久久久| 亚洲欧美一区二区三区国产| 最近2019中文字幕mv第一页| 18禁动态无遮挡网站| 成人综合一区亚洲| 日韩国内少妇激情av| 插逼视频在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 高清av免费在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 亚洲四区av| 能在线免费观看的黄片| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久久国产网址| 国产精品综合久久久久久久免费| 七月丁香在线播放| 国产免费视频播放在线视频 | 一区二区三区高清视频在线| 日韩制服骚丝袜av| 一级毛片久久久久久久久女| 美女cb高潮喷水在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲国产高清在线一区二区三| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚州av有码| 久久6这里有精品| 亚洲国产色片| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品国产av蜜桃| 中文字幕av在线有码专区| 夫妻性生交免费视频一级片| ponron亚洲| 热99在线观看视频| av在线天堂中文字幕| 成年人午夜在线观看视频 | 国产伦精品一区二区三区四那| .国产精品久久| 亚洲精品自拍成人| 在线免费观看的www视频| 欧美zozozo另类| 日本黄色片子视频| 国产高清三级在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 免费看a级黄色片| 国产精品一区二区三区四区久久| 综合色丁香网| 久久精品国产亚洲网站| 日本一本二区三区精品| 黄色配什么色好看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 97超视频在线观看视频| 国产免费视频播放在线视频 | 午夜福利高清视频| xxx大片免费视频| 97热精品久久久久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 三级国产精品欧美在线观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 最近手机中文字幕大全| 乱码一卡2卡4卡精品| 99久久精品一区二区三区| 一个人看的www免费观看视频| 免费看a级黄色片| 亚洲av免费在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 婷婷色av中文字幕| 国产在线男女| 欧美精品一区二区大全| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 午夜免费激情av| 精品人妻一区二区三区麻豆| 成人毛片60女人毛片免费| 精品久久久久久久久av| 国产精品一区www在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 国产白丝娇喘喷水9色精品| av免费观看日本| 成人漫画全彩无遮挡| 成年免费大片在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产视频首页在线观看| 丰满少妇做爰视频| 如何舔出高潮| 国产成人午夜福利电影在线观看| 午夜福利高清视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久久久九九精品影院| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 哪个播放器可以免费观看大片| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品一二三区在线看| 欧美潮喷喷水| 91久久精品电影网| 国产亚洲91精品色在线| 在线免费十八禁| 亚洲在线观看片| 日韩欧美 国产精品| 久久久久久国产a免费观看| 在线 av 中文字幕| 秋霞伦理黄片| 国产爱豆传媒在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 精品欧美国产一区二区三| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 看十八女毛片水多多多| 26uuu在线亚洲综合色| 丝袜美腿在线中文| 免费黄网站久久成人精品| 久久午夜福利片| 三级国产精品片| a级一级毛片免费在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 男人爽女人下面视频在线观看| 久久久精品免费免费高清| 国产黄色免费在线视频| 国产视频首页在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 男女边摸边吃奶| 欧美性感艳星| 婷婷色av中文字幕| 色综合色国产| 亚洲自偷自拍三级| 国产成人aa在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品综合久久久久久久免费| 综合色av麻豆| 97精品久久久久久久久久精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产三级在线视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久草成人影院| 网址你懂的国产日韩在线| 国产成人91sexporn| 好男人视频免费观看在线| 国产在视频线在精品| 国产免费福利视频在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 成年人午夜在线观看视频 | 三级国产精品欧美在线观看| 久久久国产一区二区| 水蜜桃什么品种好| 日韩在线高清观看一区二区三区| 久久99蜜桃精品久久| 一个人观看的视频www高清免费观看| 欧美 日韩 精品 国产| 波野结衣二区三区在线| 久久久久久久久久黄片| 五月天丁香电影| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久99精品国语久久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 午夜精品国产一区二区电影 | 乱码一卡2卡4卡精品| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 午夜激情久久久久久久| 久99久视频精品免费| 国产探花极品一区二区| 99久久精品热视频| 成年人午夜在线观看视频 | 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产精品爽爽va在线观看网站| a级毛色黄片| av在线亚洲专区| eeuss影院久久| 成人午夜高清在线视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲国产精品专区欧美| 99久国产av精品国产电影| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久亚洲精品成人影院| 日韩强制内射视频| 成人二区视频| 精品酒店卫生间| 一级片'在线观看视频| 日韩一区二区三区影片| 少妇高潮的动态图| 美女国产视频在线观看| 久久97久久精品| 国产大屁股一区二区在线视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | videossex国产| 午夜视频国产福利| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 男人和女人高潮做爰伦理| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久99蜜桃精品久久| 综合色丁香网| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| av天堂中文字幕网| 97超视频在线观看视频| 韩国av在线不卡| 欧美激情久久久久久爽电影| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 免费黄频网站在线观看国产| 日韩精品青青久久久久久| 一区二区三区四区激情视频| 又爽又黄a免费视频| 国产精品久久久久久久电影| 精品久久国产蜜桃| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产高潮美女av| 亚洲精品久久午夜乱码| av线在线观看网站| 国产永久视频网站| 久久综合国产亚洲精品| 国产精品蜜桃在线观看| 国产精品久久久久久久电影| 国产视频首页在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 女人久久www免费人成看片| 777米奇影视久久| 一级av片app| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲av免费在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 色5月婷婷丁香| 在线免费观看的www视频| 青春草国产在线视频| 国产午夜福利久久久久久| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 又爽又黄a免费视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日本一本二区三区精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲综合精品二区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久这里只有精品中国| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久久久久久成人| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99久久九九国产精品国产免费| 久久久久久国产a免费观看| 直男gayav资源| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲精品国产成人久久av| 欧美极品一区二区三区四区| 夫妻午夜视频| 美女高潮的动态| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品三级大全| 国产久久久一区二区三区| 国产精品综合久久久久久久免费| 91在线精品国自产拍蜜月| 成人一区二区视频在线观看| eeuss影院久久| 免费黄色在线免费观看| www.av在线官网国产| 亚洲自偷自拍三级| 午夜福利成人在线免费观看| 国产乱人视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 特级一级黄色大片| 亚洲av成人av| 久热久热在线精品观看| 亚洲av日韩在线播放| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 白带黄色成豆腐渣| 听说在线观看完整版免费高清| 国产一区有黄有色的免费视频 | 色吧在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲国产高清在线一区二区三| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 在线观看人妻少妇| 中文欧美无线码| 日本一二三区视频观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产精品精品国产色婷婷| 男女那种视频在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 人妻少妇偷人精品九色| 免费大片黄手机在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 老师上课跳d突然被开到最大视频| av在线观看视频网站免费| 国内精品宾馆在线| 国产黄片美女视频| 亚洲av一区综合| 欧美一级a爱片免费观看看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 色网站视频免费| 国产高清有码在线观看视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 欧美丝袜亚洲另类| 老司机影院毛片| 男女国产视频网站| 99热这里只有是精品50| 久久这里只有精品中国| 国产69精品久久久久777片| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 韩国av在线不卡| 国产精品一区二区在线观看99 | 欧美 日韩 精品 国产| 国产亚洲5aaaaa淫片| 一本一本综合久久| 国产黄片美女视频| 免费观看性生交大片5| 日韩成人伦理影院| 色综合站精品国产| 欧美97在线视频| 亚洲伊人久久精品综合| 免费看日本二区| 亚洲欧美精品专区久久| 麻豆成人午夜福利视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 一边亲一边摸免费视频| 99热这里只有是精品50| 黑人高潮一二区| 天堂影院成人在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 免费看日本二区| 国产永久视频网站| 老司机影院成人| 插逼视频在线观看| 一区二区三区免费毛片| 国产成人一区二区在线| 91久久精品国产一区二区三区| 国产色婷婷99| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品蜜桃在线观看| 美女大奶头视频| 干丝袜人妻中文字幕| 神马国产精品三级电影在线观看| 简卡轻食公司| 国产精品久久久久久久电影| 精品久久久精品久久久| 99久久九九国产精品国产免费| 国产高清有码在线观看视频| 91狼人影院| 男女国产视频网站| 午夜免费观看性视频| 五月玫瑰六月丁香| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲av.av天堂| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 高清视频免费观看一区二区 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久精品综合一区二区三区| av专区在线播放| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产男人的电影天堂91| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美精品国产亚洲| 欧美一级a爱片免费观看看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 在线播放无遮挡| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 色哟哟·www| 成人欧美大片| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品人妻久久久久久| 舔av片在线| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 听说在线观看完整版免费高清| 日韩成人伦理影院| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品不卡视频一区二区| or卡值多少钱| 久久亚洲国产成人精品v| 18禁在线播放成人免费| 亚洲在久久综合| 最近中文字幕高清免费大全6| www.av在线官网国产| av卡一久久| 三级经典国产精品| 精品久久久久久久末码| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 黄色一级大片看看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 超碰97精品在线观看| 国产精品无大码| 国产单亲对白刺激| 国产真实伦视频高清在线观看| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产高清国产精品国产三级 | 色播亚洲综合网| .国产精品久久| 一本久久精品| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品一二三区在线看| 久久国产乱子免费精品| 久久久久久久国产电影| 亚洲伊人久久精品综合| 国产日韩欧美在线精品| 日韩大片免费观看网站| 国产日韩欧美在线精品| 久久久国产一区二区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 男女国产视频网站| 麻豆成人av视频| 两个人视频免费观看高清| 网址你懂的国产日韩在线| 性色avwww在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产视频内射| 少妇丰满av| 中文在线观看免费www的网站| 国产一区亚洲一区在线观看| 成人欧美大片| 久久综合国产亚洲精品| 麻豆成人av视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 97超碰精品成人国产| 国产成人免费观看mmmm| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 在线免费观看的www视频|