NMDA受體磷酸化調(diào)控及其與神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系的研究進(jìn)展

劉佩強(qiáng)，覃丹雪，陳慧英，黃喜，葉文華，蘇紀(jì)平

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體是一種離子型谷氨酸受體，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性神經(jīng)傳遞中發(fā)揮重要作用。NMDA受體的磷酸化調(diào)控是突觸定位和功能調(diào)節(jié)的重要分子機(jī)制，其調(diào)節(jié)失調(diào)與缺血缺氧損傷、疼痛傳導(dǎo)及老年性癡呆等神經(jīng)退行性疾病等都有密切關(guān)系。本文總結(jié)了NMDA受體磷酸化研究的最新進(jìn)展，并綜述NMDA受體磷酸化與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系。

1 NMDA受體及磷酸化調(diào)控

突觸傳遞是神經(jīng)系統(tǒng)處理和儲存信息能力的核心，哺乳動(dòng)物大腦中的興奮性突觸傳遞主要由谷氨酸調(diào)節(jié)，而NMDA受體是主要的谷氨酸受體，其介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流是突觸可塑性的觸發(fā)器，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)長時(shí)程增強(qiáng)和神經(jīng)細(xì)胞變性。NMDA受體是由7種不同的亞單位NR1、NR2A～D和NR3A～B形成的四聚體，大多數(shù)NMDA受體由2個(gè)NR1和2個(gè)NR2亞單位裝配而成，裝配完成后的NMDA受體能選擇性定位于興奮性突觸的突觸后膜，調(diào)節(jié)突觸的形成、修飾和刪除等各種不同的功能。NMDA受體包含胞外配體結(jié)合域，胞外N端結(jié)構(gòu)域，由3個(gè)氨基酸疏水性螺旋M1、M3、M4組成跨膜區(qū)域，胞內(nèi)凹陷回路，胞內(nèi)C末端[1]。

NMDA受體亞單位的C末端可調(diào)控受體裝配運(yùn)輸和表面表達(dá)，基因敲除NR2A中CTDs表達(dá)的小鼠可以存活到成年期，但它們具有突觸可塑性缺陷，而那些敲除NR2B中CTDs的小鼠則會死亡。受體調(diào)控失調(diào)可能是由于失去了磷酸化位點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用缺陷，或結(jié)構(gòu)需求的變化導(dǎo)致的[2]。另有研究提示，NR1和NR2亞單位可以通過細(xì)胞內(nèi)C末端磷酸化作用調(diào)控NMDA受體的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、受體成簇以及突觸定位，調(diào)節(jié)受體與多種胞內(nèi)蛋白的相互作用[3]，進(jìn)一步提示C末端是激酶/磷酸酶系統(tǒng)進(jìn)行修飾特定的分子靶點(diǎn)。研究表明，NMDA受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)依賴于該受體磷酸化狀態(tài)和選擇性剪接，以及異聚體通道的裝配。通過各種蛋白激酶和蛋白磷酸酶活性的精細(xì)調(diào)節(jié)而改變NMDA受體磷酸化狀態(tài)與水平，從而調(diào)控受體的生化特性，包括生物合成、信號傳遞和亞基組裝、亞細(xì)胞分布，以及受體與各種突觸蛋白的相互作用，最終影響興奮性突觸的效能和強(qiáng)度，改變突觸可塑性，調(diào)節(jié)突觸的通道功能和受體定位，迅速和可逆地改變細(xì)胞內(nèi)蛋白的功能，對刺激信號的反應(yīng)高度精確[4]。

目前發(fā)現(xiàn)與NMDA受體相關(guān)的蛋白激酶主要分為兩大類：一類是絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括cAMP依賴性蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、鈣調(diào)蛋白激酶(CaMKⅡ)、酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(Cdk5)、蛋白激酶B(PKB/Akt)；一類是酪氨酸激酶(ErbB)，包括Src、Fyn。

1.1 絲氨酸/蘇氨酸磷酸化 在NMDA受體亞單位中的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)是眾多激酶的調(diào)節(jié)載體，這些蛋白激酶位點(diǎn)目前在NR1、NR2上被發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，特定亞單位位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)可調(diào)節(jié)通道活動(dòng)，NR1的C末端也可以細(xì)胞特異性和活動(dòng)依賴性的調(diào)節(jié)NR1/NR3A電流的水平和藥物敏感性。利用特定的NR1磷酸化位點(diǎn)抗體發(fā)現(xiàn)，PKC、PKA都可使NR1的C末端磷酸化，NR1亞單位S890、S896位點(diǎn)被PKC磷酸化，S897位點(diǎn)則是被PKA磷酸化，而且PKC和PKA在大腦中有不同調(diào)節(jié)作用[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)，NR1在小腦顆粒細(xì)胞中被兩種不同的PKC亞型磷酸化，S890優(yōu)先被PKCγ磷酸化，而S896則是被PKCα磷酸化。因此S890和S896磷酸化有著不同的調(diào)控，并在時(shí)空分布和特定PKC亞型激活依賴性的受體調(diào)控中起著獨(dú)特的作用[6]。

NR2A有兩個(gè)PKA磷酸化位點(diǎn)S900和S929，替換NR2A的S900、S929位點(diǎn)基因后測量受體單通道功能，出現(xiàn)明顯抗磷酸化表現(xiàn)，這兩個(gè)位點(diǎn)的去磷酸化可能會導(dǎo)致受體更快地失去活性、更頻繁地脫敏[7]。NR2A上存在3個(gè)PKC位點(diǎn)，S1291和S1312位點(diǎn)磷酸化可增強(qiáng)NR2A受體電流；S1416磷酸化可降低CaMKⅡ與NR2A結(jié)合的親和力，使CaMKⅡ與PKC兩種信號通路交叉對話[8]。另外，研究發(fā)現(xiàn)Cdk5可誘導(dǎo)NR2A的S1232磷酸化；抑制Cdk5活性可以防止在小鼠的CA1錐體細(xì)胞中誘導(dǎo)LTP[9]。

NR2B有兩個(gè)PKC磷酸化位點(diǎn)，NR2B的S1303、S1323位點(diǎn)被PKC磷酸化，從而導(dǎo)致體外轉(zhuǎn)染表達(dá)形成的功能性NMDA受體的電流變大[10]。其中，S1303也是CaMKⅡ和凋亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)磷酸化的位點(diǎn)。S1303為這些激酶調(diào)節(jié)NR2B的共同靶點(diǎn)，CK2介導(dǎo)S1480位點(diǎn)的磷酸化，導(dǎo)致NR2B和突觸后密度蛋白95(PSD-95)的相互作用減弱，引起NR2B內(nèi)化，調(diào)節(jié)興奮性突觸功能和可塑性。CaMKⅡ可耦合NR2B與CK2形成三分子復(fù)合體，通過CaMKⅡ增強(qiáng)CK2介導(dǎo)的NR2B的S1480磷酸化[11]。最近研究發(fā)現(xiàn)，NR2B的S1116位點(diǎn)被Cdk5磷酸化，而干擾Cdk5和NR2B相互作用的多肽能減少S1116位點(diǎn)的磷酸化，造成NR2B表面表達(dá)增多[12]。NR2B中S1166位點(diǎn)亦被發(fā)現(xiàn)是PKA磷酸化的新靶點(diǎn)，該位點(diǎn)去磷酸化會阻斷PKA依賴的NMDA受體介導(dǎo)的Ca2+滲透、突觸電流、Ca2+在樹突棘上的增加[13]。

1.2 酪氨酸磷酸化 蛋白酪氨酸磷酸化調(diào)控是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一類快速且重要的功能性調(diào)控方式。大量證據(jù)表明，NMDA受體的NR2亞單位酪氨酸磷酸化主要是由Src家族激酶介導(dǎo)的[14～17]?；蚨c(diǎn)誘變發(fā)現(xiàn)，HEK細(xì)胞Src/Fyn所致的酪氨酸磷酸化中，NR2A的Y1292、Y1325和Y1387是重要的磷酸化位點(diǎn)，可增強(qiáng)NMDA受體電流。另外，NR2A的Y842去磷酸化可能調(diào)節(jié)內(nèi)化網(wǎng)格蛋白AP-2和NMDA受體的相互作用，參與形成內(nèi)吞性內(nèi)涵蛋白包被小泡[14]。

NR2B包含四個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，即Y1070、Y1252、Y1336、Y1472。其中Y1472位點(diǎn)磷酸化的主要細(xì)胞生物學(xué)功能已被研究得比較透徹，Src或Fyn使該位點(diǎn)磷酸化從而阻斷NR2B與內(nèi)化網(wǎng)格蛋白AP-2 的結(jié)合，導(dǎo)致因NR2B的內(nèi)化減少所致的細(xì)胞膜表面表達(dá)增多[15]。Fyn可磷酸化Y1336位點(diǎn)，抑制該位點(diǎn)的磷酸化則可減弱鈣剪切酶對NR2B胞內(nèi)C末端的剪切，提示了Y1336磷酸化介導(dǎo)的谷氨酸興奮性毒性中的功能[16]。另外，F(xiàn)yn過度表達(dá)增強(qiáng)了突觸膜上NR2B的Y1472和Y1252磷酸化，可通過維持NMDA受體的突觸表達(dá)和增加NMDA受體對谷氨酸的反應(yīng)來促進(jìn)興奮性細(xì)胞死亡[17]。近期發(fā)現(xiàn)，Y1070位點(diǎn)被Src家族激酶磷酸化，將Y1070位點(diǎn)由酪氨酸(Y)突變?yōu)楸奖彼?F)后，全細(xì)胞記錄電流和生物素化及表面染色的方法，都表明NR2B的表面表達(dá)減少[18]。

2 NMDA受體磷酸化調(diào)控與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)系

2.1 精神分裂癥 精神分裂癥是一種衰弱性精神疾病，NMDA受體功能失調(diào)是精神分裂癥的關(guān)鍵致病機(jī)制。NMDA受體拮抗劑可誘發(fā)精神分裂癥的認(rèn)知障礙和消極癥狀，利用其誘導(dǎo)的精神分裂癥動(dòng)物模型被認(rèn)為是目前最理想的精神分裂癥模型。研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者NR1亞單位的表達(dá)失調(diào)，其中NR1亞單位S897的磷酸化作用顯著降低，小鼠體內(nèi)NR1的S897被丙氨酸(A)取代后，這種突變在NMDA受體突觸結(jié)合和其介導(dǎo)的突觸傳遞中導(dǎo)致嚴(yán)重的損害，從而產(chǎn)生精神疾病相關(guān)的社交互動(dòng)和感覺運(yùn)動(dòng)控制方面的行為缺陷[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG1)、ErbB是精神分裂癥的易感因子，NRG1-ErbB4信號通常激活Fyn并促進(jìn)NR2B Y1472的磷酸化，從而增強(qiáng)NMDA受體的功能。在損傷新生大鼠海馬造成精神分裂癥樣行為缺失的實(shí)驗(yàn)中，NRG1和ErbB激酶抑制劑可抑制神經(jīng)元中NRG1誘導(dǎo)的NR2B的磷酸化，改善精神分裂癥的行為缺失。NRG1-ErbB4信號系統(tǒng)既能抑制NMDA受體功能導(dǎo)致谷氨酸功能低下，又可影響神經(jīng)通路傳遞和突觸可塑性，干擾神經(jīng)元遷移、影響軸突髓鞘化等環(huán)節(jié)，參與了精神分裂癥的發(fā)病過程[20]。最近研究發(fā)現(xiàn)，孕酮硫酸鹽是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的內(nèi)源性神經(jīng)甾類，是一種積極的NMDA受體變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，可提高小鼠紋狀體PKB和糖原合成激酶3β(GSK3β)水平，長期使用可提高海馬體NR1亞單位的磷酸化水平，從而通過NMDA受體介導(dǎo)的Akt-GSK3β信號傳導(dǎo)途徑來改善大鼠的躁動(dòng)、認(rèn)知障礙等表現(xiàn)[21]。TrkB激動(dòng)劑7,8-DHF能顯著提高TrkB激活的Y515和Y816位點(diǎn)磷酸化，增加TrkB下游信號級聯(lián)的磷酸化水平，包括ERK1/2、CaMKⅡ、NMDA受體和AMPA受體，促進(jìn)海馬突觸可塑性，進(jìn)而恢復(fù)工作學(xué)習(xí)能力，逆轉(zhuǎn)精神分裂癥的認(rèn)知缺陷[22]。另有研究發(fā)現(xiàn)，5-HT2A受體拮抗劑ITI-007能顯著增加小鼠伏隔核中NR2B的磷酸化作用，這一效應(yīng)能夠促進(jìn)NMDA受體神經(jīng)信號傳遞，其原因可能是繼發(fā)于激活多巴胺受體D1。

2.2 阿爾茨海默病(AD) AD是一種與記憶障礙有關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其特點(diǎn)包括tau蛋白過度磷酸化、β-淀粉樣蛋白(Aβ)積累和淀粉樣斑塊的形成，這些都與突觸喪失和認(rèn)知下降相關(guān)?？扇苄訟β低聚物是樹突狀細(xì)胞病理主要神經(jīng)毒性物質(zhì)，可與細(xì)胞表面朊蛋白結(jié)合，導(dǎo)致突觸中異常的NMDA受體激活。朊蛋白在突觸后密集區(qū)與Fyn相互作用，并與Aβ形成復(fù)合物，激活的Fyn引起NR2B亞單位的酪氨酸磷酸化。興奮性毒性可以導(dǎo)致樹突棘突處突觸可塑性損害和結(jié)構(gòu)功能喪失，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性壞死。Fyn也可導(dǎo)致tau蛋白過度磷酸化，因而Fyn是AD病理治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。Fyn激酶阻斷劑馬賽替尼和塞卡替尼已被證明用于治療AD模型小鼠有效，目前處于臨床試驗(yàn)中。

2.3 創(chuàng)傷性腦損傷(TBI) TBI的存活者常伴有抑郁、認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)障礙，其病因多半是大腦重塑的谷氨酸能神經(jīng)傳遞異常紊亂導(dǎo)致細(xì)胞去極化，引起Na+、Cl-、H2O向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)，導(dǎo)致急性滲透性細(xì)胞腫脹，腦水腫形成，興奮毒性病因排除后可部分恢復(fù)正常。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，阻斷NMDA受體介導(dǎo)的谷氨酸毒性作用可以減輕TBI所致的神經(jīng)功能缺損。其機(jī)制之一可能是通過抑制SFKs使NR2B的Y1472去磷酸化，增加NMDA受體的內(nèi)化作用[23]。TBI導(dǎo)致Src抑制性位點(diǎn)Y527的磷酸化明顯下調(diào)，而它的活化位點(diǎn)Y416也相應(yīng)降低，表明在TBI發(fā)病后SFKs被顯著抑制。Src激酶的磷酸化位點(diǎn)的減少導(dǎo)致突觸表面NR2表達(dá)部分失衡，NMDA受體的內(nèi)化增多和進(jìn)一步降解。研究發(fā)現(xiàn)，ErbB抑制劑PP2可抑制NR2B磷酸化，并使NR2B亞單位表達(dá)恢復(fù)到正常水平，因此其可能作為TBI神經(jīng)外科手術(shù)的術(shù)前治療[24]。

2.4 神經(jīng)病理性疼痛 神經(jīng)病理性疼痛的生理和病理過程包括神經(jīng)系統(tǒng)敏感化、內(nèi)臟疼痛、細(xì)胞凋亡及壞死等，與NMDA受體密切相關(guān)，其表達(dá)亢進(jìn)能導(dǎo)致脊髓背角神經(jīng)元痛覺異常敏感性，并使傷害性感覺神經(jīng)元發(fā)生鈣超載；同時(shí)可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣敏感性的信號級聯(lián)反應(yīng)，使NMDA受體亞基的不同磷酸化位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，促使線粒體功能紊亂，其釋放的凋亡因子可使神經(jīng)元變性和死亡。神經(jīng)病理性疼痛潛在的機(jī)制涉及PKA、Fyn。在疼痛大鼠模型的脊髓背角神經(jīng)元內(nèi)，PKA可使NR1磷酸化增多，抑制NR1的磷酸化被證明可用于治療神經(jīng)病理性疼痛。利用注射弗氏佐劑制作的大鼠疼痛模型發(fā)現(xiàn)，NR2A和NR2D先天缺陷大鼠的突觸后脊髓背角神經(jīng)元上NR2B亞單位Y1472酪氨酸磷酸化增加[25]。研究發(fā)現(xiàn)，Src相關(guān)基因敲除的小鼠表現(xiàn)出中樞反應(yīng)性和機(jī)械性神經(jīng)痛的敏感行為減弱，因此Src功能被認(rèn)為是痛覺超敏反應(yīng)的關(guān)鍵。Src抑制劑與沙阿替尼聯(lián)用能阻斷Src與NMDA受體的結(jié)合，阻斷了NMDA受體的磷酸化，從而降低疼痛的敏感性[26]。除SFKs外，NMDA受體磷酸化水平也由蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPs)決定。PTPs抑制劑能顯著抑制Src活性，減少Src介導(dǎo)的NR2B磷酸化，減少NR2B的突觸累積，最終改善病理性疼痛[27]。阿片類藥物減輕炎癥性疼痛的能力受NMDA受體的負(fù)調(diào)控，嗎啡可增強(qiáng)PKC介導(dǎo)的NR1的C1段的磷酸化，并增強(qiáng)CaMKⅡ的作用，這種途徑與嗎啡的耐受性有關(guān)。PKC的抑制劑可恢復(fù)阿片受體與NR1的聯(lián)系，增強(qiáng)嗎啡的止痛效果。腎上腺素能α2受體激動(dòng)劑右旋美托咪啶可調(diào)節(jié)脊髓背側(cè)角神經(jīng)元上NMDA受體的表達(dá)、膜受體轉(zhuǎn)運(yùn)和功能，以及PKC和CaMKⅡ水平，從而有效改善痛覺過敏[28]。

3 展望

迄今為止，NMDA受體上已被鑒定出具有功能意義的有14個(gè)絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、9個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，更明確了這些磷酸化位點(diǎn)及其激酶對NMDA受體的功能調(diào)控。既然這么多磷酸化位點(diǎn)及其激酶都參與了對NMDA受體功能的調(diào)控，那么在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展中，各磷酸化位點(diǎn)的變化情況、各蛋白激酶相互調(diào)控的功能等問題值得我們進(jìn)一步探討，同時(shí)未來可能將各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)理或進(jìn)展與NMDA受體磷酸化研究結(jié)合，以期進(jìn)一步揭示深層發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。