結(jié)直腸腺癌組織中長鏈非編碼RNA linc00511表達(dá)變化及意義

劉鑫，武雪亮，薛軍

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口075000)

全球每年結(jié)腸直腸癌死亡患者超過50萬人[1]，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其主要死因。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，不具有蛋白質(zhì)編碼潛力。最近研究表明，lncRNA在不同的生物過程中起關(guān)鍵作用，包括選擇性剪接、基因印跡、核內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞分化和RNA衰變等[2,3]。有研究表明，lncRNA SOX21-AS1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并且是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的原因之一，并通過募集和結(jié)合miR-145-MYO6促進(jìn)腫瘤生長[4]；lncRNA ZFAS1通過結(jié)合miR-484促進(jìn)結(jié)直腸癌的腫瘤生長和浸潤轉(zhuǎn)移[5]；另一個(gè)重要的lncRNA HOTAIR可以調(diào)控多梳蛋白依賴性染色質(zhì)修飾，并且與結(jié)直腸癌預(yù)后不良有關(guān)[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，linc00511在小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，并且通過結(jié)合EZH2抑制p57進(jìn)而促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的侵襲遷移[7]。然而，linc00511在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平及其功能尚未研究。因此，本研采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)linc00511在結(jié)直腸腺癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，為結(jié)直腸腺癌的早期診斷及靶基因治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院2011年1月～2012年1月確診的50例結(jié)直腸腺癌患者的癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。患者中男27例，女23例；年齡30～83歲，其中≤55歲19例、>55歲31例；腫瘤直徑<5 cm 27例，≥5 cm 23例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期24例，Ⅲ、Ⅳ期26例；組織分化程度高分化21例、中低分化29例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移12例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移38例。術(shù)后隨訪至2017年2月20日，死亡28例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者術(shù)前均未接受除手術(shù)外的其他治療，均簽署知情同意書。

1.2 結(jié)直腸腺癌及癌旁組織中l(wèi)inc00511檢測(cè)方法 采用實(shí)時(shí)定量PCR法。提取組織中的總RNA，加入500 μL TRIzol試劑裂解，收集到1.5 mL無酶EP管。加入100 μL氯仿，室溫靜置3 min，12 000 r/min離心15 min；將200 μL上層液體移入新的1.5 mL EP管中，加入250 μL異丙醇，混勻，靜置10 min；12 000 r/min離心10 min，棄上清液，以 75%乙醇溶液(含DEPC)洗滌沉淀3次(7 500 r/min離心5 min)；待RNA沉淀基本透明時(shí)，加入ddH2O至充分溶解，測(cè)定RNA的質(zhì)量及濃度。按照Takara RR036A試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以使用CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定linc00511。linc00511上游引物5′-TCTCCTTGTGCAAACCTCC-3′，下游引物5′-CCCACATTGAGCGAATGCC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GAAGATGGTGATGGGATT-TC-3′，下游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′。反應(yīng)體系(10 μL)：2×iTaqTMUniversal SYBR?Green Supermix 5 μL，上、下游引物(0.4 μmol/L)各0.4 μL，cDNA 0.8 μL，RNase Free H2O 3.8 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，30 s；變性95 ℃，5 s，退火/延伸60 ℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)，65～95 ℃熔解曲線分析。每次3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。目的基因的表達(dá)應(yīng)用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量，中位數(shù)以上為高表達(dá)，中位數(shù)以下為低表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸腺癌及癌旁組織中l(wèi)inc00511表達(dá)比較 結(jié)直腸腺癌組織中l(wèi)inc00511表達(dá)量為3.20±1.29，高于癌旁組織中的1.21±0.92(P<0.01)。

2.2 linc00511表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸腺癌組織中l(wèi)inc00511高表達(dá)者高于無淋巴轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者(P均<0.05)，而不同性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度、TNM分期間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 linc00511表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 linc00511表達(dá)與結(jié)直腸腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 linc00511高表達(dá)和低表達(dá)者的5年生存率分別為40%(10/25)、72%(18/25)，linc00511高表達(dá)者5年生存率低于低表達(dá)者(P<0.05)。

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見的消化道腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[8～10]。約20%的結(jié)直腸癌患者在診斷時(shí)已經(jīng)轉(zhuǎn)移[11]，在晚期結(jié)直腸癌患者中更常見，通常傳播到肝臟和肺。事實(shí)上，轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[12,13]。研究結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，可為臨床尋找更好的結(jié)直腸癌治療新靶點(diǎn)。

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多影響因素的復(fù)雜過程。很多學(xué)者對(duì)其發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了研究,近來lncRNA吸引了世界范圍內(nèi)研究人員的巨大興趣。許多l(xiāng)ncRNA在人類腫瘤發(fā)生中異常表達(dá)并充當(dāng)調(diào)節(jié)劑，已報(bào)道多種lncRNA在結(jié)直腸癌發(fā)生中起重要作用。例如：H19通過結(jié)合eIF4A3促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展[14]；RP4通過發(fā)揮海綿作用吸附miR-7-5p促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展[15]；GAPLINC通過miR-34a/c-MET信號(hào)通路調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[16]。

近期研究發(fā)現(xiàn)，linc00511可通過結(jié)合EZH2抑制p57，進(jìn)而促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的侵襲遷移[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸腺癌組織中l(wèi)inc00511表達(dá)量高于正常結(jié)直腸組織，與Sun等[7]研究結(jié)果相似，提示linc00511在結(jié)直腸癌中可能充當(dāng)一個(gè)促癌基因的作用。本研究將linc00511在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的表達(dá)水平從低到高排序，中位數(shù)以上為高表達(dá)、以下為低表達(dá)，分析linc00511與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者linc00511高表達(dá)比例高于無轉(zhuǎn)移者，而不同性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度和TNM分期間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示linc00511可能是促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因之一，有望成為預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者是否有轉(zhuǎn)移的因子之一。本研究還發(fā)現(xiàn)，linc00511高表達(dá)者的5年生存率低于低表達(dá)者。這提示linc00511的高表達(dá)是結(jié)腸癌患者的預(yù)后危險(xiǎn)因素，可作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的指標(biāo)之一，是潛在的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示linc00511在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，尤其在判斷結(jié)直腸癌患者轉(zhuǎn)移和預(yù)后中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為我們?cè)诮Y(jié)直腸癌患者的治療提供了新的思路，為結(jié)直腸癌的靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。