蒲黃炒阿膠的質(zhì)量標準研究

周 堅，張華鋒，王亞瓊，陳 榮，魯 輝

(蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215104)

阿膠珠為馬科動物驢EquusasinusL.的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠(阿膠)的炮制品[1]。在古代有豬脂浸炙、炒制、熬制、蛤粉炒制和蒸制等法，現(xiàn)代炮制有生制、蛤粉炒制和蒲黃炒制等法。古代阿膠所采用的各類炮制方法，具有矯臭矯味、使其質(zhì)地酥脆而便于粉碎和降低其膩滯性的作用[2-8]。蒲黃生用性涼，行血而兼消，炒后味澀，調(diào)血補血且止血，蒲黃炒阿膠會增強其補血止血作用[9-14]。江浙地區(qū)盛產(chǎn)蒲黃，蒲黃炒阿膠自古盛行，但缺乏相應標準對蒲黃炒阿膠的質(zhì)量進行控制，阿膠經(jīng)蒲黃炒制后產(chǎn)生哪些變化也沒有相關資料參考，本實驗以《中國藥典》2015年版阿膠[15]項下的檢驗項目為參考，考察阿膠經(jīng)蒲黃炒制后的變化。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配VWD檢測器，ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(安捷倫科技有限公司)；UPLC-Xevo TQ-S質(zhì)譜儀，配Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)(沃特世科技有限公司)；Xseries 2 ICP-MS，Sorvall ST 8 臺式離心機(賽默飛世爾科技公司)；AG245電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；BX43顯微鏡(奧林巴斯有限公司)。

1.2試藥 異硫氰酸苯酯(PITC)、三乙胺、甲酸和乙腈(Sigma-Aldrich公司)；碳酸氫銨、醋酸鈉、醋酸、鹽酸、水合氯醛和氫氧化鈉均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；胰蛋白酶(批號140615-200206，中國食品藥品檢定研究院)；超純水(Millpore公司)。

所用對照品均來自中國食品藥品檢定研究院，L-羥脯氨酸(批號111578-201602)，甘氨酸(批號140689-201605)，丙氨酸(批號140680-201604)，L-脯氨酸(批號140677-201507)，阿膠(批號121274-201202)。蒲黃炒阿膠的樣品自行炮制3批，樣品信息見表1。

表1樣品信息

Tab.1 Sample information

蒲黃炒阿膠編號阿膠編號廠家批號QS0248SZ2016QS0248山東陽谷古阿井阿膠廠2015122401QS0801SZ2016QS0801河南省四方藥業(yè)集團有限公司160309QS0825SZ2016QS0825山東濟水阿膠有限公司20160123

2 結(jié)果

2.1炮制與性狀 自行炮制3批，炮制過程中，蒲黃易生火、起煙，溫度較難控制。建議先將阿膠塊放入40 ℃烘箱中加熱軟化，切制成小方塊狀，再熱鍋把蒲黃迅速炒制至黃褐色后，將阿膠塊放入翻炒，鼓起后迅速撈出，關火降溫。阿膠珠樣品呈圓球狀，表面呈深土黃色，質(zhì)脆泡酥，中空，略呈海綿狀，不黏連，無枯焦。

2.2顯微鑒別 粉末呈褐色。可見蒲黃花粉粒，花粉粒類圓形或橢圓形，直徑18～25 μm，表面有網(wǎng)狀雕紋，周邊輪廓線光滑，呈凸波狀或齒輪狀，具單孔，不甚明顯。阿膠部分為大量圓形油滴，可見孔洞樣透明塊狀物。

2.3質(zhì)譜鑒別 隨著科技的發(fā)展和質(zhì)譜的普及，越來越多的中藥材開始采用質(zhì)譜法進行質(zhì)量控制和研究[16-19]。本項目按照《中國藥典》2015年版阿膠項下測定，取蒲黃炒阿膠粉末0.1 g，加入質(zhì)量濃度為10 g·L-1的碳酸氫銨溶液50 mL，超聲處理30 min，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液100 μL，置于微量進樣瓶中，加胰蛋白酶溶液10 μL(取序列分析用胰蛋白酶，加入質(zhì)量濃度為10 g·L-1的碳酸氫銨溶液配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的胰蛋白酶溶液，臨用時配制)，搖勻，37 ℃恒溫酶解12 h，作為供試品溶液。另取阿膠對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。采用質(zhì)譜檢測器，電噴霧正離子模式(ESI+)，進行多反應監(jiān)測(MRM)，選擇質(zhì)荷比(m/z)539.8 (雙電荷)→ 612.4和m/z539.8(雙電荷)→ 923.8作為檢測離子對。吸取供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，測定。3批樣品均呈現(xiàn)與對照藥材色譜保留時間一致的色譜峰，見圖1。

2.4水分 按照《中國藥典》2015年版阿膠項下規(guī)定水分不得過15.0%，本實驗3批樣品測定結(jié)果分別為5.2%，5.5%和5.7%，蒲黃炒制導致水分含量降低，建議以均值120%為限，規(guī)定水分不得過6.5%。

2.5重金屬及有害元素 《中國藥典》2015年版阿膠項下規(guī)定，鉛、鎘、砷、汞和銅分別不得超過5，0.3，2，0.2和20 mg·kg-1。3批樣品中重金屬及有害元素測定結(jié)果見表2，建議蒲黃炒阿膠的重金屬及有害元素限量同《中國藥典》2015年版阿膠項下規(guī)定。

表2蒲黃炒阿膠中鉛、鎘、砷、汞及銅的含量

Tab.2 The contents of Cu，As，Cd，Hg and Pb in donkey-hide gelatine fied by cattail pollen (mg·kg-1)

圖1樣品MRM圖譜

A.m/z539.8→ 612.4離子對；B.m/z539.8→ 923.8離子對；1.離子對峰。

Fig.1 MRM chromatography of the sample

A.m/z539.8→ 612.4 ion pair；B.m/z539.8→ 923.8 ion pair；1.ion peak.

2.6水不溶物 《中國藥典》2015年版阿膠項下規(guī)定水不溶物含量不得過2.0%。本實驗3批樣品測定結(jié)果分別為4.7%，2.2%及1.1%。鑒于蒲黃的附著，可能導致水不溶物增加，因此建議刪除此項。

2.7氨基酸含量測定

2.7.1標準曲線及線性考察 將混合對照品溶液稀釋為5個質(zhì)量濃度，分別進樣10 μL，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)，分別繪制標準曲線，并計算回歸方程，得L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的回歸方程分別為y=7 895x+25.36(r=0.999 9)，y=9 632x+15.74(r=0.999 9)，y=6 875x+58.34(r=0.999 9)和y=7 324x+42.35(r=0.999 9)，線性范圍分別為0.034～0.510，0.015～0.225，0.028～0.421和0.023～0.345 mg·mL-1。結(jié)果表明，線性關系良好。

2.7.2精密度實驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6 次，按照峰面積計算L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的RSD值分別為0.18%，0.08%，0.15%和0.1%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.7.3穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于2，4，8，12，16和24 h 注入液相色譜儀，結(jié)果顯示，供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，6 次測定L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的RSD值分別為0.35%，0.21%，0.23%和0.24%。結(jié)果表明，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.4重復性實驗 取同一批(批號QS0248)樣品，制備6份樣品溶液進樣測定，得L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的RSD值分別為2.78%，1.48%，1.39%和1.54%。結(jié)果表明，該方法重復性良好。

2.7.5加樣回收率實驗 精密稱取同一批(批號QS0248)樣品5份，每份分別精密加入等質(zhì)量的混合對照品溶液，同《中國藥典》2015年版阿膠[15]項下樣品制備方法制備后進樣，以外標法計算平均回收率和RSD值。結(jié)果見表3。

表34種氨基酸含量測定的回收率結(jié)果

Tab.3 The results of recovery test of the quantitative analysis of 4 amino acids

成分平均含量/%加入量/%平均測得量/%平均回收率/%L-羥脯氨酸8.410.0018.095.9甘氨酸18.020.0037.798.5丙氨酸7.110.0016.796.3L-脯氨酸10.210.0020.097.6

2.7.6含量測定 按照《中國藥典》2015年版阿膠項下干燥品的規(guī)定計算，含L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸分別不得少于8.0%，18.0%，7.0%和10.2%，3批樣品測定結(jié)果見表4。阿膠經(jīng)蒲黃炒制后樣品色譜圖與原阿膠樣品色譜圖無異且含量差別變化不大，見圖2。因此，建議同《中國藥典》2015年版阿膠項下規(guī)定。

圖2HPLC圖

A.混合對照品溶液；b.阿膠樣品溶液；c.蒲黃炒阿膠樣品溶液；1.L-羥脯氨酸；2.甘氨酸；3.丙氨酸；4.L-脯氨酸。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mixed reference solution；b.sample of donkey-hide gelatine；c.sample of donkey-hide gelatine fied by cattail pollen；1.L-hydroxyproline；2.glycine；3.alanine；4.L-proline.

表4蒲黃炒阿膠后4種氨基酸的含量變化

Tab.4 The changes of the contents of 4 amino acids in donkey-hide gelatine fied by cattail pollen

編號L-羥脯氨酸/%炒制后炒制前甘氨酸/%炒制后炒制前丙氨酸/%炒制后炒制前L-脯氨酸/%炒制后炒制前QS02488.48.818.018.77.07.610.210.8QS080110.29.921.221.78.18.912.012.4QS08258.89.219.220.77.58.010.911.5

3 討論

近年來，由于冬季膏方的盛行，越來越多的阿膠被直接投入于膏方中熬制，很少再用炮制品，但自古阿膠的炮制具有增效降膩的作用，炮制作為一門古老的技藝也逐漸被快節(jié)奏、簡易的用藥方法取代，但中藥的服用終歸還需依照中醫(yī)用藥的老傳統(tǒng)，才能夠更好地發(fā)揮藥效，為病體康健提供保障。

為了杜絕近年來在阿膠中添加豬皮、牛皮等弄虛作假行為，阿膠的法定藥典標準已越來越全面，然而各種炮制品卻沒有得到同等的重視，蒲黃炒阿膠作為江浙地區(qū)盛行的炮制方法，阿膠珠也作為地方特色在市井的藥房中存在，對蒲黃炒阿膠的質(zhì)量進行控制，填補阿膠炮制品質(zhì)量控制的空白，對地方特色品種進行保護和傳承。

阿膠經(jīng)蒲黃炒制后，性狀發(fā)生了很大變化，由堅韌黏膩變得酥脆易碎，便于藥用。顯微鑒別中增加了蒲黃花粉粒的特征，雖然炒制后，僅阿膠珠表層黏附一層薄薄的蒲黃花粉粒，但對于用藥而言，增加了一味能夠止血、化瘀、通淋的中藥。由于蒲黃花粉粒的附著，導致阿膠珠的水不溶物含量增加，實驗中將蒲黃花粉粒洗去后，再次測定，基本無水不溶物，可見炒制更有利于增加阿膠的水溶性。同時，高溫炒制并不影響質(zhì)譜中特征離子和4種氨基酸成分的分析，且蒲黃炒制后樣品色譜圖與原阿膠樣品色譜圖基本一致，4種氨基酸的含量并無顯著差別，由此可見，控制阿膠及阿膠珠的質(zhì)量，僅通過氨基酸的分析還不夠，應尋找具有藥效價值的蛋白、多肽或其他類成分等進行質(zhì)量控制。隨著科技的進一步發(fā)展，還需要更多的成分分析參與來尋找炮制后的特征產(chǎn)物。本實驗為蒲黃炒阿膠質(zhì)量標準的制定提供了有力參考，同時也為進一步研究指明了方向。

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