正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化厚樸酚與和厚樸酚的提取工藝

張碧瑤，劉利根，石心紅

(中國藥科大學(xué)中藥制劑教研室，南京 211198)

厚樸是木蘭科植物凹葉厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.或厚樸MagnoliaofficinalisRehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮[1]。在湖北北部、陜西南部、四川、甘肅東南部、河南東南部和貴州東北部等地分布廣泛，其中四川、湖北和安徽為較優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)區(qū)[2]，其藥用部位主要是樹皮，其中根皮和干皮中厚樸酚與和厚樸酚含量最高[3]，主治痰飲喘咳、濕滯傷中、食積氣滯和腹脹便秘[4]等癥。厚樸的有效成分有厚樸酚、和厚樸酚、四氫厚樸酚、異厚樸酚、厚樸醛、丁香脂素和厚樸木脂素等[5]，其中主要的有效活性成分是厚樸酚[6]與和厚樸酚[7]，二者互為同分異構(gòu)體，分子式為C18H18O2。厚樸酚為白色至黃褐色粉末，單體為無色針狀結(jié)晶[8];和厚樸酚為白色粉末，單體為無色鱗片狀晶體，二者均易溶于苯、乙醚、氯仿和乙醇等，均難溶于水?！吨袊幍洹?015年版規(guī)定，厚樸酚與和厚樸酚二者在厚樸中的含量不得少于2.0%[9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，厚樸酚與和厚樸酚這2種成分在厚樸中的藥用作用有很大關(guān)系。厚樸酚有導(dǎo)致肌肉松弛、抗菌[10]、抑制血小板凝集和抗腫瘤[11]等作用，臨床上主要使用厚樸酚制作抗菌和抗真菌藥物。和厚樸酚對腫瘤細(xì)胞有很好的療效，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化[13-16]；和厚樸酚衍生物有抗焦慮活性[17]，在臨床上有廣闊的應(yīng)用前景。

目前，中藥溶劑提取最常用的方法為煎煮法[18]、超聲提取法、索氏提取法[19]、微波提取法[20]和超臨界流體萃取等。為適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，根據(jù)厚樸酚與和厚樸酚易溶于乙醇且具有酚羥基等特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過單因素水平實(shí)驗(yàn)分析了pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和提取次數(shù)4個因素對厚樸酚與和厚樸酚提取率的影響，通過設(shè)計正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化提取條件。該實(shí)驗(yàn)旨在建立和優(yōu)選厚樸中厚樸酚與和厚樸酚的提取工藝模式，為深入開發(fā)和利用厚樸提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-20AT型高效液相系統(tǒng)：(日本島津公司)；色譜柱為C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KH-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；pH精密試紙(上海三愛思試劑有限公司)。

1.2試藥 厚樸藥材(購于湖北恩施)；無水乙醇，濃硫酸(分析純，南京化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉(湖南爾康制藥有限責(zé)任公司)；甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1厚樸酚與和厚樸酚含量測定的方法學(xué)考察

2.1.1色譜條件 色譜柱：C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(78∶22)；檢測波長：294 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃。在上述色譜條件下，和厚樸酚與厚樸酚得以分離，保留時間分別為10.01和14.48 min。

2.1.2線性關(guān)系考察 稱取厚樸酚與和厚樸酚適量，置于100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成混合對照品溶液。分別取混合對照品溶液0.5，2，4，6，8和10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成不同質(zhì)量濃度梯度的系列對照品溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

得到厚樸酚與和厚樸酚的線性回歸方程分別為y1=3×107x1+33 112和y2=3×107x2+ 24 121，r=0.999 9。結(jié)果表明，厚樸酚與和厚樸酚在0.004 5～0.09和0.007 2～0.144 mg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.1.3精密度實(shí)驗(yàn) 取2.1.2項(xiàng)下制備的對照品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件，注入高效液相色譜儀，分別連續(xù)測定6次，記錄色譜圖，測定峰面積，計算得厚樸酚與和厚樸酚的RSD值分別為1.71%和1.13%，結(jié)果表明，含量測定的精密度良好，符合定量測定的要求。

2.1.4穩(wěn)定性考察 取2.1.2項(xiàng)下制備的對照品溶液，室溫避光放置，分別于0，3，6，9，12和24 h進(jìn)樣測定，進(jìn)樣記錄峰面積，計算RSD值分別為0.01%和1.13%。結(jié)果表明，厚樸酚與和厚樸酚在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照2.1.2項(xiàng)下方法平行制備6份對照品溶液，經(jīng)微孔濾膜過濾后分別注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，計算厚樸酚與和厚樸酚的RSD值均為0.01 %，結(jié)果表明，含量測定的重復(fù)性良好。

2.1.6加樣回收率實(shí)驗(yàn) 在3份對照品溶液中依次加入不同質(zhì)量濃度的厚樸酚與和厚樸酚對照品，進(jìn)樣20 μL，計算得厚樸酚與和厚樸酚的平均加樣回收率分別為101.6%和100.6%，RSD值分別為1.60%和0.90%。

2.2厚樸藥材中厚樸酚與和厚樸酚的含量測定 厚樸藥材用藥材粉碎機(jī)打成粉末，過3號篩，精密稱取0.2 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，浸泡24 h后，精確量取5 mL提取液，置于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取20 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行含量測定。

《中國藥典》2015年版規(guī)定，厚樸藥材中厚樸酚與和厚樸酚的含量應(yīng)不少于2.0%。含量測定結(jié)果表明，每1.0 g厚樸藥材中含有厚樸酚與和厚樸酚的總量為2.604×10-2g，含量在2.0%以上。

圖1HPLC圖

A.對照品；B.陰性對照；C.供試品；1.和厚樸酚；2.厚樸酚。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.negative control；C.sample；1.honokiol；2.magnolol.

2.3厚樸酚與和厚樸酚的提取 稱取厚樸藥材粉末10 g，置于燒杯中，按照相應(yīng)的液料比加入不同體積分?jǐn)?shù)和pH值的乙醇溶液，將燒杯密封，放入超聲清洗儀中，設(shè)置超聲清洗儀參數(shù)為25 ℃，頻率為100 Hz，提取2次，每次提取完成后用真空泵減壓抽濾，合并提取液。精確量取提取液0.1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取20 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行含量測定。

2.4單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1不同體積分?jǐn)?shù)乙醇 稱取厚樸藥材粉末10 g，置于10倍量體積、pH值為7的不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液中，超聲提取1次，0.5 h。取提取液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣20 μL，計算提取率。選擇體積分?jǐn)?shù)為20%，35%，50%，65%，80%和95%的乙醇溶液作為研究水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，厚樸酚與和厚樸酚的提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高先增加后逐漸趨于平穩(wěn)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時即達(dá)到峰值，故乙醇體積分?jǐn)?shù)的水平選擇為50%，65%和80%。

2.4.2不同pH值 稱取厚樸藥材粉末10 g，置于10倍量體積、不同pH值的體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液中，超聲提取1次，0.5 h。pH值選擇6，7，8，9和10為研究水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，厚樸酚與和厚樸酚的提取率隨著pH值的增加而增加。因pH值為10時，溶液顏色為深綠色，懷疑在此pH值時，部分厚樸酚與和厚樸酚被氧化，因此不選擇pH值為10進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選擇pH水平因素為7，8和9。

2.4.3不同提取次數(shù) 稱取厚樸藥材粉末10 g，置于10倍量體積、pH值為7的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中，提取數(shù)次，每次0.5 h。取提取液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣20 μL，計算提取率。選擇提取次數(shù)為1，2，3，4和5作為研究水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取率隨提取次數(shù)的增多而增加，在提取3次時達(dá)到平衡，在提取2次時能達(dá)到90%以上，但在提取次數(shù)為1次時，提取率已經(jīng)達(dá)到80%，可認(rèn)為提取次數(shù)對提取率的影響較小，在設(shè)計正交表格時不列入考慮范圍，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時選擇提取2次作為實(shí)驗(yàn)條件。

2.4.4不同液料比 單因素實(shí)驗(yàn)稱取厚樸藥材粉末10 g，置于不同體積、pH值為7的體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇溶液中，提取1次，0.5 h。液料比選取5∶1，8∶1，10∶1，12∶1和15∶1作為研究水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著液料比的增加對于堿性乙醇超聲提取的提取率也隨之增加，因此選擇5∶1，10∶1和15∶1共3個液料比作為水平因素。

2.5正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果分析 在藥材厚樸粉末厚樸酚與和厚樸酚提取的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計中，依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)所確定的因素，將乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH值和液料比做3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

Tab.1 Factors and levels of the orthogonal experiment

水平A,乙醇體積分?jǐn)?shù)/%B,pH值C,液料比/mL·g-115075∶1265810∶1380915∶1

表2正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of the orthogonal experiment

實(shí)驗(yàn)序號ABC提取率/%18085∶185.59280910∶157.90365710∶154.6746595∶1100.78565815∶183.50650915∶114.7575075∶131.82880715∶142.52950810∶137.42K183.99129.01218.19K2238.95206.51144.39K3186.01173.43140.77R154.9677.5077.42

以《中國藥典》2015年版規(guī)定的厚樸藥材中厚樸酚與和厚樸酚的含量為指標(biāo)，進(jìn)行3水平3因素正交實(shí)驗(yàn)，見表2。由表2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對厚樸酚與和厚樸酚的提取率影響最大，其次為pH值，液料比影響最小，見表3。由表3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響較為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，pH值和液料比影響不明顯。綜合分析，優(yōu)選厚樸酚及和厚樸酚提取的優(yōu)選條件是：A2B2C1，即：pH值為8、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、液料比為5∶1、提取次數(shù)為2次。

表3正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果

Tab.3 Results of variance analysis of the orthogonal experiment

因素偏差平方和自由度方差F顯著性乙醇體積分?jǐn)?shù)4135.92522067.96335.489<0.05pH值1008.1862504.0938.651>0.05液料比1192.2342596.11710.230>0.05誤差 116.5402 58.270

2.6正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 以厚樸藥材中厚樸酚與和厚樸酚的提取率為指標(biāo)，按照正交優(yōu)選實(shí)驗(yàn)選出的工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，pH值為8，提取次數(shù)為2次，每次提取時間為0.5 h，液料比為5∶1，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)的提取液平行取3份樣品，得到平均提取率為94.08%，104.50%和101.73%。結(jié)果表明，所選工藝條件厚樸酚與和厚樸酚的提取效率較高且重復(fù)性較好。

3 討論

近年來，厚樸已成為漸危種，優(yōu)質(zhì)的厚樸藥材越發(fā)珍貴，可見對厚樸中有效成分的提取對于資源保護(hù)有重要意義。厚樸酚與和厚樸酚作為厚樸的主要活性成分，在抗癌和抗菌方面效果突出，在臨床上有較為廣闊的應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)中用堿性乙醇超聲提取法提取厚樸藥材中的厚樸酚與和厚樸酚，利用超聲的空化效應(yīng)，使植物細(xì)胞壁加速破裂，有利于有效成分的快速溶出。同時結(jié)合了厚樸酚與和厚樸酚的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，二者均是酚類物質(zhì)，呈酸性，在乙醇溶液中加入適量的氫氧化鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，使有效成分能更好地溶解在溶液中，進(jìn)一步提高提取效率。經(jīng)優(yōu)化后的提取方法操作簡單、提取效率高，可為工業(yè)提取厚樸酚與和厚樸酚提供參考。

本實(shí)驗(yàn)通過單因素水平實(shí)驗(yàn)分析了pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和提取次數(shù)4個因素對厚樸酚與和厚樸酚提取率的影響。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)所確定的因素，將乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH值和液料比設(shè)計3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件，為深入開發(fā)和利用厚樸提供理論依據(jù)。厚樸酚與和厚樸酚為同分異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)類似，但藥理活性不同，因此，將二者從厚樸中提取后，將其進(jìn)一步分離純化也是非常重要的步驟，在筆者之后的工作中將對其進(jìn)行研究。

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