維藥祖卡木顆粒HPLC指紋圖譜研究

張明惠，季志紅，馬 璇，李柯翱

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011；2.新疆奇康哈博維藥股份有限公司，烏魯木齊 830026)

維藥祖卡木顆粒為《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊》(1998年)收載，由大黃和睡蓮花等10味藥組成。臨床上用于治療感冒咳嗽、發(fā)熱無汗、咽喉腫痛和鼻塞流涕[1]。目前，對祖卡木顆粒的質(zhì)量控制，多采用其中1或2種中藥成分的含量測定或TLC鑒別。有關(guān)祖卡木顆粒質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報道有大黃素、大黃酚、罌粟堿和嗎啡的含量測定[2-5]，甘草、山柰中主要成分的含量測定[6-8]。這些檢測方法并不能完全反映祖卡木顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，均具有片面性。提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是祖卡木顆粒以后的發(fā)展方向，同時可提高患者的用藥安全性。

中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，能夠較為全面地反映組方中的成分，作為能體現(xiàn)中藥整體特征的一種分析手段，在近年來的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中得到了廣泛的關(guān)注、研究、認(rèn)可[9-19]?，F(xiàn)對祖卡木顆粒HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究，可以更好地控制和保證祖卡木顆粒質(zhì)量的穩(wěn)定性，以期有效提高該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；Kromasil-C18色譜柱(阿克蘇·諾貝爾公司)；BT25S十萬分之一電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；AE-100萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012年版)。

1.2試藥 祖卡木顆粒(新疆奇康哈博維藥股份有限公司，批號：170465，170466，170467，160539，170127，170128，170124，150916，160843，160919)；沒食子酸對照品(批號110831-200302)，甘草酸銨對照品(批號110731-201418)，大黃素(批號110756-201512)，均購自中國食品藥品檢定研究院；煙花苷(成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-17040507)；對甲氧基肉桂酸乙酯(上海安譜實驗科技股份有限公司，批號CDAA-281185)；甲醇(色譜純)，F(xiàn)isher公司；娃哈哈純凈水；磷酸等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱：Kromasil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：流動相A為甲醇，流動相B為1.0 mL·L-1磷酸水溶液，梯度洗脫，程序見表1；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

表1梯度洗脫程序

Tab.1 The mobile phase program in gradient elution

時間/min流動相A/%流動相B/%01585103565355545406535456733507030557228587327637921698218

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 精密稱取所需對照品適量，用甲醇溶解并稀釋，配制成沒食子酸、煙花苷、對甲氧基肉桂酸乙酯、甘草酸銨和大黃素質(zhì)量濃度分別為0.02，0.01，0.02，0.02和0.007 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液 取祖卡木顆粒成品4.00 g，加入30 mL熱水振搖至完全溶解，放凉，定容至50 mL量瓶中。以水飽和正丁醇為萃取溶劑，萃取2次，每次50 mL，合并萃取上清液，蒸干。用體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇定容至50 mL量瓶中，以0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3線性關(guān)系考察 分別吸取質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的沒食子酸對照品儲備液0.2，0.4，0.8，1.6和3.2 mL，分別置于10 mL量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.04，0.08和0.16 mg·mL-1的沒食子酸系列對照品溶液。按照2.1項下色譜條件，精密吸取10 μL，測定沒食子酸峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明，沒食子酸回歸方程為y=2×107x+1 717.4，(r=0.999 9)，沒食子酸質(zhì)量濃度在0.01～0.16 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4精密度實驗 稱取祖卡木顆粒1份，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行色譜分析，記錄相應(yīng)色譜圖，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，計算結(jié)果顯示，所有共有峰相對保留時間的RSD值均小于0.10%，相對峰面積的RSD值均小于2.34%，結(jié)果表明，該儀器精密度良好。

2.5重復(fù)性實驗 稱取同一批號祖卡木顆粒6份，按照2.2.2項下方法制備所需的供試品溶液，分別進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析，記錄相應(yīng)色譜圖，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。計算結(jié)果顯示，所有共有峰相對保留時間的RSD值均小于0.11%，相對峰面積的RSD值均小于2.55%，結(jié)果表明，該實驗所用方法重復(fù)性良好。

2.6穩(wěn)定性實驗 稱取祖卡木顆粒1份，按照2.2.2項下方法制備成供試品溶液，在0，2，4，6，8，12和24 h分別進(jìn)樣，進(jìn)行色譜分析，記錄相應(yīng)色譜圖，分別計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，計算結(jié)果顯示，所有共有峰相對保留時間的RSD值均小于0.32%，相對峰面積的RSD值均小于3.0%，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7加樣回收率實驗 精密稱取9份已知含量的同一批祖卡木顆粒2 g，每3份為1組，每組精密加入一定量的沒食子酸對照品，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，平行操作9份，按照2.1項下色譜條件，精密吸取10 μL，進(jìn)行分析測定，計算回收率，見表2。由表2可知，沒食子酸的平均回收率為99.04%，RSD=2.79%(n=9)。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好。

表2沒食子酸加樣回收率實驗結(jié)果

Tab.2 The recovery test results of gallic acid (n=9)

2.8共有峰的建立及鑒別 取10批祖卡木顆粒按照2.2.2項下方法制備成所需的供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄并對色譜圖進(jìn)行分析，確定祖卡木顆粒指紋圖譜的共有模式圖，通過對照品對比標(biāo)示出幾個特征峰。祖卡木顆粒指紋圖譜共有模式圖見圖1。由圖1可知，共標(biāo)出18個共有峰。對照品與共有模式HPLC指紋圖譜對比圖見圖2。由圖2可知，經(jīng)單味藥劑與對照品鑒別確認(rèn)，其中1，7，15，17和18號峰分別為沒食子酸、煙花苷(S)、對甲氧基肉桂酸乙酯、甘草酸銨和大黃素。10批祖卡木顆粒的HPLC指紋圖譜見圖3。

圖1祖卡木顆粒HPLC指紋圖譜共有模式

Fig.1 The mutual pattern of HPLC fingerprint of Zukamu Granules

2.9相似度分析 將測定的10批祖卡木顆粒色譜圖數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012年版)，進(jìn)行峰匹配，生成對照指紋圖譜，計算出10批祖卡木顆粒指紋圖譜的相似度值，相似度范圍在0.951～0.999之間，見表3。結(jié)果表明，目前祖卡木顆粒的質(zhì)量相對可靠，建立的指紋圖譜可使質(zhì)量更為可控。

圖2對照品與共有模式HPLC圖譜對比

1.沒食子酸；7.煙花苷 (S)；15.對甲氧基肉桂酸乙酯；17.甘草酸銨；18.大黃素。

Fig.2 HPLC fingerprint of reference substance and mutual pattern

1.gallicacid；7.kaempferol-3-O-rutinoside (S)；15.ethyl-4-methoxycinnamate；17.ammonium-glycyrrhizinate；18.emodin.

圖310批祖卡木顆粒的HPLC圖

Fig.3 HPLC fingerprints of 10 batches of Zukamu Granules

表310批祖卡木顆粒相似度結(jié)果

Tab.3 The results of similarity of 10 batches Zukamu Granules

樣品S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10RS11.0000.9820.9910.9980.9800.9910.9840.9840.9830.9840.995S20.9821.0000.9830.9800.9960.9820.9650.9650.9600.9500.984S30.9910.9831.0000.9910.9850.9990.9930.9930.9890.9860.998S40.9980.9800.9911.0000.9760.9900.9830.9830.9830.9850.994S50.9800.9960.9850.9761.0000.9830.9660.9670.9620.9510.984S60.9910.9820.9990.9900.9831.0000.9940.9930.9910.9870.999S70.9840.9650.9930.9830.9660.9941.0000.9990.9920.9920.995S80.9840.9650.9930.9830.9670.9930.9991.0000.9900.9900.994S90.9830.9600.9890.9830.9620.9910.9920.9901.0000.9960.992S100.9840.9500.9860.9850.9510.9870.9920.9900.9961.0000.990R0.9950.9840.9980.9940.9840.9990.9950.9940.9920.9901.000

3 討論

3.1提取溶劑的選擇 考慮到祖卡木顆粒中所含的10種藥材，因其各化學(xué)成分的性質(zhì)大相徑庭，又想最大限度地展現(xiàn)各化學(xué)成分的特征。通過查閱文獻(xiàn)選擇了2種溶劑，以熱水和體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇為提取溶劑，提取液過濾膜，續(xù)濾液進(jìn)樣，色譜圖顯示，熱水為溶劑時相同色譜條件下峰更多，最終確定熱水為提取溶劑。

3.2提取方法的選擇 以熱水為提取溶劑。3種提取方法：直接振搖至完全溶解、超聲5 min以及回流提取15 min。3種提取方法結(jié)果顯示：相同色譜條件下色譜峰無明顯變化，從實驗操作簡單方面考慮，選擇直接振搖溶解。

3.3萃取溶劑的選擇 稱取樣品適量，加熱水振搖至完全溶解后，分別以氯仿、乙酸乙酯和水飽和正丁醇等體積萃取，萃取后，合并上清液，蒸干，定容至50 mL量瓶中，過0.22 μm濾膜,進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)相同色譜條件下水飽和正丁醇萃取后的樣品峰較多且峰面積較大，能達(dá)到分離要求。最終確定以水飽和正丁醇為萃取溶劑。

3.4檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器190～400 nm掃描各單個藥材提取液和祖卡木顆粒成品供試品溶液，考察了230，254，273，294，344和360 nm波長。對比3D圖譜和各波長，結(jié)果表明，254 nm的圖譜色譜信息豐富，且除已知成分能夠較好地檢測外，其他成分指紋峰也能被較好地體現(xiàn)，故選擇254 nm作為檢測波長。

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