AB-8大孔樹脂分離純化人參保健酒皂苷的工藝研究

諸曉波，李德坤，郭巧生*，鞠愛春*，葉正良*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學中藥材研究所，江蘇 南京 210095；2.天津市中藥注射劑安全性評價企業(yè)重點實驗室，天津 300402；3.天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，天津 300402）

人參是五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根莖，具有抗疲勞、抗腫瘤、提高免疫力、補氣安神［1］等功能。人參主要含有人參皂苷 Rb1、Rg1等30多種人參皂苷，并含有人參多糖、人參揮發(fā)油等多種活性成分。人參具有良好功能，故被制作成各種保健品，然而人參保健酒藥材多、成分復雜，不利于質(zhì)量監(jiān)控。

人參保健酒的樣品前處理主要集中在皂苷的分離純化、大孔吸附樹脂［2-3］、萃取［4］等。本實驗室前期研究中比較了幾種不同樣品前處理方法對含量測定的影響，最終篩選出AB-8大孔吸附樹脂純化分離人參單體皂苷，以人參皂苷Rg1、Re、Rb1為指標，利用HPLC法測定含量，進行工藝研究。本實驗系統(tǒng)考察了人參皂苷的工藝參數(shù)，包括吸附量、吸附流速、洗脫溶酶濃度、洗脫流速等，為人參保健酒中皂苷含量測定提供參考。

1 儀器和試藥

Waters2695高效液相、Waters2489紫外檢測器、Empower2工作站 ［沃特世科技（上海）有限公司］；METTLER XS105型十萬分之一電子分析天平 ［梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司］；數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；色譜柱：艾杰爾Venusil MPC18（2）（序列號：VA952505-2，天津博納艾杰爾科技有限公司）；布琦水浴鍋（瑞士布琦有限公司）；層析柱；常規(guī)玻璃儀器等。

人參保健酒樣品（自制）；人參皂苷Rg1（中國食品藥品檢定研究院，純度91.7%，批號：110703-201530）；人參皂苷Re（天津一方科技有限公司，純度98%，批號：Am250G）；人參皂苷Rb1對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：93.7%，批號：110704-201424）；磷酸（分析純，天津華東試劑廠）；乙腈、甲醇為色譜純（美國OMNI公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；AB-8型大孔吸附樹脂（孔徑13～14 nm，天津市海光化工有限公司）。

2 保健酒中人參皂苷含量測定

2.1 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對照品適量，用甲醇定容至25 mL量瓶中，制成混合對照品溶液，搖勻，質(zhì)量濃度分別為Rg1：0.670 1 mg·mL-1，Re：0.692 7 mg·mL-1，Rb1：1.134 2 mg·mL-1，備用。

2.2 供試品溶液的制備

取15 mL保健酒樣品水浴揮干，用水溶解后上預先處理好的AB-8樹脂柱（60～80目，柱內(nèi)徑6～8 mm，樹脂柱高約10 cm），用0.05 mol·L-1的氫氧化鈉沖洗，棄去；30%甲醇溶液沖洗，棄去；甲醇洗脫至蒸發(fā)皿中，水浴揮干，用1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，即得。

2.3 人參專屬性溶液制備

人參保健酒的處方中不加入人參藥材制成陰性對照，溶液制備方法同供試品溶液的制備項下方法。

2.4 色譜條件

色譜柱：艾杰爾 Venusil MP C18（2）分析柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相：乙腈-0.05%磷酸水梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1；柱溫為30℃；檢測波長為203 nm；進樣量為10μL。

2.5 含量測定

分別吸取對照品溶液、樣品溶液、人參專屬性樣品進樣，計算含量，色譜圖見圖1。

表1 液相梯度洗脫程序

圖1 人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量測定HPLC圖

2.6 標準曲線繪制

精密吸取對照品母液1.0、3.0、5.0、6.0、8.0 mL，分別用甲醇定容至10 mL量瓶中，搖勻。分別精密吸取上述對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，將峰面積Y與對照品濃度X作線性回歸，得標準曲線：YRg1＝5×106X+28 819，r＝0.999 61；YRe＝4×106X+28 819，r＝0.999 29；YRb1＝3×106X+28 819，r＝0.999 67，人參皂苷Rg1在0.134 0～0.067 0mg·mL-1線性良好；人參皂苷Re在0.138 5～0.069 7mg·mL-1線性良好；人參皂苷Rb1在0.143 5～0.113 4mg·mL-1線性良好。

2.7 精密度試驗

精密吸取上述同一對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，測定色譜峰面積。人參皂苷Rg1、Re、Rb1的RSD分別為0.19%、0.12%、0.16%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液分別于0、4、8、12、16、20 h進樣，進樣量10μL，人參皂苷Rg1、Re、Rb1的RSD分別為0.12%、0.05%、0.13%，表明人參皂苷Rg1、Re、Rb1在20 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.9 重復性試驗

取同一批人參酒樣品，按2.2項下制備6份供試品溶液，測定。人參皂苷Rg1、Re、Rb1的RSD分別為0.9%、1.0%、1.3%，表明樣品處理方法重復性良好。

2.10 回收率試驗

吸取已知含量的樣品6份，分別加入一定量的對照品溶液，按各2.2項下制備樣品，測定，計算加樣回收率。人參皂苷Rg1、Re、Rb1的平均回收率為 97.43%、98.24%、97.58%，RSD分別為0.51%、0.47%、0.86%。

3 工藝條件及參數(shù)優(yōu)化

3.1 大孔樹脂預處理

AB-8型大孔樹脂是苯乙烯弱極性共聚體，本實驗使用的是凈品樹脂，新樹脂使用前加入高出樹脂層2～3 cm乙醇浸泡3 h，用水沖洗至中性，備用。

3.2 泄漏曲線考察

取保健酒樣品40.0 mL水浴揮干，用等量水溶解后上裝有AB-8大孔樹脂2 g的層析柱（柱體積約3 mL），控制流速為0.6 mL·min-1，每5.0 mL為1個流份，收集8份，蒸干，照2.2項下自 “上預先處理好的AB-8樹脂柱”起，依法制得供試品溶液，并測定各流份中人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量。以過柱液中3個皂苷含量為縱坐標，累計上樣體積為橫坐標，繪制泄漏曲線，見圖2。

圖2 人參皂苷泄漏曲線考察

結(jié)果顯示，從第5流份開始，流出液顏色逐漸加深，人參皂苷開始泄漏，故可確定最大上樣量為20 mL，即2 g AB-8樹脂可以吸附1 g生藥量。

3.3 洗脫溶媒濃度考察

3.3.1 甲醇濃度考察 吸取10.0 mL保健酒樣品，水浴揮干溶解后上已處理好的AB-8柱（柱體積約3 mL），依次用純化水、0.05 mol·L-1氫氧化鈉、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、純甲醇各20.0 mL進行梯度洗脫，分別收集洗脫液于蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴揮干，加1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，即得。用 HPLC法測定人參皂苷 Rg1、Re、Rb1的含量，以確定甲醇的濃度，結(jié)果見表2。

表2 不同濃度甲醇洗脫皂苷含量

由表中可知，30%甲醇對皂苷洗脫無影響，90%甲醇洗脫率最高，累計洗脫率達95.41%，故確定90%的甲醇作為洗脫劑。

3.3.2 氫氧化鈉濃度考察 在3.3.1項的基礎上考察氫氧化鈉的濃度。吸取滲漉液3份各10.0mL，水浴揮干溶解后上預先處理好的 AB-8柱（柱體積約3 mL），依次用純化水、不同濃度的氫氧化鈉（收集）、30%甲醇、90%甲醇洗脫，收集洗脫液于蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴揮干，加1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，即得。用HPLC法測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量。

由表3可知，隨著氫氧化鈉濃度增加，90%甲醇洗脫液中人參皂苷含量下降。當氫氧化鈉濃度為0.15 moL·L-1時，含量最低，故選擇0.05 moL·L-1氫氧化鈉作為除色素溶液。

表3 不同氫氧化鈉濃度皂苷含量

3.4 洗脫溶媒用量考察

90%甲醇洗脫用量考察：吸取10.0 mL保健酒樣品，水浴揮干溶解后上預先處理好的AB-8柱（柱體積約3 mL），依次用純化水、0.05 moL·L-1氫氧化納、30%甲醇洗脫，棄去，90%甲醇洗脫，洗脫流速：0.6 mL·min-1，每5 mL收集1份洗脫液于蒸發(fā)皿內(nèi)水浴揮干，加1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，即得。用HPLC法測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量，以確定90%甲醇洗脫用量，結(jié)果見圖3。

圖3 洗脫劑用量考察曲線圖

由下圖可知，當洗脫劑用量為10 mL時，樹脂顏色變淡，洗脫劑用量為15 mL時，洗脫液顏色變白，當90%甲醇洗脫劑用量為20 mL時，洗脫的人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量為100%。故最佳洗脫體積為20 mL。

3.5 洗脫流速考察

吸取滲漉液4份各10.0mL，水浴揮干溶解后上已處理好的AB-8柱（約3 cm高），依次用純化水、0.05 moL·L-1氫氧化鈉、30%甲醇洗脫，棄去，用20 mL 90%甲醇洗脫，洗脫流速分別調(diào)至0.3、0.6、1、1.5 mL·min-1，收集洗脫液于蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴揮干，加1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，即得。用HPLC法測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量，以確定洗脫流速，結(jié)果見表4。

表4 人參皂苷洗脫流速考察結(jié)果

由上表可知當洗脫速度為0.3 mL·min-1時，洗脫下來的皂苷含量最高，但0.6 mL·min-1洗脫速度的洗脫率較高，從時間上考慮，選擇0.6 mL·min-1的洗脫速度。

3.6 樣品前處理AB-8大孔樹脂純化富集工藝驗證

選用AB-8大孔吸附樹脂，條件為上樣量10.0mL（0.5 g生藥量／g樹脂），0.05 moL·L-1氫氧化鈉、30%甲醇洗脫，棄去，20 mL 90%甲醇洗脫，洗脫流速為0.6 mL·min-1。收集洗脫液于蒸發(fā)皿水浴揮干，加1.0 mL水溶解，過0.45μm濾膜，用HPLC法測定人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量。

表5 重復驗證結(jié)果（n＝4）mg

結(jié)果顯示，在該工藝條件下，人參皂苷測得量較高，色譜圖較好，提示該工藝可行，可用于保健酒質(zhì)量控制中HPLC測人參皂苷Rg1、Re、Rb1。

4 討論

本文選用AB-8大孔吸附樹脂富集純化人參皂苷，通過考察人參皂苷泄露曲線、甲醇洗脫濃度及用量、氫氧化鈉洗脫濃度、甲醇洗脫速度為人參保健酒皂苷檢測提供參考。本文研究發(fā)現(xiàn)，單體皂苷和人參總皂苷的檢測不同，洗脫劑的濃度也不同，許多文獻表明，70%或80%的乙醇［5］對總皂苷的洗脫率最高，而本研究表明，人參單體皂苷適宜的洗脫濃度為90%甲醇。氫氧化鈉作為除色素常用的堿時，要注意考察濃度，濃度過高，人參皂苷含量反而下降。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

［2］ 王博.人參酒中人參皂苷前處理技術研究［J］.人參研究，2016，28（6）：18-19.

［3］ 郭婷婷，王兆華，張大軍.大孔樹脂分離純化西洋參葉總皂苷的工藝研究［J］.中國現(xiàn)代中藥，2016，18（9）：1196-1200.

［4］ 姚海燕，萬玉華，沈雅婕，等.大孔吸附樹脂純化人參總皂苷的工藝研究［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2013，6（2）：84-88.

［5］ 黃立新，熊友文，張啟云，等.紅參中人參總皂苷的大孔樹脂純化工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（6）：6-9.