草魚NADPH氧化酶2個調(diào)節(jié)亞基cDNA的克隆及表達特征

張 林 ，周劍光，吳 濤

(1.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.武漢輕工業(yè)大學，武漢 430023)

NADPH氧化酶主要存在于中性粒細胞及其它吞噬細胞的細胞膜上，能夠產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，具有殺菌作用，并參與宿主細胞的免疫應答[1]。NADPH氧化酶是一種高度調(diào)節(jié)的多亞基氧化酶復合體[2]，它的組裝與激活需要胞質(zhì)亞基p47phox、p40phox、p67phox磷酸化與激活，活化的催化亞基p47phox與p40phox轉(zhuǎn)移到胞膜與胞膜亞基gp91phox及p22phox結(jié)合并組裝成NADPH氧化酶全酶。當有適當外源物刺激時，NADPH氧化酶就被轉(zhuǎn)錄激活。其中胞質(zhì)亞基p47phox、p40phox在激活NADPH氧化酶中發(fā)揮著重要的作用[3-6]。

人(Homosapiens)[7]、鼠(Musmusculus)[8]、野牛(Bisonbison)[9]和海豚(Tursiopstruncatus)[10]NADPH氧化酶的5個亞基均已被克隆和描述。魚類NADPH氧化酶的5個亞基的cDNA也已從紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[11]、鯉(Cyprinuscarpio)[12]、翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)[13]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鮭(Salmosalar)、香魚(Plecoglossusaltivelis)和斑馬魚(Daniorerio)中克隆出來。在NCBI數(shù)據(jù)庫中僅見到大西洋鮭(Salmo salar)的gp91phox、p47phox、p67phox亞基的cDNA全序列的報道?？梢妼ζ渌~類NADPH氧化酶的研究還較少。

草魚(C.idellus)在我國分布廣泛，是非常重要的淡水經(jīng)濟魚類。然而，疫病是限制草魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素之一。鑒于NADPH氧化酶能生成用于清除病原微生物的活性氧，在機體的防御體系中起著非常重要的作用，而迄今還未發(fā)現(xiàn)有關(guān)草魚NADPH氧化酶p47phox、p40phox基因的相關(guān)報道。本研究克隆了草魚NADPH氧化酶的2個重要調(diào)節(jié)亞基p47phox和p40phox基因，并對其編碼的氨基酸序列進行了分析，同時對這2個亞基在草魚不同組織中的差異表達情況檢測，以期了解NADPH氧化酶在魚類免疫調(diào)節(jié)中的作用及為魚類疾病爆發(fā)的機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用草魚體重200 g左右，來自中科院水生生物研究所關(guān)橋養(yǎng)殖場。運回實驗室后，暫養(yǎng)5 d，恒溫(20±2)℃，空氣充氧，暫養(yǎng)過程中每天投喂一次人工飼料。Trizol試劑購自Invitrogen 公司；Ex-Taq聚合酶、DL-2000 Marker、pMD-18Tvector均購自TaKaRa公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit：購自美國Thermo公司；iQTM SYBR?Green Supermix：購自美國Bio-Rad公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mego公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由本實驗室保存。

1.2 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫中斑馬魚和鯉魚的NADPH氧化酶p40phox和p47phox亞基cDNA序列保守區(qū)設(shè)計簡并引物，擴增中間片段，RACE擴增所需特異性引物根據(jù)擴增出來的中間片斷設(shè)計，熒光定量PCR擴增所需引物根據(jù)全長cDNA序列設(shè)計。所有引物均由上海生工生物公司合成(表1)。

表1 克隆及檢測草魚NADPH氧化酶p40phox和p47phox亞基的引物Tab.1 Primers used in cloning and decting p40phox and p47phox subunit of NADPH oxidase of C.idellus

續(xù)表1

注：R：A/G;Y：C/T;M：A/C;K：G/T;S：C/G;W：A/T;B：C/G/T;D：A/G/T;H：A/C/T;V：A/C/G.

1.3 RNA的提取和SMART cDNA的合成

取草魚頭腎和脾臟混合，按Trizol試劑盒說明書介紹的方法提取混合組織的RNA。瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質(zhì)量。按照Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit方法進行第一鏈cDNA合成。具體操作按說明書進行。

1.4 各亞基中間片段及全長cDNA的擴增

根據(jù)表1所列引物，以第一鏈cDNA做為模板，先用簡并引物擴增出基因的cDNA片段，再根據(jù)各個基因?qū)奶禺愋砸?，?′-RACE引物和SMART5′錨定引物(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′)擴增基因的5′端，用3′-RACE引物和SMART 3′錨定引物(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′)擴增基因的3′端。擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序后，拼接基因的5′端和3′端序列，獲得各基因的全長cDNA序列。

1.5 基因的氨基酸推測和序列比較分析

將測序所得到的cDNA序列用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTN、BLASTX和TBLASTX軟件進行同源基因的搜索，查找與其相關(guān)的同源序列；氨基酸序列的推斷和疏水性分析通過ExPASy網(wǎng)站上(http://www.expasy. org/)的軟件完成；氨基酸序列同源性比較由ClustalW2.1程序完成。結(jié)構(gòu)域分析用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de)預測。

1.6 不同組織的差異表達分析

用實時熒光PCR方法定量分析草魚NADPH氧化酶2個調(diào)節(jié)亞基在草魚組織表達分布的狀況，檢測和分析方法參照文獻[14]。分別提取健康草魚胸腺、心、頭腎、鰓、腸、肝、腎、脾和皮膚中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Real-time PCR引物擴增各基因序列(表1)，PCR產(chǎn)物用DNA膠純化試劑盒純化后克隆進入載體pMD18T。質(zhì)粒DNA經(jīng)純化后用于制作標準濃度曲線，曲線的斜率應在-3.6與-3.2之間，相關(guān)系數(shù)應大于0.96。以草魚各組織樣品cDNA為模板，進行熒光定量PCR，PCR反應體系和反應條件與上述建立標準曲線的一致。利用CFX96TM Real-Time System(BIO-RAD)自帶CFX Manager軟件觀察熒光定量的結(jié)果以及數(shù)據(jù)的導出，通過Excel工具計算目的基因與內(nèi)參基因拷貝數(shù)比值來確定草魚p47phox和p40phox基因mRNA水平的相對表達量，即以相對于內(nèi)參基因β-actin的歸一化認定值表征目的基因的表達水平。每樣品重復3次，結(jié)果計算采用Livak的2-ΔΔCT方法[15]。

2 結(jié)果

2.1 草魚p47phox和p40phox基因cDNA全長的克隆及特征

取草魚頭腎和脾臟混合，提取RNA，以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，通過簡并引物進行巢式PCR，獲得大小為703 bp的p47phox片段和大小為875 bp的p40phox片段;通過5′RACE-PCR擴增，獲得長度為774 bp的p47phox5′端片段和長度為182 bp的p40phox5′端片段；通過3′RACE-PCR擴增，獲得大小為486 bp的p47phox 3′端片段和1 335 bp的p40phox 3′端片段，PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖1和圖2 。對所獲得的片段進行拼接，得到大小為1 589 bp的p47phox亞基cDNA全長序列，ORF為1 233 bp，5′UTR長度為49 bp，3′UTR長度為307 bp，包含加尾信號和25 bp的poly(A)尾各1個，無mRNA不穩(wěn)定信號。由cDNA序列推斷：p47phox亞基編碼由410個氨基酸組成的肽鏈，預測其相對分子質(zhì)量為47.77×103，理論pI為8.08。同時得到大小為2 103 bp的p40phox亞基cDNA全長序列，ORF為1 068 bp，5′UTR長度為28 bp，3′UTR長度為1 007 bp 包括1個29 bp的加尾信號、5個poly(A)尾，無mRNA不穩(wěn)定信號。由cDNA序列推斷：p40phox亞基編碼由355個氨基酸組成的肽鏈，預測其相對分子量為45.68×103，理論pI為7.83。由2個cDNA序列推斷的肽鏈序列均無信號肽和跨膜區(qū)，因此推斷草魚p47phox/p40phox為非分泌型蛋白。

圖1 草魚p47phox同源片段、5′RACE、3′RACE電泳圖Fig.1 Electrophoresis results of homologous fragment，5′RACE，3′RACE of p47phox in C.idellusM:DL2000 marker；1:p47phox同源片段PCR產(chǎn)物；2:5′RACE—PCR產(chǎn)物；3:3′RACE—PCR產(chǎn)物

圖2 草魚p40phox同源片段、5′RACE、3′RACE電泳圖Fig.2 Electrophoresis results of homologous fragment，5′RACE，3′RACE of p40phox in C.idellusM:DL2000 marker；1:p40phox同源片段PCR產(chǎn)物；2:5′RACE—PCR產(chǎn)物；3:3′RACE—PCR產(chǎn)物

2.2 草魚與其他動物的對應調(diào)節(jié)亞基的氨基酸序列比對

用BLAST程序?qū)Σ蒴~NADPH氧化酶2個調(diào)節(jié)亞基p47phox/p40phox編碼的肽鏈進行同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：草魚NADPH氧化酶2個調(diào)節(jié)亞基與團頭魴、鯉魚和斑馬魚的同源亞基的氨基酸序列同源性在81%～96%之間，而與墨西哥脂鯉、大西洋鮭和白斑狗魚等魚類對應亞基同源性在68%～74%之間。推斷p47phox亞基含有1個PX 結(jié)構(gòu)域(Val6-Glu123)、2個SH3結(jié)構(gòu)域(Ser162-Pro214；Leu232-Arg284)、1個PC基序(motif)(Pro354-Gln408)。P40phox亞基含有PX結(jié)構(gòu)域(Asn19-Gln140)、SH3結(jié)構(gòu)域(Arg170-Ile223)、PB1結(jié)構(gòu)域(Ser249-Ala344)各1個。p47phox和p40phox編碼肽鏈同源性比對及功能域分析結(jié)果見圖3和圖4。另外，通過CLUSTAL比對顯示這兩個亞基的結(jié)構(gòu)域與人、鼠、野牛等哺乳動物對應的亞基蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)域和功能位點基本上匹配，說明這些亞基的功能與哺乳動物對應的亞基相似。

圖3 草魚p47phox同源比對結(jié)果及功能域分析Fig.3 Alignment of p47phox amino acid sequences of C.idellus and the function domain analysis箭頭分別指示PX結(jié)構(gòu)域、2個SH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點及PC motif，假定的p67phox結(jié)合位點。

2.3 p40phox和p47phox亞基在草魚不同組織中差異表達分析

通過實時定量PCR分析：NADPH氧化酶2個調(diào)節(jié)亞基p47phox和p40phox在草魚胸腺、心、頭腎、鰓、腸、肝、腎、脾和皮膚等不同組織中的表達強度不同(圖5)。在9種組織中都能檢測到這兩種亞基的表達。其中p47phox基因在皮膚，心臟和胸腺中表達最高，其次是鰓，肝臟，脾臟和頭腎，但不同組織之間沒有顯著性差異(P>0.05)。p40phox在心臟、胸腺和皮膚中表達最高，其次是腸、頭腎、脾臟，在肝、鰓和腎中也有表達，但不同組織之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

圖4 草魚p40phox同源比對結(jié)果及功能域分析Fig.4 Alignment of p40phox amino acid sequences of C.idellus and the function domain analysis箭頭分別指示PX結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域及PB1結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點。

圖5 p47phox和p40phox在草魚不同組織中的mRNA水平分析Fig.5 Analysis of mRNA level about p47phox and p40phox gene of different tissues in C.idellus

3 討論

本研究通過同源性比對設(shè)計引物，結(jié)合RT-PCR與RACE-PCR技術(shù)，克隆獲得草魚NADPH氧化酶2個調(diào)節(jié)亞基p47phox和p40phox基因的cDNA全長序列，通過軟件分析，發(fā)現(xiàn)預測的氨基酸序列具有Nox/Duox家族蛋白特征結(jié)構(gòu)域，即N端PX結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、PC基序和PB1結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域與NADPH氧化酶抗菌免疫功能相關(guān)[16]。對這些結(jié)構(gòu)域的分析，為我們下一步研究其免疫功能奠定基礎(chǔ)。而且這些結(jié)構(gòu)域與人、鼠、野牛、海豚等哺乳動物對應的亞基蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)合位點基本上吻合，說明這些亞基在魚類中的功能與哺乳動物對應的亞基相似，但有待進一步試驗證實。氨基酸序列比對分析表明所克隆得到草魚的p47phox和p40phox基因與其他物種具有較高的同源性，這說明NADPH這兩個亞基在進化上相當保守，同時也表明物種分類關(guān)系與進化地位相匹配。

Nox/Duox家族蛋白結(jié)構(gòu)特征中的PX結(jié)構(gòu)域是維持其激活功能的關(guān)鍵位點，如Arg57、Arg58、Tyr59、Arg105[16-17]在草魚中也存在，這幾個關(guān)鍵位點如果缺失或突變，NADPH氧化酶將無法發(fā)揮抗菌免疫調(diào)節(jié)功能[17]。人類的p40phox與p47phox亞基的PX結(jié)構(gòu)域能選擇性識別PtdInsP3和PtdInsP2，然后被磷酸化，并被激活，組裝，活化后的p40phox與p47phox由細胞質(zhì)被轉(zhuǎn)運到細胞膜上，相互作用后進而裝配成有活性的NADPH氧化酶多酶復合體，發(fā)揮催化功能，促使ROS產(chǎn)生[17-18]。人類的p40phox的SH3結(jié)構(gòu)域能與磷酸化后的p47phox C端的PRR結(jié)構(gòu)域相互作用，PC基序也能與p67phox相互作用，然后3個催化亞基p40phox 、p47phox 與p67phox 相互作用并以1∶1∶1比例結(jié)合在細胞膜上形成復合體，發(fā)揮NADPH氧化酶的催化功能，促使ROS的產(chǎn)生[6]。草魚p40phox與p47phox具有類似于人的PX和SH3結(jié)構(gòu)域。由此推斷草魚與人的NADPH氧化酶亞基都擁有相似的活化機制。

胡寶慶等[13]通過半定量PCR分析了翹嘴鱖p47phox和p40phox在各種組織中的分布表達情況，這與我們在草魚中所得到結(jié)果有所不同。一方面可能是所用方法不同，Real-time RCR相對更靈敏、準確、可靠。另一方面可能是p47phox和p40phox調(diào)節(jié)亞基mRNA在不同物種中組成型表達情況有所不同。因為不同物種在不同生長階段如幼魚或成魚階段，p47phox和p40phox基因在不同組織中分化不同，豐度不同，因此表達量不同。在本研究中，所采用的是200 g左右的魚，而胡寶慶等[13]是用400 g左右成魚，因此p47phox和p40phox表達量存在差異。其次魚體在不同飼養(yǎng)環(huán)境中如水質(zhì)或溫度中，魚類為維持自身的免疫穩(wěn)態(tài)，各組織發(fā)揮的免疫功能不同因而表達量有所差異。然而，本研究與鯽、紅鰭東方鲀的表達模式基本相吻合[18]?？赡苁且驗轸~類的胸腺、頭腎這兩個重要的免疫組織含有豐富的吞噬細胞，同樣作為造血組織的心臟也可能NADPH氧化酶表達量高[19]。皮膚、腸作為魚類主要的黏膜相關(guān)淋巴組織，也含有較為豐富的吞噬細胞[20-21]。這些吞噬細胞都能夠產(chǎn)生NADPH氧化酶，從而促進呼吸爆發(fā)[22-23]，而發(fā)揮抗菌免疫作用。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)p47phox和p40phox在各組織中分布表達略有差異，但是差異不顯著，這可能是機體的免疫狀態(tài)和各亞基基因的轉(zhuǎn)錄時間差異造成的。

本研究證明所克隆獲得的草魚p47phox和p40phox與團頭魴、鯉、斑馬魚p47phox和p40phox基因具有較高的同源性，分析了草魚p47phox和p40phox基因在各個組織器官中的表達分布情況。以期能夠為揭示p47phox和p40phox在抗菌免疫反應及對免疫相關(guān)基因的調(diào)控作用奠定研究基礎(chǔ)。

[1]Babior B M.NADPH oxidase：an update[J].Blood，1999，93(5)：1464-1476.

[2]Chen L Y，Wu Y Q，Zhang Z H.NADPH oxidation-reduction reaction platform and its regulatory role in Ang II-mediated ROS signaling pathway[J].Prog Physiol，2012，43(6)：439-444.

[3]Leto T L，Lomax K J，Volpp B D，et al.Cloning of a 67-kD neutrophil oxidase factor with similarity to a noncatalytic region of p60c-src[J].Science，2009，248(4956)：727-730.

[4]Tsunawaki S，Kagara S，Yoshikawa K，et al.Involvement of p40phox in activation of phagocyte NADPH oxidase through association of its carboxyl-terminal，but not its amino-terminal，with p67phox[J].J Exp Med，1996，184(3)：893-902.

[5]Tsunawaki S，Mizunari H，Nagata M，et al.A novel cytosolic component，p40 phox，of respiratory burst oxidase associates with p67 phox and is absent in patients with chronic granulomatous disease who lack p67 phox[J].Biochem Biophys Res Commun，1994，199(3)：1378-1387.

[6]Nauseef W M.Assembly of the phagocyte NADPH oxidase[J].Histochem Cell Biol，2004，122(4)：277-291.

[7]Wientjes F B，Hsuan J J，Totty N F，et al.p40phox，a third cytosolic component of the activation complex of the NADPH oxidase to contain src homology 3 domains[J].Biochem J，1993，296(Pt3)：557-561.

[8]Mizuki K，Kadomatsu K，Hata K，et al.Functional modules and expression of mouse p40phox and p67phox，SH3-domain-containing proteins involved in the phagocyte NADPH oxidase complex[J].Eur J Biochem，1998，251(3)：573-582.

[9]Gauss K A，Bunger P L，Siemsen D W，et al.Molecular analysis of the bison phagocyte NADPH oxidase：Cloning and sequencing of five NADPH oxidase cDNAs[J].Comp Biochem Physiol B：Biochem Mol Biol，2002，133(1)：1-12.

[10]Inoue Y，Itou T，Jimbo T，et al.Molecular cloning and identification of bottle-nosed dolphin p40(phox)，p47(phox)and p67(phox)[J].Vet Immunol Immunopathol，2001，78(1)：21-33.

[11]Inoue Y，Suenaga Y，Yoshiura Y，et al.Molecular cloning and sequencing of Japanese pufferfish(Takifugurubripes)NADPH oxidase cDNAs[J].Dev Comp Immunol，2004，28(9)：911-925.

[12]Mayumi M，Takeda Y，Hoshiko M，et al.Characterization of teleost phagocyte NADPH oxidase：molecular cloning and expression analysis of carp(Cyprinuscarpio)phagocyte NADPH oxidase[J].Mol Immunol，2008，45(6)：1720-1731.

[13]胡寶慶,劉 毅,文春根.翹嘴鱖NADPH氧化酶三個調(diào)節(jié)亞基cDNA 的克隆及表達特征[J].動物學研究,2010,31(3):250-260.

[14]Overbergh L，Giulietti A，Valckx D，et al.The use of real-time reverse transcriptase PCR for the quantification of cytokine gene expression[J].J Biomol Tech，2003，14(1)：33-43.

[15]Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-DeltaDelta C(T))method[J].Methods，2001，25：402-408.

[16]Brown D I，Griendling K K.Nox proteins in signal transduction[J].Free Radic Biol Med，2009，47(9)：1239-1253.

[17]Karathanassis D，Stahelin R V，Bravo J，et al.Binding of the PX domain of p47(phox)to phosphatidylinositolC.idellus3,4-bisphosphate and phosphatidic acid is masked by an intramolecular interaction[J].EMBO J，2002，21(19)：5057-5068.

[18]Mayumi M，Takeda Y，Hoshiko M，et al.Characterization of teleost phagocyte NADPH oxidase：molecular cloning and expression analysis of carp (Cyprinus carpio)phagocyte NADPH oxidase[J].Mol Immunol，2008，45(6)：1720-1731.

[19]Ellis A E，Munroe A L S.Defence mechanismsin fish.1.A study of the phagocytic system and the fate of intraperitoneally injected particulate material in the plaice (PleuronectesplatessaL.)[J].J Fish Biol，1976，(8)：67-78.

[20]McMillan D N，Secombes C J.Iso1ation of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)intestinal intraepithelial lymphocytes(IEL)and measurement of their cytotoxic activity[J].Fish Shellfish Immunol，1997，(7)：527-541.

[21]Lin S H，Davidson G A，Secombes C J.Morphological study of cells isolated from the perfused gill of dab and Atlantic salmon[J].J Fish Biol，1998，53：560-568.

[22]Lin S H，Ellis A E，Davidson G A，et al.Migratory，respiratory burst and mitogenic responses of leucocytes isolated from the gills of rainbow trout(Oncorhynchusmykiss)[J].Fish Shellfish Immunol，1999，(9)：211-226.

[23]Clerton P，Troutaud D，Deschaux P.The chemiluminescence response of leucocytes isolated from the gut of rainbow trout(Oncorhynchusmykiss)[J].Fish Shellfish Immunol，1998，(8)：73-76.