基于DNA條形碼技術(shù)的永暑礁瀉湖魚(yú)卵鑒定研究

吳 娜，張 楠，曹 明，郭華陽(yáng)，朱克誠(chéng)，楊靜文，江世貴，張殿昌

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；3.廣東省漁業(yè)種質(zhì)保護(hù)中心，廣州 510300)

魚(yú)卵和仔稚魚(yú)是魚(yú)類(lèi)生活史的早期階段，魚(yú)卵和仔稚魚(yú)調(diào)查是研究魚(yú)類(lèi)繁殖習(xí)性、生殖洄游路線、產(chǎn)卵場(chǎng)、種類(lèi)分布和種群動(dòng)態(tài)的基礎(chǔ)，也可為魚(yú)類(lèi)人工繁育技術(shù)和生理生化機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[1]。魚(yú)卵和仔稚魚(yú)種類(lèi)的準(zhǔn)確鑒別，是開(kāi)展魚(yú)卵和仔稚魚(yú)研究的重要前提。通常，魚(yú)卵鑒別主要依據(jù)卵的形狀、大小、卵周隙、油球、內(nèi)膜、絨毛膜、卵黃形態(tài)和胚胎形狀等形態(tài)特征[2]，然而近緣物種的魚(yú)卵由于形態(tài)相似很難區(qū)分，大多種類(lèi)只能鑒定到科或?qū)俚乃?，目前只有極少種類(lèi)魚(yú)卵鑒定到種的水平，尋求穩(wěn)定、準(zhǔn)確的分類(lèi)依據(jù)和鑒定方法，是魚(yú)類(lèi)浮游生物研究亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。DNA條形碼(DNA barcoding)技術(shù)是一種利用標(biāo)準(zhǔn)基因區(qū)域序列多態(tài)性進(jìn)行物種鑒定的分子方法，條形碼序列分析不依賴(lài)于形態(tài)特征，對(duì)形態(tài)特征近似，形態(tài)學(xué)分類(lèi)比較困難的疑難種類(lèi)的分類(lèi)以及形態(tài)學(xué)分類(lèi)上存有疑問(wèn)種類(lèi)的驗(yàn)證提供了新的方法和手段[3-4]。魚(yú)類(lèi)線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(mtCOI)基因具有序列變異水平適中，變異區(qū)域兩端序列高度保守和序列長(zhǎng)度適宜的特點(diǎn)，是被廣泛接受的魚(yú)類(lèi)DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因[5-7]，目前魚(yú)類(lèi)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)(Barcode of Life Data System [BOLD])中已有超過(guò)17.5萬(wàn)件憑證標(biāo)本，代表了1.5萬(wàn)種以上的魚(yú)類(lèi)種類(lèi)[8]。隨著魚(yú)類(lèi)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，研究證實(shí)DNA條形碼技術(shù)在魚(yú)卵和仔稚魚(yú)的種類(lèi)鑒定中也具有重要的應(yīng)用價(jià)值[9-11]。

南沙群島位于南海南部，屬于印度洋-太平洋熱帶動(dòng)物區(qū)系，是世界上海洋生物最豐富的區(qū)域之一。根據(jù)已有的調(diào)查資料顯示南海魚(yú)類(lèi)有3 000多種，分別隸屬于3個(gè)綱、35個(gè)目、236個(gè)科和822屬[12]。目前南海魚(yú)類(lèi)中只對(duì)極少數(shù)種類(lèi)的魚(yú)卵和仔稚魚(yú)進(jìn)行過(guò)研究[4，13-14]，絕大多數(shù)種類(lèi)的魚(yú)卵和仔稚魚(yú)的形態(tài)特征并不清楚，使得南海重要經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)卵行為、產(chǎn)卵場(chǎng)判別和種群補(bǔ)充機(jī)制研究無(wú)法開(kāi)展。永暑礁是一座珊瑚環(huán)礁，為珊瑚礁魚(yú)類(lèi)和熱帶大洋性魚(yú)類(lèi)的重要產(chǎn)卵場(chǎng)，然而目前未見(jiàn)有關(guān)永暑礁海域魚(yú)卵鑒定和分類(lèi)的相關(guān)研究。因此，本研究擬以永暑礁瀉湖魚(yú)卵為研究對(duì)象，采用形態(tài)分類(lèi)特征和DNA條形碼技術(shù)對(duì)采集的魚(yú)類(lèi)進(jìn)行鑒定分析，以期了解珊瑚礁魚(yú)類(lèi)和熱帶大洋性魚(yú)類(lèi)的產(chǎn)卵季節(jié)和種類(lèi)分布特征，為相關(guān)種類(lèi)的種群補(bǔ)充機(jī)制研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和形態(tài)特征分析

依托中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所“南鋒號(hào)”科學(xué)調(diào)查船，于2016年4月13號(hào)在中國(guó)南海永暑礁瀉湖海域按照《海洋調(diào)查規(guī)范》(GB12763.1-7-91)進(jìn)行魚(yú)卵樣品采集。采用孔徑為0.505 mm篩絹制成的大型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)口內(nèi)徑80 cm、長(zhǎng)270 cm、網(wǎng)口面積為0.5 m2)按照設(shè)定站位進(jìn)行表層水平和垂直拖網(wǎng)，采集魚(yú)卵樣品，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩２杉臉悠愤\(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，于解剖鏡下進(jìn)行形態(tài)特征觀察和顯微拍照，觀察記錄魚(yú)卵的卵膜(Chorion)、圍囊腔(Perivitelline space)、卵黃(Yolk)、油球(Oil globule)、色素分布(Pigmentation)和胚體發(fā)育(Embryo)等形態(tài)特征和魚(yú)卵卵徑參數(shù)，并對(duì)魚(yú)卵形態(tài)特征進(jìn)行了描述分析(表1)。

1.2 DNA提取和COI基因測(cè)序分析

魚(yú)卵樣品用雙蒸水沖洗，將樣品置于1.5 mL離心管中，采用Magen公司的試劑盒(HiPure Mollusc DNA Kit)提取基因組DNA，提取的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。引物設(shè)計(jì)參照Ward等[15],由廣州睿博生物公司合成，序列擴(kuò)增引物為Fish-F：5′-TCRACYAAYCAYAAAGAYATYGGCAC-3′和Fish-R：5′-ACTTCWGGGTGRCCRAAGAATCA-3′。PCR擴(kuò)增總體積為25 μL，反應(yīng)體系包括RNase-Free Water (16.7 μL)，10×loading buffer (Mg2+free)2.5 μL，DNTP(2.5 mmol/L)2 μL，MgCl2(2.5 μmol/L)1.5 μL，F(xiàn)ish-F(10 μmol/L)0.5 μL，F(xiàn)ish-R(10 μmol/L)0.5 μL，rTaq (5 U/μL)0.3 μL及DNA模板(20 ng/μg)1.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖膠電泳檢測(cè)，選取擴(kuò)增結(jié)果較好的產(chǎn)物送廣州睿博興科股份有限公司測(cè)序分析。

由于魚(yú)卵樣品在提取DNA、PCR擴(kuò)增及測(cè)序的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，都有可能會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不佳的情況，因此本研究以最終獲得的有效的序列個(gè)體來(lái)進(jìn)行分析。

1.3 分子鑒定分析

測(cè)序獲得的魚(yú)卵COI基因序列與BOLD系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.barcodinglife.org)比對(duì)分析進(jìn)行物種鑒定，在比對(duì)分析中，BOLD系統(tǒng)為每個(gè)樣品分配一個(gè)條形碼索引號(hào)(Barcode Index Number，BIN)，當(dāng)樣品COI基因序列與BIN中參考序列的相似性≥98.4%時(shí)，鑒定為種，當(dāng)相似性在95%～ 98.3%之間，鑒定到屬，當(dāng)相似性<95%時(shí)，為未知種[2，16]。利用MEGA6.0軟件根據(jù)配對(duì)遺傳距離采用Kimura two-parameter model (K2P)構(gòu)建鄰接進(jìn)化樹(shù)(Neighbor-joining tree)[17]，進(jìn)化樹(shù)末端節(jié)點(diǎn)代表了種類(lèi)分組。

2 結(jié)果和分析

2.1 魚(yú)卵種類(lèi)鑒定分析

采集的71個(gè)魚(yú)卵樣品根據(jù)外部形態(tài)特征初步劃分為圓形和橢圓形2種類(lèi)型，圓形魚(yú)卵44個(gè)，橢圓形魚(yú)卵27個(gè)。經(jīng)DNA提取和線粒體COI基因片段測(cè)序分析，71個(gè)魚(yú)卵樣品中的30個(gè)個(gè)體獲得了有效的線粒體COI序列信息，測(cè)序成功率為42.3%。44個(gè)圓形魚(yú)卵中有27個(gè)測(cè)序成功，測(cè)序成功率達(dá)61.4%；27個(gè)橢圓形魚(yú)卵中有3個(gè)測(cè)序成果，測(cè)序成功率僅為11.1%。30個(gè)魚(yú)卵線粒體COI序列分別于BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，結(jié)果顯示與BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)中參考序列相似性在99.6～100%之間，30個(gè)魚(yú)卵均能鑒定到種的水平，分屬于1個(gè)目，7個(gè)科，13個(gè)種(表1，表2)。刺尾魚(yú)科(Acanthuridae)有5個(gè)種，分別為白面刺尾魚(yú)(Acanthurusnigricans)、扁體櫛齒刺尾魚(yú)(Ctenochaetusstrigosus)、雙斑櫛齒刺尾魚(yú)(C.binotatus)、白尾櫛齒刺尾魚(yú)(C.flavicauda)和黑背鼻魚(yú)(Nasolituratus)，共有19個(gè)魚(yú)卵，占鑒定魚(yú)卵總數(shù)的63.3%。鸚哥魚(yú)科(Scaridae)有2個(gè)種，分別為史氏鸚哥魚(yú)(Scarusschlegeli)和斑點(diǎn)鯨鸚哥魚(yú)(Cetoscarusocellatus)。隆頭魚(yú)科(Labridae)有2個(gè)種，分別為單帶尖唇魚(yú)(Oxycheilinusunifasciatus)和雙線尖唇魚(yú)(O.digramma)。鲹科(Carangidae)有1個(gè)種為藍(lán)圓鲹(Decapterusmaruadsi)；籃子魚(yú)科(Siganidae)有1個(gè)種為銀籃子魚(yú)(Siganusargenteus)；笛鯛科(Lutjanidae)有1個(gè)種為欖色細(xì)齒笛鯛(Aphareusfurca)；鰈魚(yú)科(Zanclidae)有1種為鐮魚(yú)(Zancluscornutus)。雙斑櫛齒刺尾魚(yú)有10個(gè)魚(yú)卵，白尾櫛齒刺尾魚(yú)有4個(gè)魚(yú)卵，這兩個(gè)種為該海域的優(yōu)勢(shì)種類(lèi)，其余各種類(lèi)均為1～2個(gè)魚(yú)卵。

表1 13種魚(yú)卵的形態(tài)特征Tab.1 Morphological features of 13 species of fish eggs

續(xù)表1

表2 南海永暑礁海域魚(yú)卵mtCOI序列比對(duì)結(jié)果Tab.2 Sequences comparison results of mtCOI in fish eggs from Yongshu reef lagoon of South China Sea

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

獲得的30個(gè)魚(yú)卵的線粒體COI序列長(zhǎng)度在463～662 bp之間，序列中沒(méi)有插入/缺失位點(diǎn)和終止密碼子。根據(jù)線粒體COI序列計(jì)算種內(nèi)的K2P遺傳距離為0～0.002，同一個(gè)屬種間的遺傳距離為0.004～0.132，而同一個(gè)科不同屬間的遺傳距離為0.117～0.185。根據(jù)K2P模型利用遺傳距離構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，相同的種類(lèi)聚為一個(gè)分支；刺尾魚(yú)科中的刺尾魚(yú)屬和櫛齒刺尾魚(yú)屬聚為一支，而與同一科的鼻魚(yú)屬未形成單系支(圖1)。

圖1 根據(jù)K2P模型利用遺傳距離構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Neighbor-joining tree constructed based on K2P model

2.3 魚(yú)卵形態(tài)特征分析

根據(jù)魚(yú)卵的形狀、卵膜、圍囊腔、卵黃、油球、色素分布和胚胎發(fā)育情況等形態(tài)性狀，詳細(xì)描述了該研究鑒定的13種魚(yú)類(lèi)的魚(yú)卵形態(tài)特征(表1)。史氏鸚哥魚(yú)和藍(lán)圓鲹的魚(yú)卵均為橢圓形，卵膜光滑，無(wú)色透明，圍囊腔較寬，但是史氏鸚哥魚(yú)卵徑較大，卵黃均勻分布，而藍(lán)圓鲹的卵黃位于魚(yú)卵的一端，并且體積較小。其余11種魚(yú)類(lèi)的魚(yú)卵均為圓形，魚(yú)卵直徑在1.34～1.99 mm之間，黑背鼻魚(yú)的魚(yú)卵直徑最小，鐮魚(yú)的魚(yú)卵直徑最大。已有的研究表明海水魚(yú)卵直徑在0.5～5.5 mm之間[18]，該研究所獲得的永暑礁海域魚(yú)卵直徑也處于該范圍，但是比尤卡坦半島(Yucatan Penisula)海域魚(yú)卵直徑大[2]，可能是由于其將魚(yú)卵保存于酒精中導(dǎo)致魚(yú)卵縮水造成的，而該研究是將魚(yú)卵樣品直接冷凍保存。

3 討論

近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈和填海造島等人類(lèi)活動(dòng)干擾，漁業(yè)生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致漁業(yè)資源顯著減少[19]。對(duì)魚(yú)卵進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別是了解魚(yú)類(lèi)繁殖習(xí)性、生活史和種群動(dòng)態(tài)的基礎(chǔ)，可用于鑒別魚(yú)卵的形態(tài)特征較少，傳統(tǒng)的分類(lèi)手段很難準(zhǔn)確鑒別到種的水平。永暑礁為典型的珊瑚環(huán)礁，是熱帶珊瑚礁魚(yú)類(lèi)的重要棲息地和產(chǎn)卵場(chǎng)，目前未見(jiàn)有關(guān)永暑礁魚(yú)卵分類(lèi)鑒別的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。DNA條形碼技術(shù)的迅速發(fā)展，為從分子水平準(zhǔn)確鑒定魚(yú)卵提供了有效的手段[10,20]。從魚(yú)卵中提取高質(zhì)量的DNA用于PCR擴(kuò)增，是利用DNA條形碼鑒別魚(yú)卵的前提條件，該研究分析的71個(gè)冷凍保存的魚(yú)卵中30個(gè)成功擴(kuò)增測(cè)序獲得了有效的線粒體COI序列信息，成功率為42.3%。部分魚(yú)卵未能成功獲得COI序列，可能由于魚(yú)卵樣品為冰凍保存，樣品在凍融過(guò)程中降解，導(dǎo)致無(wú)法提取其基因組DNA，或者由于魚(yú)卵樣品體積較小，在DNA提取過(guò)程中操作不當(dāng)導(dǎo)致樣品損失，因此，魚(yú)卵樣品保存和基因組DNA的提取需要進(jìn)一步的優(yōu)化，提高魚(yú)卵鑒定的檢出率。有趣的是圓形魚(yú)卵的擴(kuò)增測(cè)序成功率(61.4%)顯著高于橢圓形魚(yú)卵的擴(kuò)增測(cè)序成功率(11.1%)，其中原因有待于進(jìn)一步研究。酒精保存魚(yú)卵容易導(dǎo)致魚(yú)卵脫水，致使魚(yú)卵縮小變形，但是酒精保存不需要特殊的設(shè)備，容易操作，也是目前魚(yú)卵采集過(guò)程中的主要保存方式之一，Leyva等[2]研究表明酒精保存的魚(yú)卵DNA條形碼測(cè)序成功率為46.3%，Burghart等[9]的研究表明50%的異丙醇保存魚(yú)卵也不影響樣品用于DNA條形碼分析。由此可見(jiàn)目前魚(yú)卵的擴(kuò)增成功率并不高，如何開(kāi)發(fā)高效的魚(yú)卵保存和擴(kuò)增方法是有待進(jìn)一步研究的問(wèn)題。

近年來(lái)有關(guān)魚(yú)類(lèi)DNA條形碼參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建得到了快速發(fā)展，Díaz等[21]采集分析了79種魚(yú)類(lèi)樣品，測(cè)序分析了其DNA條形碼序列，構(gòu)建了美洲Lower Paraná河魚(yú)類(lèi)DNA條形碼參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)；Chang等[22]采集分析了1 245種魚(yú)類(lèi)憑證標(biāo)本及其DNA條形碼序列，構(gòu)建了臺(tái)灣海峽魚(yú)類(lèi)DNA條形碼參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)；Weight等[23]采集分析了521種魚(yú)類(lèi)樣品及其DNA條形碼序列，構(gòu)建了加勒比海魚(yú)類(lèi)DNA條形碼參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)；中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院依托國(guó)家科技基礎(chǔ)工作專(zhuān)項(xiàng)采集分析了763種南海魚(yú)類(lèi)憑證標(biāo)本及其DNA條形碼序列，構(gòu)建了較為完備的南海珊瑚魚(yú)類(lèi)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，這些序列均已錄入到BOLD條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)中，這些條形碼序列數(shù)據(jù)庫(kù)的建立為基于DNA條形碼技術(shù)開(kāi)展魚(yú)卵和仔稚魚(yú)鑒定奠定了基礎(chǔ)。北大西洋大陸架海域93.26%的魚(yú)卵DNA條形碼序列能夠與BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列相匹配[8]，在加勒比海珊瑚礁海域僅有85.7%的魚(yú)卵DNA條形碼序列能夠與BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列相匹配[2]，該研究中100%的魚(yú)卵DNA條形碼序列能夠與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列相匹配。這些研究結(jié)果表明DNA條形碼參考數(shù)據(jù)庫(kù)的完整性直接影響到魚(yú)卵鑒定的效率。

由于線粒體COI基因存在同義突變偏好性，不同種屬間的突變率存在顯著差異[24]，致使種內(nèi)或種、屬間的線粒體COI序列多態(tài)性存在顯著差異，這種差異稱(chēng)為條形碼間隙(Barcode gap)[25]，DNA條形碼間隙的存在是利用條形碼進(jìn)行物種鑒定的前提，已有的關(guān)于魚(yú)類(lèi)DNA條形碼研究證實(shí)魚(yú)類(lèi)種內(nèi)或種、屬間存在顯著的條形碼間隙[22,26]。該研究表明永暑礁同種魚(yú)類(lèi)間的K2P遺傳距離為0～0.002，同一個(gè)屬不同種間的遺傳距離為0.004～0.132，屬間的遺傳距離為0.117～0.185，存在著明顯的DNA條形碼間隙，分析的所有種類(lèi)在NJ進(jìn)化樹(shù)中均能形成單系支，證實(shí)了DNA條形碼技術(shù)適用于南海珊瑚礁魚(yú)類(lèi)魚(yú)卵和仔稚魚(yú)鑒定。該研究中南沙珊瑚礁魚(yú)類(lèi)種內(nèi)遺傳距離最高僅為0.002，顯著低于墨西哥尤卡坦半島魚(yú)類(lèi)種內(nèi)遺傳距離(0.006)[2]和臺(tái)灣海峽魚(yú)類(lèi)種內(nèi)遺傳距離(0.151)[21]，可能與該研究中每個(gè)種類(lèi)使用魚(yú)卵的數(shù)量較少有關(guān)，下一步應(yīng)加大魚(yú)卵采集和分析的數(shù)量，以便更準(zhǔn)確反映種內(nèi)和種屬間的遺傳關(guān)系。

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