低氧脅迫對(duì)鰱心肌細(xì)胞凋亡及其調(diào)控基因Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

丁晨雨，胡利雙，李 云，薛 洋，李 虹，吳榮華，劉恩秀，李曉潔

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶三峽生態(tài)漁業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，重慶 400715；2.西南大學(xué)淡水魚(yú)類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715；3.重慶市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，重慶 400200)

鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要種類之一，總產(chǎn)量居第二位，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外，鰱在水生生物資源養(yǎng)護(hù)、修復(fù)水域生態(tài)和促進(jìn)漁業(yè)增效增收等方面也發(fā)揮重要作用[1-2]。但是，鰱性活躍、急躁，受到刺激后應(yīng)激強(qiáng)烈，耐低氧能力差，養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中容易發(fā)生泛塘，高密度運(yùn)輸過(guò)程中也容易發(fā)生低氧應(yīng)激、死亡等現(xiàn)象，容易造成經(jīng)濟(jì)損失。了解低氧脅迫下鰱組織或器官的損傷情況及低氧情況下導(dǎo)致鰱死亡的原因可以為鰱抗低氧育種、養(yǎng)殖、運(yùn)輸?shù)燃夹g(shù)的研發(fā)提供指導(dǎo)。

細(xì)胞凋亡，又被稱為細(xì)胞程序性死亡，受特定基因調(diào)控，是機(jī)體組織為維持適宜的細(xì)胞數(shù)量而主動(dòng)自殺的一種死亡方式，在機(jī)體正常發(fā)育、穩(wěn)態(tài)的維持等過(guò)程發(fā)揮著重要作用。除此之外，凋亡還發(fā)生在許多外界因素誘導(dǎo)的生理和病理過(guò)程中：如免疫耐受、腫瘤監(jiān)控、應(yīng)激反應(yīng)等[3]。有研究表明，低氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，nmol水平的活性氧可促進(jìn)細(xì)胞增生，μmol水平的活性氧會(huì)引起細(xì)胞凋亡，mmol水平的活性氧直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。嚴(yán)重低氧脅迫下，氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要是由死亡受體通路、線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路三個(gè)互相聯(lián)系的凋亡途徑共同作用發(fā)生，NF-κB通路、p53通路等凋亡路徑可能也參與調(diào)控[5-7]。魚(yú)類機(jī)體組織或器官由高度分化的細(xì)胞組成，正常生理?xiàng)l件下，凋亡細(xì)胞數(shù)目較少，組織或器官的功能完整度高，一旦凋亡過(guò)度，必將影響其功能。目前，有研究表明低氧脅迫會(huì)誘導(dǎo)鰱腦細(xì)胞、肝細(xì)胞凋亡，團(tuán)頭魴心臟組織結(jié)構(gòu)變化及線粒體損傷，但是缺氧條件下鰱的心肌細(xì)胞損傷狀況還未見(jiàn)報(bào)告，是否引起心肌細(xì)胞凋亡及凋亡機(jī)制也需要了解[8-10]。為此，采用密閉魚(yú)缸自發(fā)耗氧的方法模擬缺氧環(huán)境，首先通過(guò)檢測(cè)不同低氧條件下鰱血清肌酸激酶(Creatine kinase，CK)的活力判定心肌損傷情況，然后通過(guò)TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡情況，進(jìn)一步用qPCR檢測(cè)凋亡調(diào)控基因Bax、Bcl-2在心臟組織中表達(dá)量的變化，為缺氧誘導(dǎo)的鰱心肌損傷和鰱養(yǎng)殖、運(yùn)輸、抗低氧育種等研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用鰱購(gòu)于重慶市沙坪壩區(qū)雙連水庫(kù)，體長(zhǎng)為(23.1±0.8)cm，體重為(212.3±17.2)g。經(jīng)15 d暫養(yǎng)適應(yīng)后挑選外觀健康，活力正常，規(guī)格一致的鰱用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先將實(shí)驗(yàn)魚(yú)在實(shí)驗(yàn)魚(yú)缸中適應(yīng)24 h，氣泵通氣維持氧濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以曝氣并通空氣的自來(lái)水為實(shí)驗(yàn)用水，將暫養(yǎng)后的鰱隨機(jī)分為3組，常氧對(duì)照組(Normoxia group，NO)、兩個(gè)低氧脅迫實(shí)驗(yàn)組，分別放入120 L的圓形魚(yú)缸中，每組設(shè)3個(gè)平行，每缸放入16尾，總計(jì)9缸144尾。實(shí)驗(yàn)水溫控制在(23.0±1.0)℃，實(shí)驗(yàn)組用保鮮膜和塑料蓋密封，NO組持續(xù)通空氣。兩組實(shí)驗(yàn)組，其中一組為浮頭實(shí)驗(yàn)組(Hypoxia group，HO)，至實(shí)驗(yàn)魚(yú)全部浮頭時(shí)采樣，為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后約4 h，DO值為(1.19±0.17)mg/L。另一組為死亡實(shí)驗(yàn)組(Asphyxia group，AO)，到實(shí)驗(yàn)魚(yú)半數(shù)死亡時(shí)采樣，為實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后約12 h，DO值為(0.38±0.13)mg/L。取樣前用150 mg/L的MS-222麻醉實(shí)驗(yàn)魚(yú)以降低應(yīng)激反應(yīng)。

1.3 樣品采集與制備

各組隨機(jī)取15尾活魚(yú)測(cè)量體長(zhǎng)、體重，然后用一次性滅菌注射器從尾靜脈取血，室溫靜置2 h，待其凝固后3 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液制備血清。取血后迅速進(jìn)行解剖取樣，取其心臟稱重，每組取5尾魚(yú)的心臟用4%多聚甲醛溶液固定用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，其余的用液氮研磨，然后用滅菌錫箔紙包裹液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱以備檢測(cè)凋亡基因表達(dá)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

血清CK活力采用日立7020全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，檢測(cè)程序按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的肌酸激酶(CK)測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置。

心肌細(xì)胞凋亡用TUNEL染色法[11]對(duì)心肌細(xì)胞切片進(jìn)行處理，用Leica DM6000B全自動(dòng)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察照相，隨機(jī)選取視野對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)。

凋亡調(diào)控基因Bax、Bcl-2的表達(dá)變化采用熒光定量PCR檢測(cè)。首先，用總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取凍存的心臟組織總RNA，然后按照Fast Quant RT Kit(with gDNase)(天根生化科技有限公司)操作說(shuō)明合成cDNA，并根據(jù)基因Bax、Bcl-2的序列用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物熒光定量PCR所用引物，Bax-F1：5′-CTCTGCTCTTCAACCGACTC-3′，Bax-R1：5′-CGGCACGCAAAGTAGAAA-3′，退火溫度55 ℃；Bcl-2-F1：5′-GCGCAACGCAGCTTCTTA-3′，Bcl-2-R1：5′-GGCATCCCAACCTCCATT-3′，退火溫度59 ℃。熒光定量PCR采用三步法在BIO-RAD CFX ConnectTMOptics Module熒光定量PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR反應(yīng)體系Tab.1 Reaction system for qPCR

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，引物退火溫度退火20 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸32 s。內(nèi)參引物為1α-F：5′-TGGGTCGTCCTTGCTGTCT-3′，1α-R：5′-CCCTGCCAACATTACCACTG-3′，做標(biāo)準(zhǔn)曲線分析凋亡調(diào)控基因Bax、Bcl-2的表達(dá)變化。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 2013和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)法分析，用LSD和Dunnett’s T3進(jìn)行組間差異比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氧脅迫下鰱血清CK活力升高

從表2的結(jié)果可以得出，經(jīng)過(guò)不同程度的低氧脅迫后，鰱血清中CK活力隨著氧濃的降低而升高，且低氧脅迫下的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組與NO組比較差異顯著(P<0.05)，表明鰱心肌細(xì)胞可能產(chǎn)生了損傷。但從HO組處理至AO組時(shí)，血清CK活力略有升高，兩組間差異不顯著。

表2 低氧脅迫下鰱血清CK活力變化Tab.2 Changes of serum CK activities in H.molitrix under hypoxia stress

注：肩注中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 低氧脅迫顯著增加鰱心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目

TUNEL法組織學(xué)觀察結(jié)果如圖1所示，與NO組相比，隨著氧濃度的降低，實(shí)驗(yàn)組鰱心肌組織中正常細(xì)胞數(shù)目減少，凋亡細(xì)胞數(shù)目增加，表明低氧脅迫加劇了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。NO組的鰱心肌正常細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)大于凋亡細(xì)胞數(shù)目，HO組正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目較為接近，AO組則是正常細(xì)胞遠(yuǎn)小于凋亡細(xì)胞數(shù)目。對(duì)凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)后的結(jié)果表明：NO組細(xì)胞凋亡指數(shù)為7.69±2.96，HO組細(xì)胞凋亡指數(shù)為47.94±1.87，AO組細(xì)胞凋亡指數(shù)為85.39±2.61，三組間差異極顯著(P<0.01)。

圖1 TUNEL法檢測(cè)低氧脅迫下鰱心肌細(xì)胞凋亡的結(jié)果Fig.1 The results of cardiomyocyte apoptosis detected by TUNEL under hypoxia stress in H.molitrix長(zhǎng)箭頭所指為正常細(xì)胞(藍(lán)色細(xì)胞核)，短箭頭所指為凋亡細(xì)胞(棕褐色細(xì)胞核)；放大倍數(shù)為400x。

2.3 低氧脅迫升高Bax表達(dá)、降低Bcl-2表達(dá)

2.3.1 心肌細(xì)胞總RNA質(zhì)量檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)所提取的心肌總RNA的OD260 nm/OD280 nm值在1.9 ～ 2.1之間，表明純度較好。1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，可以看到表示28 S、18 S、5 S的三條亮帶，且28 S亮帶亮度比18 S亮，表明RNA完整性較高。

圖2 鰱心肌總RNA電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of total RNA of cardiomyocyte in H.molitrix

2.3.2 心肌中基因Bax、Bcl-2的表達(dá)變化

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法研究了常氧和不同低氧脅迫下鰱心肌凋亡調(diào)控基因Bax、Bcl-2的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。與NO組相比，低氧脅迫后的HO組和AO組Bax基因表達(dá)量增加，AO組表達(dá)水平顯著高于NO組和HO組(P<0.05)，表明低氧脅迫激活了促凋亡基因使其表達(dá)量上升；Bcl-2的表達(dá)量逐漸下降，各組間差異顯著(P<0.05)，表明了低氧脅迫抑制的抗凋亡基因的表達(dá)；Bcl-2/Bax隨著氧濃度的降低而下降，組間差異顯著(P<0.05)，表明氧濃度越低鰱心肌細(xì)胞凋亡趨勢(shì)越顯著。

圖3 低氧脅迫下鰱心臟細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)量的變化Fig.3 The mRNA expression changes of apoptosis related gene Bax and Bcl-2 under hypoxia stress in H.molitrix heart常氧對(duì)照組表示常氧對(duì)照組，浮頭實(shí)驗(yàn)組表示實(shí)驗(yàn)魚(yú)全部浮頭時(shí)期，死亡實(shí)驗(yàn)組表示半數(shù)實(shí)驗(yàn)魚(yú)死亡時(shí)期。不同小寫(xiě)字母表示低氧處理不同時(shí)期同一基因mRNA的差異顯著(P<0.05)。

3 討論

3.1 低氧脅迫對(duì)鰱血清CK活力的影響

溶解氧是影響魚(yú)類生存、代謝、生殖、生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子。鰱正常生長(zhǎng)發(fā)育的氧濃度為5.5 mg/L，當(dāng)溶解氧低于1.75 mg/L時(shí)，呼吸會(huì)受到抑制，表現(xiàn)出浮頭現(xiàn)象，當(dāng)溶解氧低于0.26 ～ 0.79 mg/L時(shí)，會(huì)導(dǎo)致魚(yú)窒息死亡[12]。CK廣泛存在于脊椎動(dòng)物心臟和肌肉組織中，在能量代謝過(guò)程中可以催化高能磷酸基在二磷酸腺苷(ADP)和磷酸肌酸之間可逆性轉(zhuǎn)移，對(duì)魚(yú)類的生存具有重要作用。由于細(xì)胞破裂或壞死后會(huì)進(jìn)入血液，血清CK也常被用來(lái)作為衡量心肌細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)[13]。魚(yú)類對(duì)氧濃度較為敏感，特別是鰱，在遭受低氧脅迫時(shí)，CK活力必然會(huì)受到影響。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，與NO組相比，鰱血清CK活力在HO組和AO組顯著升高，這與區(qū)又君等[14]對(duì)卵形鯧鲹的研究結(jié)果一致，表明低氧脅迫可能造成了鰱心肌損傷。魚(yú)類對(duì)不利環(huán)境有一定的適應(yīng)性，面對(duì)低氧脅迫也是如此，魚(yú)體抗氧化系統(tǒng)會(huì)根據(jù)環(huán)境調(diào)控自身的生理以維持生存[15]。低氧脅迫實(shí)驗(yàn)組中，HO組與AO組比較，血清CK活力差異不顯著，這可能是鰱對(duì)低氧脅迫環(huán)境具有一定的耐受性所致。但是，目前鰱的低氧耐受機(jī)制還不完全清楚。

3.2 低氧脅迫與細(xì)胞凋亡

經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的生物進(jìn)化后，鰱自身形成了一套精密的對(duì)抗低氧脅迫的機(jī)制，細(xì)胞凋亡是這套機(jī)制中的組成部分。魚(yú)類對(duì)低氧的耐受性取決于自身的生理調(diào)控能力，低氧可以引起細(xì)胞線粒體損傷，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，缺氧超出閾值后則導(dǎo)致魚(yú)類死亡，相關(guān)研究認(rèn)為低氧脅迫下，腦細(xì)胞和心肌細(xì)胞的大量凋亡是導(dǎo)致魚(yú)類死亡的主要原因[16]。心臟作為魚(yú)體的供氧中樞，對(duì)氧的需求很大，敏感度較高，低氧或缺氧后，必定會(huì)對(duì)其功能和器質(zhì)完整產(chǎn)生影響。本研究采用TUNEL染色法對(duì)鰱心臟組織進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果顯示，低氧脅迫加重了心肌細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象，且隨著氧濃度的降低，凋亡細(xì)胞數(shù)目也在增加。此結(jié)果與吳鑫杰等[11]對(duì)團(tuán)頭魴在低氧脅迫下心肌細(xì)胞凋亡的結(jié)果相同，與之有相似的結(jié)果在歐洲川鰈[17]、斑馬魚(yú)[18]上也有報(bào)道。趙金坤[8]研究了低氧脅迫下鰱腦細(xì)胞凋亡和肝細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示低氧脅迫處理至浮頭時(shí)，細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著升高，但浮頭組與死亡組凋亡細(xì)胞數(shù)目差異不顯著，并認(rèn)為造成此差異現(xiàn)象的原因之一可能是低氧脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡存在一個(gè)閾值，當(dāng)超出閾值后，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞死亡現(xiàn)象中所占比不再增加，而是由其他死亡方式代替[19]。此外，筆者認(rèn)為魚(yú)類由于在長(zhǎng)期演化進(jìn)程中會(huì)受到不同濃度溶氧水體的自然選擇，形成了適應(yīng)不同溶氧水環(huán)境的物種，甚至近緣物種間或同一物種不同品系間對(duì)低氧脅迫的適應(yīng)能力都不相同，因此，鰱不同器官或組織對(duì)缺氧的耐受性也可能存在差異[20]。但低氧脅迫下的細(xì)胞凋亡不僅表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)和生理上的變化，諸如細(xì)胞核凝集、細(xì)胞膜皺縮、DNA降解、凋亡小體形成等，深層次的變化更是涉及多種信號(hào)通路的調(diào)控。

3.3 低氧脅迫誘導(dǎo)凋亡調(diào)控基因Bax、Bcl-2表達(dá)變化

細(xì)胞凋亡作為生命的基本現(xiàn)象之一，廣泛存在于多細(xì)胞生物的生命進(jìn)程中。許多研究發(fā)現(xiàn)線粒體不僅為各種生命活動(dòng)提供能量，在調(diào)控細(xì)胞凋亡中也具有中心調(diào)控作用[21]。線粒體凋亡通路表現(xiàn)為各種內(nèi)外因素產(chǎn)生的胞內(nèi)信號(hào)作用于Bcl-2蛋白家族改變線粒體膜的通透性，釋放促凋亡物質(zhì)，如細(xì)胞色素C(cyt C)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活蛋白(Smac/DIABLO)等，直接或間接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bcl-2基因和Bax基因是線粒體凋亡通路Bcl-2蛋白家族中具有對(duì)立功能的基因，分別表達(dá)為抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax。正常生理?xiàng)l件下，Bcl-2蛋白和Bax蛋白各自形成同源二聚體，其中Bcl-2蛋白主要存在于線粒體膜，Bax蛋白主要存在于細(xì)胞漿；當(dāng)胞內(nèi)產(chǎn)生凋亡信號(hào)(受到低氧脅迫)，Bax會(huì)易位至線粒體膜上與Bcl-2蛋白結(jié)合成更穩(wěn)定的異源二聚體，抑制Bcl-2蛋白的抑凋亡作用。哺乳類研究表明，細(xì)胞Bcl-2基因高表達(dá)時(shí)，Bcl-2蛋白和Bax蛋白異源二聚體大量生成，抑制Bax蛋白的促凋亡作用；細(xì)胞Bax基因表達(dá)升高時(shí)，Bcl-2蛋白和Bax蛋白形成異源二聚體，阻止了Bcl-2蛋白的抑制凋亡作用[22]。因此，抗凋亡基因與促凋亡基因表達(dá)量的比值一定程度上決定了細(xì)胞的發(fā)展方向。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，隨著氧濃度降低至AO組水平，鰱心肌細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)量顯著性降低，Bax基因表達(dá)量顯著升高，Bcl-2/Bax的值也在逐漸減小，表明氧濃度降低至AO組水平時(shí)，細(xì)胞凋亡可能成為了鰱心肌細(xì)胞的主要發(fā)展方向，此結(jié)果與鱖魚(yú)[23]、團(tuán)頭魴[24]、斑點(diǎn)叉尾鮰[25]等低氧脅迫下Bcl-2和Bax基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)一致。但有研究表明，在慢性缺氧實(shí)驗(yàn)中，鯉[26]、斑馬魚(yú)[18]、斑點(diǎn)叉尾鮰等部分抗凋亡基因表達(dá)量也會(huì)升高，如斑馬魚(yú)的BI1、bnip3基因，斑點(diǎn)叉尾鮰的blp1、mcl1α基因，這可能與魚(yú)類的自我保護(hù)機(jī)制有關(guān)，是不同魚(yú)類適應(yīng)低氧環(huán)境所采取的生存策略。

綜上所述，低氧脅迫通過(guò)降低線粒體凋亡通路抗凋亡基因Bcl-2、升高促凋亡基因Bax，促使鰱心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心肌損傷，隨著溶解氧濃度的降低，鰱心肌凋亡現(xiàn)象越顯著，心肌損傷越嚴(yán)重。細(xì)胞凋亡使存在于心肌細(xì)胞的CK釋放進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液中CK活力升高。因此，低氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌損傷可能是鰱在低氧脅迫下死亡的重要原因。

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