鮮切果蔬中4 種病原微生物多重PCR檢測技術(shù)

馮 可，胡文忠*，姜愛麗，薩仁高娃，徐永平，司 琦，馬新秀

（1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600；2.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024）

鮮切果蔬又稱最少加工果蔬、半加工果蔬、輕度加工果蔬等，它是指以新鮮果蔬為原料，經(jīng)分級、清洗、整修、去皮、切分、保鮮、包裝等一系列處理后，再經(jīng)過低溫運輸進入冷柜銷售的即食或即用果蔬制品。鮮切果蔬既保持了果蔬原有的新鮮狀態(tài)，又經(jīng)過加工使產(chǎn)品清潔衛(wèi)生，屬于凈菜范疇。天然、營養(yǎng)、新鮮、方便以及可利用度高（100%可食用），滿足了人們追求快節(jié)奏，健康等生活方式的需求[1]。目前，在各大超市中，鮮切果蔬制品隨處可見，但是，由于其缺少果皮的保護，果肉中的營養(yǎng)成分以及活性成分直接暴露于空氣中或是與空氣間接接觸，會與氧氣發(fā)生生理生化反應(yīng)，導(dǎo)致細胞較易氧化、易褐變及易受微生物污染[2]。

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，世界每年食源性病例多達數(shù)十億，其中有220萬 人因此而喪生[3]。已將大腸桿菌O157:H7、鼠傷寒沙門菌、單核細胞性李斯特菌及金黃色葡萄球菌列為重要的食源性致病菌[4-5]，并且列為中國進出口產(chǎn)品的必檢項目。在我國每年發(fā)生的細菌性食物中毒占中毒事件的30%～90%，中毒人數(shù)占食物中毒總?cè)藬?shù)的60%～90%[6-7]。調(diào)查表明，單核細胞性李斯特菌可以在鮮切哈密瓜、鮮切西瓜、鮮切木瓜[8]、鮮切芹菜[9]以及9 種不同類型的鮮切蔬菜，如萵苣、菠菜、豆苗、芝麻菜、胡蘿卜、沙拉等[10]上繁殖。葡萄球菌食源性疾病是金黃色葡萄球菌腸毒素引起食物中毒的最常見的食源性疾病之一。金黃色葡萄球菌同樣能夠在鮮切火龍果、鮮切芒果、鮮切木瓜上快速繁殖[11]。大腸桿菌O157:H7和沙門菌引起病原微生物食物中毒事件約占微生物引起中毒事件總額的42.9%及34.3%[12]。

目前，常規(guī)國標法病原微生物檢測手段存在操作步驟繁瑣，耗時長等缺點，難以滿足市場需求。因此，建立能夠?qū)︴r切果蔬中多種病原微生物同時快速檢測的技術(shù)顯得尤為重要，多重聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)作為一種能夠快速、準確檢測多種病原微生物的技術(shù)已引起越來越多的重視[13-14]。本實驗在建立一共能夠同時、快速檢測鮮切果蔬中常見病原微生物多重PCR檢測方法。對促進鮮切果蔬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及保障人類生命安全具有重要意義[15]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萵苣、黃瓜、木瓜、哈密瓜購自大連市華潤萬家超市。

鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium）（CICC 21484）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CICC 23656）、大腸桿菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）（CICC 10907）、單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）（CICC 21633）、伊氏李斯特菌（L. ivanovii）（CICC 21663）、格氏李斯特菌（L. grayi）（CICC 21670）、斯氏李斯特菌（L. seeligeri）（CICC 21671）、威氏李斯特菌（L. welshimeri）（CICC 21672）、英諾克李斯特菌（L. innocua）（ATCC 10417）、腸侵襲性大腸桿菌（E. coli EIEC）（CICC 10661）、乙型副傷寒沙門菌（S. paratyphi β）（CICC 10437）、腸道沙門菌腸道亞種傷寒血清型（S. enterica subsp. enterica serovar Typhi）（CICC 10871）、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）（CICC 21516）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）（CICC 23832）、大腸埃希氏菌（E. coli）（CICC 10389）、志賀毒性大腸埃希氏菌（E. coli STEC）（CICC 10668）、副溶血性弧菌（V. parahemolyticus）（CICC 21617）、霍亂弧菌（Vibrio cholera）（CICC 23794）、銅綠色假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（CICC 20236）、空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）（CICC 22936）、福氏志賀菌（Shigella flexneri）（CICC 10865）、宋內(nèi)志賀菌（S. sonnei）（CICC 21679）、熒光假單胞菌（P. fluorescens）（CICC 20225）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）（CICC 10002） 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

10×PCR Buffer （Mg2+free）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）、RNase-Free Water、exTaq DNA Polymerase（5 U/μL）、6×DNA loading Buffer、DL1000 DNA Marker 大連寶生物有限公司；瓊脂糖西班牙Biowest公司；GelRed染料 上海拜力生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BagMixer-400W均質(zhì)器 法國Interscience公司；Scientific Arktik Thermo熱循環(huán)儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；PCR潔凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；D1008E型旋渦混合器 江蘇天翎儀器有限公司；BioSpectrum 310凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備

將實驗室保存的單核細胞性李斯特菌、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7分別接種于TSA固體培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)24 h，分別挑取單菌落接種于5 mL TSB養(yǎng)基中，36 ℃靜止培養(yǎng)18～24 h。取1 mL菌懸液（約為108CFU/mL）進行DNA提取。

1.3.2 DNA提取

純培養(yǎng)菌液1 mL于離心管中，12 000 r/min離心2 min，棄上清液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作方法進行提取。提取的模板儲備液通過Thermo酶標儀得到OD260nm、OD280nm以確定提取的DNA濃度及純度。

1.3.3 引物設(shè)計

利用Premier 5.0和Oligo 6.0軟件對目的基因進行引物設(shè)計以及評價[16]，選取出4 對不同片段大小及相近退火溫度的特異性引物，經(jīng)過BLAST分別將引物與目的基因同源性進行比對，確定引物序列[17-18]見表1。

表1 多重PCR引物序列Table 1 Primer pairs designed for multiplex PCR

1.3.4 多重PCR引物濃度優(yōu)化

多重PCR總體積為25 μL，其中終濃度分別為1×Ex Taq Buffer、MgCl22 mmol/L、dNTPs Mixture 0.2 mmol/L、exTaq酶1 U/μL，引物濃度按照表2進行四因素四水平正交優(yōu)化。將鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7和單核細胞性李斯特菌的DNA等比例混合后，加入4 μL作為模板；每組實驗加ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。擴增產(chǎn)物檢測：經(jīng)3 mg/100 mL的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。將擴增產(chǎn)物送到寶生物工程有限公司進行測序。

表2 四因素四水平L16（44）正交試驗設(shè)計Table 2 Orthogonal array design L16 (44)

1.3.5 多重PCR反應(yīng)液濃度優(yōu)化[19]

多重PCR總體積為25 μL，其中終濃度分別為1×Ex Taq Buffer；其他反應(yīng)液成分按照表3進行三因素三水平正交試驗優(yōu)化，影響因素分別為MgCl2（25 mmol/L），優(yōu)化水平2.0、2.5、3.0 mmol/L；dNTPs Mixture（2.5 mmol/L），優(yōu)化水平0.15、0.20、0.25 mmol/L；exTaq酶（5 U/μL），優(yōu)化水平0.5、1.0、1.5 U。

表3 三因素三水平L9（33）正交試驗設(shè)計Table 3 Orthogonal array design L9 (33)

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。擴增產(chǎn)物檢測：經(jīng)質(zhì)量濃度為3 g/100 mL的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。將擴增產(chǎn)物送寶生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.3.6 多重PCR退火溫度優(yōu)化

多重PCR反應(yīng)總體積為25 μL，包括1×Ex Taq Buffer；MgCl2（25 mmol/L）、dNTPs Mixture （2.5 mmol/L）、exTaq酶（5 U/μL）、引物濃度均為優(yōu)化后結(jié)果，將鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7和單核細胞性李斯特菌的DNA等比例混合后，加入4 μL作為模板，每組實驗加ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火溫度的優(yōu)化分別為52.0、52.2、52.6、53.2、54.1、55.2、56.6、57.8、58.6、59.4、59.8、60.0 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，32 個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min；每組實驗加ddH2O 補足至25 μL。擴增產(chǎn)物檢測：經(jīng)質(zhì)量濃度為3 g/100 mL的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。將擴增產(chǎn)物送到寶生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.3.7 多重PCR延伸時間優(yōu)化

多重PCR總體積為25 μL，包括1×Ex Taq Buffer、MgCl2（25 mmol/L）、dNTPs Mixture（2.5 mmol/L）、exTaq酶（5 U/μL）、引物濃度均為優(yōu)化后結(jié)果，將鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7和單核細胞性李斯特菌的DNA等比例混合后，加入4 μL作為模板，每組實驗加ddH2O 補足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，退火溫度為優(yōu)化后結(jié)果，復(fù)性30 s，72 ℃延伸時間分別為15、30、45、60、75、90 s，32 個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min；每組實驗加ddH2O補足至25 μL。擴增產(chǎn)物檢測：經(jīng)質(zhì)量濃度為3 g/100 mL的瓊脂糖凝膠電泳后，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。將擴增產(chǎn)物送到寶生物工程（上海）有限公司進行測序。

1.3.8 多重PCR引物間特異性驗證

為確定所建立多重PCR方法的特異性，按照多重PCR體系與條件隨機組合添加模板DNA，每組按照表4進行擴增反應(yīng)，根據(jù)擴增產(chǎn)物分析有無反應(yīng)內(nèi)交叉錯配現(xiàn)象[20]。

表4 特異性驗證實驗Table 4 Experimental design for validation of PCR specificity

1.3.9 多重PCR菌間特異性驗證

利用優(yōu)化得到的多重PCR檢測方法對非目標菌DNA模板進行擴增。對建立的反應(yīng)體系進行特異性驗證[21]。選擇伊氏李斯特菌、格雷李斯特菌、斯氏李斯特菌等20種非目標菌作為陰性對照，并用ddH2O作為空白對照。

1.3.10 多重PCR檢出限檢測

將菌懸液用0.1%無菌蛋白胨水10 倍梯度稀釋至3（lg（CFU/mL）），菌懸液和每個稀釋梯度的菌液各取1 mL，用細菌DNA提取試劑盒對目標菌進行提取，以獲得DNA模板，按最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進行實驗。同時對目標菌按照涂布法進行菌落計數(shù)。

1.3.11 預(yù)富集培養(yǎng)

將4 種目標菌菌懸液用0.1%無菌蛋白胨稀釋至100、103、106CFU/mL，以TSB為基礎(chǔ)的改良的共增菌培養(yǎng)基，共增菌培養(yǎng)基配方如下：胰蛋白胨17 g/L、蛋白胨3 g/L、氯化鈉10 g/L、磷酸氫二鈉2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L。預(yù)富集培養(yǎng)3、6、9 h，菌懸液各取1 mL，用細菌DNA提取試劑盒對目標菌進行提取，以獲得DNA模板，按最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進行實驗。

1.3.12 人工接種鮮切果蔬驗證

制備4 種致病菌菌懸液，用0.1%無菌蛋白胨水稀釋至10 CFU/mL，取1 mL菌懸液分別侵染至清洗后的鮮切萵苣、鮮切黃瓜、鮮切木瓜、鮮切哈密瓜表面，樣品質(zhì)量約10 g，片狀樣品規(guī)格約0.5 cm×0.5 cm，塊狀樣品規(guī)格約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm。在安全柜中吹干1 h，將其分別浸泡于90 mL共增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)至可檢出的時間、37 ℃[22]。采用已建立的多重PCR技術(shù)對其進行驗證，以確定該技術(shù)在鮮切果蔬中應(yīng)用的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重PCR引物濃度優(yōu)化結(jié)果

各引物對在多重PCR過程中呈相互抑制的關(guān)系，適當?shù)恼{(diào)節(jié)引物濃度配比可以有效避免目標條帶漏檢的現(xiàn)象，是影響多重PCR有效擴增目標條帶的關(guān)鍵因素[23]。多重PCR引物濃度優(yōu)化結(jié)果如圖1所示，不同比例的引物濃度擴增的結(jié)果有所不同，引物濃度用量較低時，會出現(xiàn)目標條帶未被擴增的現(xiàn)象。而當引物用量過高時，會導(dǎo)致單一目標條帶過于明亮且彌散。當4 種目標菌的引物濃度配比不同時，易出現(xiàn)雜帶擴增的現(xiàn)象。由圖1中泳道1～3所示，均有雜帶擴增的現(xiàn)象。圖1b中泳道4和泳道8，由于inlA引物濃度含量較低，因此擴增的相應(yīng)條帶較暗。而在圖1b中泳道5～7，均可擴增出4 條清晰、明亮且特異性良好的條帶。考慮到條帶明亮度的均一性及最大限度的提高擴增效率，則選擇泳道7中inv引物濃度為0.4 μmol/L，wzy引物濃度為0.3 μmol/L，inlA引物濃度為0.2 μmol/L，nuc引物濃度為0.4 μmol/L時為最終引物濃度配比進行后續(xù)實驗。

圖1 多重PCR引物濃度優(yōu)化結(jié)果Fig. 1 Optimization of primer concentrations for multiplex PCR

2.2 多重PCR體系優(yōu)化結(jié)果

圖2 PCR體系優(yōu)化結(jié)果Fig. 2 Optimization of reaction system for multiplex PCR

2.3 多重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果

菌nuc引物濃度為0.4 μmol/L時，Mg2+濃度為3.0 mmol/L，dNTP濃度為0.25 mmol/L，exTaq活力為1.0 U時對多重PCR退火溫度進行優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 多重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Optimization of annealing temperature for multiplex PCR

在52～60 ℃范圍內(nèi)擴增的目標條帶明顯不同，當退火溫度較低時如泳道1、2，鼠傷寒沙門菌目標條帶幾乎無法擴增，隨著退火溫度升高，如圖3泳道6～9所示，擴增條帶逐漸呈現(xiàn)清晰可見的現(xiàn)象。而當退火溫度為58.6、59.4、59.8、60.0 ℃時，單核細胞性李斯特菌inlA基因則呈無法擴增的現(xiàn)象，這是由于退火溫度過高導(dǎo)致擴增效率顯著降低的結(jié)果[25]。綜合而言，泳道7中4 條目標條帶清晰、明亮，因此選擇退火溫度為56.6 ℃進行后續(xù)實驗。

2.4 多重PCR延伸時間優(yōu)化結(jié)果

在退火溫度為56.6 ℃條件下，對反應(yīng)條件中延伸時間優(yōu)化結(jié)果如圖4所示，隨著延伸時間的延長，擴增效率呈下降趨勢。延伸時間在30～60 s時，如圖4泳道2～4所示，均可擴增出清晰條帶，考慮到縮短擴增時間，則選擇泳道2中延伸時間為30 s進行后續(xù)擴增。程曉艷等[26]對5 種病原微生物多重PCR延伸時間優(yōu)化結(jié)果同樣表明，當延伸時間從1 min增加到2.5 min時多重PCR擴增效率呈現(xiàn)下降趨勢。

圖4 多重PCR延伸時間優(yōu)化結(jié)果Fig. 4 Optimization of extension time for multiplex PCR

2.5 多重PCR引物間特異性驗證

利用已建立的多重PCR體系對目標菌進行引物間特異性的檢測，檢測結(jié)果如圖5所示。泳道1～6則可效擴增出兩兩隨機組合的目標病原菌，泳道7～10可分別有效擴增出隨機組合的3 種目標病原菌，泳道11中含有4 種目標菌。均無非特異性擴增條帶出現(xiàn)。陰性對照無擴增條帶。該結(jié)果與Germini等[21]建立的大腸桿菌O157:H7、沙門菌屬以及單核細胞性李斯特菌多重PCR檢測技術(shù)引物間特異性驗證結(jié)果一致。Xu Yigang等[27]同樣將弧菌屬中的5 種食源性病原微生物隨機侵染于海產(chǎn)品中，驗證了其建立的多重PCR技術(shù)擴增任意目標菌的有效性。

圖5 多重PCR引物間特異性驗證結(jié)果Fig. 5 specific verification among primers in multiplex PCR

2.6 多重PCR體系中菌間特異性檢測

如圖6所示，在同一反應(yīng)管中可同時擴增得4 種目的基因片段，3 g/100 mL的瓊脂糖凝膠電泳顯示在285、193、159 bp和121 bp處均有條帶出現(xiàn)，且沒有引物二聚體形成，沒有非特異性條帶出現(xiàn)。圖6泳道2～11為非目標菌擴增結(jié)果，與對照組一致無條帶擴增，表明其特異性良好。

圖6 多重PCR菌間特異性驗證結(jié)果Fig. 6 Specificity of multiplex PCR

2.7 多重PCR檢出限驗證結(jié)果

圖7 多重PCR檢出限驗證結(jié)果Fig. 7 Detection limits of multiplex PCR

將4 種致病菌的菌懸液進行梯度稀釋后，進行菌落數(shù)確定，單核細胞性李斯特菌的菌落數(shù)為3.5×107CFU/mL，大腸桿菌O157:H7的菌落數(shù)為4.8×107CFU/mL，金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)為2.4×107CFU/mL，鼠傷寒沙門菌的菌落數(shù)為1.6×107CFU/mL。分別將稀釋后提取的DNA等比例進行混合，用優(yōu)化好的多重PCR體系進行檢測驗證，結(jié)果如圖7所示，4 種目標菌的檢測限分別為單核細胞性李斯特菌為3.5×106CFU/mL，大腸桿菌O157:H7為4.8×105CFU/mL，金黃色葡萄球菌為2.4×105CFU/mL，鼠傷寒沙門菌為1.6×105CFU/mL。錢志偉等[29]利用多重PCR技術(shù)特異性擴增金黃色葡萄球菌的nuc基因，單核細胞性李斯特菌的prs基因，沙門菌的invA基因，經(jīng)優(yōu)化后，其檢測水平為3.8、5.1、7.6 pg/μL，該技術(shù)可用于牛乳中這3 種菌的檢測。陳娟等[22]建立了檢測金黃色葡萄球菌、腸炎沙門菌、大腸桿菌O157:H7、單核增生李斯特菌、福氏志賀菌5 種目標菌的多重PCR檢測技術(shù)，其檢出限分別為6.4、32、32、800 pg和160 pg。

2.8 病原微生物預(yù)富集多重PCR驗證結(jié)果

利用已建立的多重PCR方法對不同接種量，單核細胞性李斯特菌（1、3.8×103、3.8×106CFU/mL），大腸桿菌O157∶H7 （1、1.8×103、1.8×106CFU/mL），鼠傷寒沙門菌 （1、5.4×103、5.4×106CFU/mL），金黃色葡萄球菌（1、2.1×103、2.1×106CFU/mL）。在0、3、6、9 h富集后進行驗證。如圖8所示，泳道1和泳道4所示，1 CFU/mL接種量在0、3 h富集后無條帶擴增，泳道10中，在9 h富集后可有效擴增出4 條特異性條帶。103CFU/mL接種后，泳道2所示，0 h無擴增條帶，富集3 h后，泳道5所示，均可擴增出4 條目標條帶，在106CFU/mL接種0 h后，泳道3所示，可擴增出4 條目標條帶。綜上所述，結(jié)果表明，其實接種量低至1 CFU/mL時，富集9 h后均可擴增出4 條目標條帶。

圖8 多重PCR預(yù)富集檢測驗證結(jié)果Fig. 8 Detection limits of multiplex PCR with pre-enrichment

2.9 人工污染鮮切果蔬樣品驗證結(jié)果

圖9 鮮切果蔬樣品檢測結(jié)果Fig. 9 Multiplex PCR detection of fresh-cut fruit and vegetables

利用已建立的多重PCR方法對染菌量為1 CFU/g的鮮切萵苣、鮮切黃瓜、鮮切木瓜、鮮切哈密瓜，進行富集培養(yǎng)9 h后進行驗證。如圖9所示，對4 種樣品驗證均可有效擴增出4 條目標條帶，其條帶大小與預(yù)計大小相符，陰性對照無條帶擴增。其中，泳道1～2條帶清晰明亮，而泳道3和4中鼠傷寒沙門菌條帶較暗，可能是由于鮮切木瓜和鮮切哈密瓜中雜質(zhì)較多對多重PCR的擴增效率產(chǎn)生了一定的影響。綜上所述，鮮切果蔬產(chǎn)品受病原菌侵染后，預(yù)富集9 h，利用所建立的多重PCR技術(shù)對鮮切果蔬產(chǎn)品的檢出限可達到1 CFU/g。

3 結(jié) 論

針對單核細胞性李斯特菌inlA基因、鼠傷寒沙門菌invA基因、大腸桿菌O157:H7 wzy基因、金黃色葡萄球菌的nuc基因設(shè)計及篩選出4 對引物，引物特異性強，互不干擾。

建立了一種能夠同時檢測單核細胞性李斯特菌、大腸桿菌O157:H7、鼠傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌4 種致病菌的多重PCR檢測方法，其檢出限分別為3.5×106、4.8×105、1.6×105、2.4×105CFU/mL。

鮮切萵苣、鮮切黃瓜、鮮切木瓜和鮮切哈密瓜4 種產(chǎn)品受病原菌侵染，預(yù)富集9 h后，利用所建立的多重PCR技術(shù)對鮮切果蔬產(chǎn)品的檢出限可達到1 CFU/g。

方法的建立相較于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法可節(jié)約大量的勞力、試劑、時間等，檢測時間由原來的5～7d，縮短至9～11 h，對于企業(yè)或分析檢驗中心大批量樣品的監(jiān)測具有指導(dǎo)意義。

[1] 李超, 馮志宏, 陳會燕, 等. 鮮切果蔬保鮮技術(shù)的研究進展[J]. 保鮮與加工, 2010, 10(1): 3-6.

[2] 高雪麗, 高愿軍. 鮮切果蔬加工與微生物控制[J]. 食品工程,2006(2): 11-13.

[3] SCALLAN E, HOEKSTRA R M, ANGULO F J, et al. Foodborne illness acquired in the united states major pathogens[J]. Emerging Infectious Diseases, 2011, 17(1): 7-15. DOI:10.3201/eid1701.P11101.

[4] 曾德興, 黃思思, 陳應(yīng)堅. 細菌性食物中毒病原菌調(diào)查與預(yù)防對策分析[J]. 現(xiàn)代診斷與治療, 2016(8): 1518-1520.

[5] 馮可, 胡文忠, 姜愛麗, 等. 單核細胞增生性李斯特菌分子生物學(xué)檢測技術(shù)的研究進展[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(4): 392-396.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.04.044.

[6] 侯君, 陳玉鳳, 欒明春, 等. 2009—2012年大連市食品中食源性致病菌污染狀況調(diào)查[J]. 醫(yī)學(xué)動物防制, 2015(1): 7-9. DOI:10.7629/yxdwfz201501003.

[7] 崔燕, 梁效成. 2011—2013年甘肅省食源性疾病暴發(fā)事件分析[J].疾病預(yù)防控制通報, 2015(1): 76-78. DOI:10.13215/j.cnki.jbyfkztb.1408015.

[8] PENTEADO A L, LEITAO M F F. Growth of Listeria monocytogenes in melon, watermelon and papaya pulps[J]. International Journal Food Microbiology, 2004, 92(1): 89-94. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2003.08.020.

[9] JOSHUA P V, DI L, LINDA J H, et al. Fate of Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, and Salmonella on fresh-cut celery[J]. Food Microbiology, 2013, 34(1): 151-157. DOI:10.1016/j.fm.2012.11.016.

[10] SANT’ANA A S, MATHEUS S B, MARIA T D, et al. Growth potential of Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in nine types of ready-to-eat vegetables stored at variable temperature conditions during shelf-life[J]. International Journal Food Microbiology, 2012,157(1): 52-58. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2012.04.011.

[11] FENG K, HU W Z, JIANG A L, et al. Growth potential of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus on fresh-cut tropical fruits[J]. Journal of Food Science, 2015, 80(11): M2548-M2554.DOI:10.1111/1750-3841.13089.

[12] NUESCH-INDERBINEN M, STEPHAN R. Fresh fruit and vegetables as vehicles of bacterial foodborne disease: a review and analysis of outbreaks registered by proMED-mail associated with fresh produce[J].Journal of Food Safety and Food Quality-Archiv fur Lebensmittelhygiene,2016, 67(2): 32-39. DOI:10.2376/0003-925X-67-32.

[13] DíAZ-LóPEZ A, CANTú-RAMíREZ R C, GARZAGONZáLEZ E,et al. Prevalence of foodborne pathogens in grilled chicken from street vendors and retail outlets in reynosa, tamaulipas, Mexico[J]. Journal of Food Protection, 2011, 74(8): 1320-1323. DOI:10.4315/0362-028X.JFP-11-014.

[14] 楊柳, 胡文忠, 姜愛麗, 等. 分子生物學(xué)方法檢測沙門氏菌的研究進展[J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(9): 372-379. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.065.

[15] CHEN J, TANG J, LIU J, et al. Development and evaluation of a multiplex PCR for simultaneous detection of five foodborne pathogens[J]. Journal of Applied Microbiology, 2012, 112(4): 823-830. DOI:10.1111/j.1365-2672.2012.05240.x.

[16] YAN W. Multiplex PCR primer design for simultaneous detection of multiple pathogens[J]. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.),2015, 1275: 91-101. DOI:10.1007/978-1-4939-2365-6_6.

[17] 馮可, 胡文忠, 姜愛麗, 等. 多重PCR法檢測鮮切哈密瓜中3 種食源性致病菌[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(6): 295-302. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706046.

[18] FENG K, HU W Z, JIANG A L, et al. A dual filtration-based multiplex PCR method for simultaneous detection of viable Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus on fresh-cut cantaloupe[J]. PLoS ONE, 2016, 11(12): e0166874.DOI:10.1371/journal.pone.0166874.

[19] 王如景, 王羽, 李英軍, 等. 雙正交優(yōu)化多重PCR檢測食源性致病菌的研究[J]. 食品科技, 2012, 37(8): 308-313. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2012.08.071.

[20] KIM J H, RHIM S R, KIM K T, et al. Simultaneous detection of Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus,Salmonella spp., and Staphylococcus aureus in low-fatted milk by multiplex PCR[J]. Korean Journal for Food Science of Animal Resources, 2014, 34(5): 717-723. DOI:10.5851/kosfa.2014.34.5.717.

[21] NARI L, KYUNG Y K, SU K O, et al. A multiplex PCR assay for simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus,Vibrio parahaemolyticus, Salmonella spp., Listeria monocytogenes,and Staphylococcus aureus in Korean ready-to-eat food[J]. Foodborne Pathogens and Disease, 2014, 11(7): 574-580. DOI:10.1089/fpd.2013.1638.

[22] YU Q, ZHAI L Z, BIE X M, et al. Survey of five food-borne pathogens in commercial cold food dishes and their detection by multiplex PCR[J]. Food Control, 2016, 59: 862-869. DOI:10.1016/j.foodcont.2015.06.027.

[23] 孫鴻燕. 四種食源性致病菌多重PCR檢測方法的建立[D]. 長春: 吉林大學(xué), 2011: 37.

[24] 郝玉芹, 孫皆宜, 李艾, 等. 正交優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系檢測3 種食源性致病菌的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(2): 602-605.DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.02.009.

[25] YANG I, KIM Y, BYUN J, et al. Use of multiplex polymerase chain reactions to indicate the accuracy of the annealing temperature of thermal cycling[J]. Analytical Biochemistry, 2005, 338(2): 192-200.DOI:10.1016/j.ab.2004.09.035.

[26] 程曉艷, 劉慶慧, 黃倢. 5 種食源性致病菌多重PCR檢測方法的建立[J].漁業(yè)科學(xué)進展, 2012, 33(2): 97-103.

[27] GERMINI A, MASOLA A, CARNEVALI P, et al. Simultaneous detection of Escherichia coli O175:H7, Salmonella spp. and Listeria monocytogenes by multiplex PCR[J]. Food Control, 2009, 20: 733-738. DOI:10.1016/j.foodcont.2008.09.010.

[28] XU Y G, SUN L M, WANG Y S, et al. Simultaneous detection of Vibrio cholerae, Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus in seafood using dual priming oligonucleotide (DPO)system-based multiplex PCR assay[J]. Food Control, 2017, 71: 64-70.DOI:10.1016/j.foodcont.2016.06.024.

[29] 錢志偉, 孫新城. 食品中3 種致病菌多重PCR檢測體系的建立及初步應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(16): 236-239.

[30] 陳娟, 唐俊妮, 李鍵, 等. 五種食源性致病菌多重PCR的條件優(yōu)化和檢出限分析[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2014, 26(2): 137-141.DOI:10.13590/j.cjfh.2014.02.008.