環(huán)境脅迫對屎腸球菌8-3 LuxS/AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)的影響

顧 悅，李 博，吳 榮，田建軍，吳 敬，賀銀鳳*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是細(xì)菌利用自體誘導(dǎo)物又稱信號分子進(jìn)行信息交流的一種機(jī)制，細(xì)菌生長過程中將產(chǎn)生的信號分子分泌到細(xì)胞外，細(xì)菌自身通過感應(yīng)胞外信號分子的數(shù)量感知菌體的密度，當(dāng)達(dá)到一定閾值時調(diào)控特定基因的表達(dá)，參與菌體的生理行為[1]。QS系統(tǒng)可以調(diào)控包括胞外多糖產(chǎn)生、孢子形成、生物發(fā)光、生物膜形成以及初級代謝等在內(nèi)的多種代謝過程[2-6]。一般來說，革蘭氏陽性菌的信號分子為寡肽類物質(zhì)，革蘭氏陰性菌的信號分子為?；呓z氨酸內(nèi)脂類物質(zhì)，而信號分子AI-2（autoinducer-2）是一種在革蘭氏陽性、陰性菌都存在，可以用于不同細(xì)菌種間交流的信號分子[7]。目前發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌主要是通過S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）代謝途徑生產(chǎn)信號分子AI-2。SAM作為一種甲基的供體在S-腺苷甲硫氨酸酶的作用下脫去甲基生成了具有毒性的中間代謝產(chǎn)物S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH），S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（S-adenosylhomocysteine nucleosidase，Pfs）迅速水解SAH形成S-核糖高半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine，SRH）和腺嘌呤，SRH在S-核糖高半胱氨酸裂解酶（S-ribosylhomocysteine lyase，LuxS）的作用下生成4,5-二羥基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD）和高半胱氨酸，DPD結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，分子重排后形成呋喃硼酸二酯，即信號分子AI-2[8]。

屎腸球菌（Enterococcus faecium）是人和動物腸道中正常菌群的成員，其正常的代謝過程可以產(chǎn)生過氧化氫、有機(jī)酸和細(xì)菌素等物質(zhì)，能夠抑制和殺滅病原菌，具有益生菌特性[9]。隨著微生態(tài)制劑的不斷發(fā)展，屎腸球菌作為優(yōu)選出的菌種，具有優(yōu)良的生物學(xué)特性，通過生物拮抗等可以在宿主腸道中迅速形成優(yōu)勢菌群，進(jìn)而增強(qiáng)宿主免疫功能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，最終達(dá)到提高生長性能促進(jìn)動物健康生長的目的[10]。有研究顯示，飼糧中添加屎腸球菌可以降低仔豬平均日采食量、提高平均日增重、降低料重比，有改善仔豬生長性能的趨勢，與添加抗生素效果相近[11]。在對E. faecium 83的研究中發(fā)現(xiàn)，其含有信號分子AI-2合成的關(guān)鍵基因luxS和pfs，通過克隆和表達(dá)LuxS和Pfs蛋白成功在體外合成了具有生物活性的信號分子AI-2[12]。在乳酸菌對酸適應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)luxS基因參與菌體的酸性應(yīng)激，而這對菌體通過胃腸道定植、進(jìn)行菌體間的相互交流具有一定作用[13]。同時，嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）黏附腸表皮細(xì)胞的過程也依賴于LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)[14]。

盡管對于LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)的研究比較多，但是對環(huán)境脅迫下乳酸菌LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)的研究鮮有報道。本實(shí)驗以酸馬奶酒中分離出的一株高產(chǎn)信號分子AI-2的E. faecium 8-3為研究對象，通過改變pH值、溫度、滲透壓、營養(yǎng)條件研究菌株生長、信號分子AI-2產(chǎn)生以及l(fā)uxS和pfs基因表達(dá)量的變化，為研究LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)介導(dǎo)乳酸菌的應(yīng)激過程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基和試劑

內(nèi)蒙古錫林郭勒盟地區(qū)酸馬奶酒中分離得到的E. faecium 8-3，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌和酵母菌共生機(jī)理的研究”課題組提供；哈維氏弧菌BB170（Vibrio harveyi BB170）購自美國典型菌種保藏中心（BAA-1117）。

MRS培養(yǎng)基、AB培養(yǎng)基根據(jù)文獻(xiàn)[15-16]方法配制，制備培養(yǎng)基使用的試劑均為國產(chǎn)分析純。

RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqII 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；PB-10 pH計 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；BCN-1360型生物超凈工作臺 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；T6新悅可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Perkin Elmer victor X 酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀 美國Perkin Elmer儀器有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；快速梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；GelDoc XR+凝膠成像儀、C1000 Thermal Cycler熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 無細(xì)胞發(fā)酵上清液（cell-free fermentation supernatant，CFS）的制備

將培養(yǎng)24 h的二代E. faecium 8-3按2%接種比接入MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，菌液以6 000 r/min離心10 min棄去菌泥，上清液用0.22 μm濾菌器過濾除菌，得到E.faecium 8-3 CFS；將V. harveyi BB170接種于AB培養(yǎng)基，30 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，用相同方法收集CFS作為陽性對照；MRS培養(yǎng)基和AB培養(yǎng)基用0.22 μm濾菌器過濾分別作為介質(zhì)對照和陰性對照。濾液-80 ℃保存。

1.3.2 生物學(xué)方法檢測信號分子AI-2

將V. harveyi BB170接種到AB培養(yǎng)基中，30 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)至OD595nm為0.9～1.1，按1∶5 000（體積比）混合菌液和新鮮AB培養(yǎng)基，得到稀釋后的V. harveyi BB170菌液。將1.3.1節(jié)制備的CFS與稀釋后的V. harveyi BB170菌液以1∶100（體積比）進(jìn)行混合，30 ℃ 100 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔30 min使用酶標(biāo)儀的化學(xué)發(fā)光模式測定其熒光強(qiáng)度，在陰性對照熒光強(qiáng)度值達(dá)到最低（3.5 h）時對各個樣品的相對熒光強(qiáng)度進(jìn)行計算，其相對熒光強(qiáng)度用以代表信號分子AI-2產(chǎn)量。待測樣品相對熒光強(qiáng)度=待測樣品的熒光強(qiáng)度值/介質(zhì)對照的熒光強(qiáng)度值[17]。

1.3.3 不同環(huán)境脅迫對E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2的影響

1.3.3.1 酸堿脅迫對E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2的影響

用1 mol/L的HCl和NaOH分別將MRS培養(yǎng)基pH值調(diào)至4.5、5.5、7.5和8.5，將二代活化培養(yǎng)24 h的E. faecium 8-3按2%接種比接入不同pH值的MRS培養(yǎng)基中作為實(shí)驗組，相同比例接種E. faecium 8-3至pH 6.5的MRS培養(yǎng)基中作為對照組，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，4～25 h的培養(yǎng)過程中每隔3 h測定發(fā)酵液OD595nm，同時按1.3.1節(jié)方法收集實(shí)驗組和對照組的CFS，測定信號分子AI-2產(chǎn)量。

1.3.3.2 溫度脅迫對E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2的影響

將活化二代培養(yǎng)24 h的E. faecium 8-3按2%接種比接入MRS培養(yǎng)基中，分別置于23、30 ℃和44 ℃培養(yǎng)作為實(shí)驗組，相同比例接種E. faecium 8-3至MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)作為對照組。4～25 h的培養(yǎng)過程中每隔3 h測定發(fā)酵液OD595nm，同時按1.3.1節(jié)方法收集實(shí)驗組和對照組的CFS，測定信號分子AI-2產(chǎn)量。

1.3.3.3 滲透壓脅迫對E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2的影響

通過在MRS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的NaCl，制備NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%、3.0%、4.5%的培養(yǎng)基，將活化二代培養(yǎng)24 h的E. faecium 8-3按2%接種比接入不同滲透壓的MRS培養(yǎng)基中作為實(shí)驗組，相同比例接種E. faecium 8-3至NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%的MRS培養(yǎng)基中作為對照組，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，4～25 h的培養(yǎng)過程中每隔3 h測定發(fā)酵液OD595nm，同時按1.3.1節(jié)方法收集實(shí)驗組和對照組的CFS，測定信號分子AI-2產(chǎn)量。

1.3.3.4 營養(yǎng)脅迫對E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2的影響

使用生理鹽水對MRS培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋至終體積分?jǐn)?shù)為原液的20%、40%、60%、80%，將活化二代培養(yǎng)24 h的E. faecium 8-3按2%接種比接入不同營養(yǎng)條件的MRS培養(yǎng)基中作為實(shí)驗組，相同比例接種E. faecium 8-3至100% MRS培養(yǎng)基中作為對照組，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，4～25 h的培養(yǎng)過程中每隔3 h測定發(fā)酵液OD595nm，同時按1.3.1節(jié)方法收集實(shí)驗組和對照組的CFS，測定信號分子AI-2產(chǎn)量。

1.3.4 不同環(huán)境脅迫對luxS和pfs基因表達(dá)量的影響

選取16S rRNA基因作為相對熒光定量PCR的內(nèi)參基因。根據(jù)GenBank中E. faecium luxS和pfs基因全序列，利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0（PREMIER Biosoft International，美國），設(shè)計擴(kuò)增16S rRNA、luxS和pfs基因的引物（表1）。引物由上海生工生物有限公司合成。

將培養(yǎng)24 h的二代E. faecium 8-3按2%接種比接入經(jīng)過不同處理的MRS培養(yǎng)基中或不同溫度進(jìn)行培養(yǎng)，選取對數(shù)期7 h收集菌體。使用TaKaRa RNA Plus對菌體總RNA進(jìn)行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，使用微量紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度。以總RNA為模板，使用PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒對RNA中的DNA進(jìn)行去除，同時進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板使用SYBR Premix Ex TaqII進(jìn)行熒光定量PCR，采用25 μL體系（cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，Taq酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL），PCR條件為：95 ℃ 4 min；95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCT法計算基因表達(dá)量。

表1 E. faecium 8-3所用引物相關(guān)信息Table 1 Primers used for PCR amplification of total RNA from E. faecium 8-3 and sizes of PCR products

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酸堿脅迫對E. faecium 8-3 LuxS/AI-2 QS的影響

圖1 培養(yǎng)基pH值對E. faecium 8-3菌體密度的影響Fig. 1 Effect of medium pH on optical density of E. faecium 8-3

如圖1所示，隨著pH值的不斷升高菌體生長能力不斷增強(qiáng)，當(dāng)pH值達(dá)到8.5時生長能力最為旺盛，說明菌株在堿性環(huán)境的生長能力要優(yōu)于酸性環(huán)境。同時，在pH 5.5時菌體生長能力最弱，在pH 4.5時菌體并不生長，說明酸性脅迫會抑制E. faecium 8-3的生長。

由表2可知，在4～10 h的培養(yǎng)過程中，E. faecium 8-3在pH 8.5的培養(yǎng)基中產(chǎn)信號分子AI-2產(chǎn)量顯著高于其他實(shí)驗組和對照組，在13～25 h的培養(yǎng)過程中，顯著高于對照組和pH 5.5中培養(yǎng)，而E. faecium 8-3在pH 4.5的培養(yǎng)基中卻不產(chǎn)信號分子AI-2。結(jié)合圖1可知，在堿性環(huán)境下，pH 7.5和pH 8.5培養(yǎng)菌體密度顯著大于對照組，說明在菌體生長旺盛時，信號分子AI-2產(chǎn)量也會有所增加，這時信號分子AI-2會隨著菌體密度的增加而增加。在13～25 h的培養(yǎng)過程中，pH 7.5和pH 8.5的培養(yǎng)條件信號分子AI-2產(chǎn)量沒有顯著差異，可能是因為E. faecium 8-3在生長的過程中產(chǎn)生乳酸中和培養(yǎng)基，使得培養(yǎng)基的pH值相近，從而使信號分子AI-2產(chǎn)量沒有顯著差異。在酸性環(huán)境下，pH 5.5培養(yǎng)菌體的密度顯著低于對照組，但信號分子AI-2產(chǎn)量卻顯著高于對照組。當(dāng)培養(yǎng)基pH值降到4.5時，菌體生長受到了嚴(yán)重影響，此時菌體無法產(chǎn)生信號分子AI-2。結(jié)果說明，在輕度酸脅迫條件下會誘導(dǎo)E. faecium 8-3產(chǎn)生更多的信號分子AI-2，而重度酸脅迫時菌體生長受到嚴(yán)重抑制將無法釋放信號分子AI-2。Moslehi-Jenabian等[13]研究了益生乳桿菌在酸性脅迫條件下菌株的存活率及信號分子AI-2的產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)菌株在逐步適應(yīng)酸性環(huán)境的條件下存活率要高于直接進(jìn)行酸處理，信號分子AI-2的產(chǎn)生低于直接進(jìn)行酸脅迫，且信號分子AI-2產(chǎn)量均隨pH值的不斷下降而增加，但是卻未對堿性條件下菌株的生長和信號分子AI-2的產(chǎn)生進(jìn)行研究。

表2 培養(yǎng)基pH值對E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2的影響Table 2 Effect of medium pH on AI-2 production

5.5 6.5（對照組） 7.5 8.5 pH aa a bc c ab b b luxS基因pfs基因同一基因不同字母表示差異顯著（P＜0.05），圖4、6、8同。

由圖2可知，E. faecium 8-3 luxS基因的表達(dá)量在pH 5.5時最高，pH 8.5時表達(dá)量最低；pfs基因表達(dá)量隨pH值的升高而降低。在酸性條件下，信號分子AI-2產(chǎn)量增加，luxS和pfs基因表達(dá)量均有所增加。但是在堿性條件下，pH 7.5時luxS基因表達(dá)量與對照組無顯著差異，pH 8.5時luxS基因表達(dá)量顯著低于對照組，而信號分子AI-2產(chǎn)量卻高于對照組，可能因為pH值的增加導(dǎo)致E. faecium 8-3的生長曲線發(fā)生改變，結(jié)合圖1發(fā)現(xiàn)，pH 7.5和pH 8.5時E. faecium 8-3的對數(shù)期均有所提前。L. rhamnosus GG和L. acidophilus NCFM的luxS基因表達(dá)量在酸性脅迫1 h時顯著增加，且不同菌株表達(dá)量存在差異[13]。Rogers等[18]研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌在受到低劑量青霉素刺激時luxS基因會過表達(dá)以進(jìn)行自我保護(hù)。對酸性應(yīng)激反應(yīng)的不同蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，在酸性脅迫期間菌株會誘導(dǎo)各種基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)[19-20]。在變形鏈球菌中，luxS基因參與耐酸性調(diào)節(jié)也已經(jīng)得到證實(shí)[21]。L. rhamnosus GG的luxS基因缺失株在模擬胃液中的存活率下降進(jìn)而導(dǎo)致在小鼠體內(nèi)的耐受性降低，這表明luxS基因在L. rhamnosus GG中對胃應(yīng)激的過程具有關(guān)鍵作用[22]。

2.2 溫度脅迫對E. faecium 8-3 LuxS/AI-2 QS的影響

圖3 培養(yǎng)溫度對E. faecium 8-3菌體密度的影響Fig. 3 Effect of culture temperature on optical density of E. faecium 8-3

由圖3可知，E. faecium 8-3在23、30 ℃培養(yǎng)時生長能力顯著低于對照組，且在23 ℃時生長最為緩慢；在44 ℃培養(yǎng)時4～7 h生長速度大于對照組，10～25 h低于對照組，說明E. faecium 8-3的最適生長溫度為37 ℃。

表3 培養(yǎng)溫度對E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2的影響Table 3 Effect of culture temperature on AI-2 production

由表3可知，在4～7 h E. faecium 8-3在23、30 ℃培養(yǎng)時信號分子AI-2產(chǎn)量低于對照組，說明隨著培養(yǎng)溫度的下降，E. faecium 8-3在生長初期信號分子AI-2產(chǎn)量會隨著菌體生長被抑制而顯著降低；在44 ℃培養(yǎng)時，信號分子AI-2產(chǎn)量僅在13 h和25 h顯著低于對照組，其他時間與對照組無顯著差異，這可能是因為菌體在37 ℃和44 ℃生長菌體密度相近，導(dǎo)致信號分子AI-2產(chǎn)量無顯著差異。在對4 株乳酸桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)，25 ℃培養(yǎng)時L. rhamnosus GG、L. rhamnosus BFE5264以及L. plantarum 299v的信號分子AI-2產(chǎn)量下降，而L. plantarum NR74的信號分子AI-2反而顯著增加；在43 ℃和50 ℃培養(yǎng)時，L. rhamnosus GG信號分子AI-2產(chǎn)量顯著增加，L. plantarum NR74的信號分子AI-2反而顯著降低，其他菌株出現(xiàn)抑制或促進(jìn)作用，這說明信號分子AI-2對于溫度的反應(yīng)具有菌株特異性[23]。

圖4 培養(yǎng)溫度對E. faecium 8-3 luxS和pfs基因表達(dá)量的影響Fig. 4 Effect of culture temperature on the expression of luxS and pfs genes in E. faecium 8-3

由圖4可知，E. faecium 8-3的luxS和pfs基因表達(dá)量在23、30、44 ℃培養(yǎng)時顯著高于對照組，其中在23 ℃時表達(dá)量最高，說明溫度脅迫會誘導(dǎo)luxS和pfs基因的表達(dá)量增加，且低溫脅迫對于信號分子AI-2的影響要大于高溫脅迫。有研究顯示，菌株的不同生長階段luxS基因的表達(dá)存在差異[24]，溫度脅迫下改變了菌株的生長階段，從而引起基因表達(dá)量的變化，同時，信號分子在培養(yǎng)環(huán)境中存在積累的過程，所以基因表達(dá)和信號分子AI-2的產(chǎn)生存在一定差異。

2.3 滲透壓脅迫對E. faecium 8-3 LuxS/AI-2 QS的影響

圖5 滲透壓對E. faecium 8-3菌體密度的影響Fig. 5 Effect of osmotic pressure on optical density of E. faecium 8-3

由圖5可知，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，培養(yǎng)基的滲透壓也不斷增大，菌體的生長會受到不同程度的抑制。同時，菌體在生長過程中到達(dá)穩(wěn)定期的時間也隨之延長，實(shí)驗組的菌體密度顯著小于對照組，且在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%時菌體密度最小。

由表4可知，對照組信號分子AI-2的相對熒光強(qiáng)度最大值為58.25，處理組1.5%、3.0%、4.5%信號分子AI-2的相對熒光強(qiáng)度最大值分別為55.62、39.62、37.31，說明隨著滲透壓的不斷增大，E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2受到抑制。同時結(jié)合圖5可知，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%和4.5%時培養(yǎng)菌體，菌體生長速度減慢，進(jìn)入穩(wěn)定期的時間延長，可能導(dǎo)致了信號分子AI-2產(chǎn)生速度的降低。說明在滲透壓脅迫的條件下，E. faecium 8-3生長受到抑制的同時信號分子AI-2的產(chǎn)生也會受到抑制。而在Yeo等[23]的研究中發(fā)現(xiàn)，4 株乳酸桿菌的信號分子AI-2產(chǎn)量均會隨培養(yǎng)基中NaCl含量的增加而增加。這可能是因為菌株之間對于滲透壓的耐受作用具有差異性。在黏質(zhì)沙雷氏菌的培養(yǎng)基中添加少量硼酸會誘導(dǎo)信號分子AI-2的合成，而增大硼酸的添加計量會抑制其生長同時減少信號分子AI-2的產(chǎn)生[25]，在對肺炎克雷伯菌的研究中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果[26-27]，這說明添加物的不同添加量對菌株信號分子AI-2也存在差異影響。

表4 培養(yǎng)基滲透壓對E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2的影響Table 4 Effect of osmotic pressure on AI-2 production

圖6 滲透壓對E. faecium 8-3 luxS和pfs基因表達(dá)量的影響Fig. 6 Effect of osmotic pressure on the expression of luxS and pfs genes in E. faecium 8-3

由圖6可知，E. faecium 8-3的luxS基因表達(dá)量在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時，顯著低于對照組和其他實(shí)驗組，且在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%時表達(dá)量最大。pfs基因表達(dá)量在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時和對照組無顯著差異且顯著低于其他實(shí)驗組，同時在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5%時表達(dá)量最大，說明在低濃度NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)時，滲透壓對于luxS和pfs基因表達(dá)量的影響比較小，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，培養(yǎng)基滲透壓不斷增加進(jìn)而誘導(dǎo)luxS和pfs基因表達(dá)量升高，說明luxS和pfs基因在菌體抗高滲透壓脅迫的過程中發(fā)揮作用。

2.4 營養(yǎng)脅迫對E. faecium 8-3 LuxS/AI-2 QS的影響

圖7 營養(yǎng)脅迫對E. faecium 8-3菌體密度的影響Fig. 7 Effect of nutritional stress on optical density of E. faecium 8-3

由圖7可知，隨著MRS培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)的降低，菌體生長受到影響，在培養(yǎng)末期培養(yǎng)基稀釋度越大，抑制作用越顯著且在MRS培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)稀釋至20%時菌體的生長能力最弱。

表5 營養(yǎng)脅迫對E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2的影響Table 5 Effect of nutritional stress on AI-2 production

由表5可知，培養(yǎng)7 h后E. faecium 8-3在培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)為20%時信號分子AI-2產(chǎn)量最高，顯著高于其他實(shí)驗組和對照組。在培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)為40%時，信號分子AI-2產(chǎn)量顯著高于在60%、80%、100% MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)為60%和80%的條件下培養(yǎng)，E. faecium 8-3的信號分子AI-2產(chǎn)量與對照組幾乎無顯著差異。結(jié)果說明，在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的條件下，低營養(yǎng)脅迫才是誘導(dǎo)E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2的主要因素。以添加2%半乳糖作為對照培養(yǎng)乳酸桿菌發(fā)現(xiàn)，半乳糖添加量為0%、0.5%和1%時L. rhamnosus BFE5264、L. plantarum 299v以及L. plantarum NR74的信號分子AI-2產(chǎn)量會顯著增加，且L. plantarum 299v和L. plantarum NR74信號分子AI-2隨半乳糖濃度的減少而顯著增加[23]。不同碳源（葡萄糖、蔗糖、甘油）對于黏質(zhì)沙雷氏菌的生長沒有影響，但是對信號分子AI-2卻不同，在以葡萄糖為碳源時菌體信號分子AI-2的產(chǎn)生在對數(shù)中期達(dá)到最大值，同時，隨著葡萄糖濃度的降低信號分子AI-2產(chǎn)量也隨之下降[25]。

由圖8可知，E. faecium 8-3的luxS基因在MRS培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)為20%時的表達(dá)量與對照組無顯著差異，其他實(shí)驗組luxS基因的表達(dá)量均顯著大于對照組，而實(shí)驗組pfs基因的表達(dá)量除MRS培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)為80%組外均低于對照組，結(jié)果說明在低營養(yǎng)脅迫的條件下會誘導(dǎo)luxS基因的過表達(dá)。He Zhiyan等[29]研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌生物膜的形成隨培養(yǎng)基中葡萄糖添加量的增加而增加，同時，糞腸球菌luxS基因缺失株的生長速率不變但生物膜形成能力、細(xì)胞表面疏水性以及生物膜形成相關(guān)基因表達(dá)量均升高。同時，在對Streptococcus mutans的luxS基因研究中也有類似的結(jié)果[30]。Riemerella anatipestifer基因組中缺乏luxS基因，含有pfs基因，但是卻不能夠合成信號分子AI-2，而R. anatipestifer的pfs基因可以恢復(fù)avian pathogenic Escherichia coli（APEC）pfs基因缺失株合成信號分子AI-2的能力，說明pfs基因具有合成信號分子AI-2的功能[31]。

2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 20 40 60 80 100（對照組）MRS培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)/%表達(dá)量a a c bc acd b db b luxS基因 pfs基因

信號分子AI-2與菌體的具體應(yīng)激過程直接相關(guān)，即使不考慮腸道微生態(tài)環(huán)境，在標(biāo)準(zhǔn)生長條件和環(huán)境脅迫下菌株信號分子AI-2的作用也截然不同[28]。信號分子AI-2是LuxS和Pfs蛋白催化SAH進(jìn)行甲基循環(huán)的副產(chǎn)物，但是在Streptococcus suis中過量表達(dá)的luxS基因卻不能引起pfs基因的高表達(dá)和信號分子AI-2的過量合成，相反，導(dǎo)致了菌體生長速率減慢，這說明在S. suis中信號分子AI-2的產(chǎn)生與luxS基因的轉(zhuǎn)錄沒有對應(yīng)性，pfs基因的轉(zhuǎn)錄可能與信號分子AI-2的產(chǎn)生有關(guān)[32]。但是，在Serratia plymuthica和Edwardsiella tarda中l(wèi)uxS基因過表達(dá)卻可以使信號分子AI-2活性增強(qiáng)[33-34]。這可能是因為在不同菌株中l(wèi)uxS和pfs基因參與甲基代謝的過程存在差異，信號分子AI-2的合成與二者的轉(zhuǎn)錄存在聯(lián)系，但是卻并非是一一對應(yīng)的關(guān)系。

3 結(jié) 論

E. faecium 8-3通過信號分子AI-2介導(dǎo)的QS系統(tǒng)調(diào)控菌體適應(yīng)環(huán)境脅迫的過程。輕度酸性脅迫條件會誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生信號分子AI-2，而在堿性脅迫條件下菌體生長旺盛，介導(dǎo)信號分子AI-2產(chǎn)生的主要因素是菌體密度；在滲透壓脅迫時，E. faecium 8-3的生長隨滲透壓增大受到抑制，信號分子AI-2的產(chǎn)生也隨菌體密度的降低而減少；低溫脅迫時，E. faecium 8-3菌體密度減少，信號分子AI-2的產(chǎn)生也同時受到抑制，溫度脅迫影響了菌體密度進(jìn)而調(diào)控信號分子AI-2的產(chǎn)生；低營養(yǎng)脅迫可以誘導(dǎo)E. faecium 8-3產(chǎn)信號分子AI-2。不同環(huán)境脅迫條件下E.faecium 8-3的luxS和pfs基因表達(dá)量均有不同程度的變化，說明菌體在不同環(huán)境脅迫生長時luxS和pfs基因參與菌體的代謝，結(jié)合信號分子AI-2的變化進(jìn)一步說明LuxS/AI-2 QS系統(tǒng)參與E. faecium 8-3的抗逆過程。

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