吉林不同產(chǎn)地哈蟆油中膽甾-5-烯-3--醇的含量測(cè)定及比較

崔慶艷，劉敏，倪樹(shù)玲，肖瑤，周艷，王永生

（吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130021）

哈蟆油（Oviductus ranae）是中國(guó)林蛙（Ranatemporaria chensinensis David）雌蛙的干燥輸卵管，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)陰潤(rùn)肺之功效，常用于病后體弱、神疲乏力、心悸失眠、盜汗、癆嗽咳血[1]。哈蟆油主產(chǎn)于吉林、遼寧、黑龍江三省，而吉林省哈蟆油以其量大、質(zhì)優(yōu)而聞名遐邇[2]。膽甾-5-烯-3--醇是哈蟆油中一種重要的甾體類成分[3]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立測(cè)定哈蟆油中膽甾-5-烯-3--醇含量的方法，可以為哈蟆油的質(zhì)量控制提供依據(jù)，進(jìn)一步完善哈蟆油的質(zhì)量控制體系。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Sartorious天平（1/100000，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；KQ-400KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；F2100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

哈蟆油樣品，購(gòu)自吉林省延吉市、通化市、白山市、樺甸市，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院姜大成教授鑒定為蛙科動(dòng)物中國(guó)林蛙（Rana temporaria chensinensis David）的輸卵管干制品。膽甾-5-烯-3--醇對(duì)照品（批號(hào)：111618-200301，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇、二氯甲烷均為分析純；乙腈為色譜純；水為超純水。

2 方法[4]

2.1 色譜條件[5]

色 譜 柱：COSMOSIL Packed Column Choleste（4.6mm 250.0mm，5m）；流動(dòng)相：乙腈-水，采用梯度洗脫（0min～28min，V乙腈∶V水＝ 85∶15；28.01min～70min，乙腈比例為 100%）；流速：2.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20L。采用此方法分離保留時(shí)間適宜，分離度大于1.5，理論板數(shù)均在7 000以上，且陰性無(wú)干擾。膽甾-5-烯-3--醇對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1，哈蟆油樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 膽甾-5-烯-3-醇對(duì)照品色譜圖Fig.1 Cholest-5-ene-3--ol reference substance chromatogram

圖2 哈蟆油樣品色譜圖Fig.2 Oviductus Ranae samples chromatogram

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取膽甾-5-烯-3--醇對(duì)照品適量，加甲醇配制成4.12 103g/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取哈蟆油樣品粉末（過(guò)60目篩）2.0g，精密稱定，加入二氯甲烷 40mL，超聲（400W 40KHz）提取30min，濾過(guò)，重復(fù)提取3次，合并濾液，減壓蒸干溶劑。加入甲醇定容至2mL量瓶中，混勻，過(guò)0.22m濾膜，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察

圖3 膽甾-5-烯-3--醇對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of Cholest-5-ene-3-beta-alcohol control

3.2 精密度試驗(yàn)

3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次哈蟆油6份，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液20L，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得RSD值為1.42%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

3.5 加樣回收試驗(yàn)

稱取6份已測(cè)得膽甾-5-烯-3--醇含量的哈蟆油樣品約0.2g，精密稱定，加入膽甾-5-烯-3--醇對(duì)照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為103.7%，RSD 值為 3.67%（n=6），結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Experimental results of recovery

3.6 樣品的含量測(cè)定

分別取不同產(chǎn)地、不同批次的哈蟆油樣品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別將對(duì)照品溶液和供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)所測(cè)峰面積計(jì)算各產(chǎn)地不同批次哈蟆油中膽甾-5-烯-3--醇的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 Results of sample determination (g/g)

從表中的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，同一產(chǎn)地不同批次的哈蟆油由于干燥方法或儲(chǔ)藏條件不同，樣品中膽甾-5-烯-3--醇的含量有輕微差異。以上地區(qū)是吉林省哈蟆油的主要產(chǎn)地，延吉地區(qū)哈蟆油中膽甾-5-烯-3--醇的含量最高，通化地區(qū)的含量相對(duì)較低。

4 討論

4.1 考察了不同提取溶劑和提取方法對(duì)提取效率的影響。分別用石油醚、二氯甲烷、乙醚、丙酮為提取溶劑來(lái)提取哈蟆油中的膽甾-5-烯-3--醇發(fā)現(xiàn)，以二氯甲烷為提取溶劑時(shí)，膽甾-5-烯-3--醇的提取效率最大。分別用超聲提取、加熱回流提取方式提取膽甾-5-烯-3--醇發(fā)現(xiàn)，這2種提取方式對(duì)哈蟆油中的膽甾-5-烯-3--醇的提取效率影響不大，故應(yīng)采用更為簡(jiǎn)單的超聲提取法[6]。

4.2 考察了不同比例的流動(dòng)相乙腈-水（95∶5、90∶10、85∶15、80∶20）發(fā)現(xiàn)，乙腈-水比例為85∶15可以使膽甾-5-烯-3--醇與其他物質(zhì)完全分離，并且保留時(shí)間適宜[7]。紫外檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，膽甾-5-烯-3--醇在200nm～300nm內(nèi)均有吸收，且在205nm處有最大吸收，故選擇205nm作為其檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.3 哈蟆油是一種具有“軟黃金”之稱的傳統(tǒng)珍貴藥材[8]，目前市場(chǎng)上哈蟆油質(zhì)量參差不齊，優(yōu)劣各異[9]。膽甾-5-烯-3--醇是哈蟆油中一種具有重要藥效的物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定此物質(zhì)的含量，可作為評(píng)價(jià)哈蟆油質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。為進(jìn)一步完善哈蟆油的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了可靠的理論依據(jù)和可行的檢測(cè)方法。

4.4 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，建立一種測(cè)定哈蟆油中膽甾-5-烯-3--醇含量的方法，且該方法簡(jiǎn)單可行，能準(zhǔn)確快速地測(cè)定樣品中膽甾-5-烯-3--醇的含量。利用該方法比較哈蟆油的質(zhì)量差異，為哈蟆油的質(zhì)量鑒別、進(jìn)一步完善哈蟆油的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供依據(jù)。

[1]田春雨.哈蟆油營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值的比較研究[D].長(zhǎng)春:長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，2007.

[2]李宜平，張晉綱，劉淼，等.哈蟆油動(dòng)物基原問(wèn)題探討[J].中國(guó)中藥雜志，2003，28(1):19-21.

[3]姜大成，肖井雷.名貴中藥哈蟆油質(zhì)量評(píng)價(jià)的初步研究[J]吉林中醫(yī)藥，2010，30(5):429-432.

[4]王永生，徐陽(yáng)，陳冰，等.HPLC測(cè)定哈蟆油中4-膽甾烯-3-酮及膽固醇含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(8):76-78.

[5]徐陽(yáng).哈蟆油化學(xué)成分的研究[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2016.

[6]王微，鄭飛，李霞，等.哈蟆油中免疫活性部位的提取工藝與藥效學(xué)研究[J].中國(guó)藥房，2012，23(27):2516-2519.

[7]王永生，曹玉恒，王哲，等.HPLC測(cè)定哈蟆油中膽固醇含量的研究[J].中成藥，2008，30(9):1402-1404.

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[9]陳麗娟，時(shí)坤，李健明，等.哈蟆油質(zhì)量控制體系研究進(jìn)展[J].中藥材，2011，34(5):820-823.