微泡破壞及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療犬急性心肌梗死模型的有效性

柳淑云 常學(xué)鋒 劉旭光

(北京市昌平區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科，北京 102208)

急性心肌梗死(AMI)是急性危重癥疾病。心肌細(xì)胞減少和缺血缺氧是導(dǎo)致心肌梗死晚期出現(xiàn)難治性心力衰竭等癥狀的主要因素。因此，增加有活性的心肌細(xì)胞數(shù)量是病因上治療心肌梗死的關(guān)鍵。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)能夠分化為心肌組織和血管，減輕心室重構(gòu)〔1〕。而且，最近的臨床試驗(yàn)表明，移植的異體BMSCs與自體BMSCs同樣可以安全有效地用于心肌細(xì)胞再生〔2〕。因此，BMSCs的移植為AMI的治療提供了希望。

1 材料和方法

1.1試劑 DAB顯色酶底物試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。 小鼠單克隆抗BrdU抗體購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司。 L-DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司；Percoll分離液(1.073 g/ml)、CD34和CD44兔單克隆抗體、2.5 mm×15 mm OTW球囊，購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2動(dòng)物 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得24只健康比格犬，雌雄各半，體重16.0～17.5 kg。

1.3BMSCs 準(zhǔn)備 取骨髓：將犬以5%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔麻醉后，用20 ml注射器穿刺抽取犬肱骨骨髓10 ml，加入等體積肝素。離心純化BMSCs，獲得的單核細(xì)胞在直徑100 mm的培養(yǎng)皿中接種，培養(yǎng)液內(nèi)含20%磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.1 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的L-DMEM。在37.0℃，5%CO2下培養(yǎng)。 過(guò)24 h更換培養(yǎng)基。細(xì)胞生長(zhǎng)至68%以上時(shí)，細(xì)胞以1∶3的比例傳代，48 h更換一次培養(yǎng)基。 用第三代細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，MTT比色檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律。通過(guò)CD34和CD44陽(yáng)性細(xì)胞的免疫組化染色鑒定BMSCs。在移植前24 h，加入10 μl BrdU標(biāo)記液以標(biāo)記BMSCs。

1.4犬AMI模型的制作 禁食8 h后，3%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。以Sedinger技術(shù)穿刺右側(cè)股動(dòng)脈，置入6 F鞘管。將6 F導(dǎo)管(造影)，自犬右股動(dòng)脈置入至主動(dòng)脈根部，注入適量造影劑優(yōu)維顯，顯示左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)。用BMW導(dǎo)絲推送6F OTW球囊導(dǎo)管至LAD遠(yuǎn)端，使之達(dá)第一間隔支和第二間隔支之間，抽除導(dǎo)絲，注入適量造影劑優(yōu)維顯，以4～6 amt充盈球囊堵塞LAD 4 h后撤除氣囊，造模完畢。

1.5分組 模型成功7 d后，將狗隨機(jī)分為4組，每組6只，雌雄各半。(1)PBS組：5 ml生理鹽水沖洗后，用OTW球囊將LAD開(kāi)口完全堵塞，然后自中心腔由遠(yuǎn)及近于2 min內(nèi)注射PBS。(2)微泡+PBS組：LAD開(kāi)口，給予超聲輻射：經(jīng)股靜脈應(yīng)用微量泵以1.5 ml/min勻速緩慢靜脈注射2.0 ml聲諾維，同時(shí)啟動(dòng)超聲。超聲探頭固定于犬心臟左室乳頭肌水平，觀看短軸切面圖；時(shí)間觸發(fā)模式，觸發(fā)脈沖持續(xù)時(shí)間2 ms，幀頻(FPS)為0.48，觸發(fā)時(shí)間間隔2 s，機(jī)械指數(shù)(MI)1.33，作用時(shí)間11 min，深度9～10 cm，強(qiáng)度為1.1 W/cm2，頻率為1.2 MHz，其后操作同PBS組。(3)BMSCs組：以BMSCs取代PBS，余操作同PBS組。(4)微泡+BMSCs組：以BMSCs取代PBS，余操作同微泡+PBS組。

1.6觀察指標(biāo) (1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特性、數(shù)目及鑒定；(2)BMSCs的體外免疫組化標(biāo)記；(3)造模時(shí)在指引導(dǎo)管內(nèi)通過(guò)注入適量造影劑，查看其在氣囊近端是否受阻，以清楚血流有無(wú)阻斷情況；(4)M型超聲、二維超聲心動(dòng)圖及心肌聲學(xué)造影(MCE)測(cè)量心功能、灌注缺損面積占左室總灌注面積的百分比(DA)：MCE測(cè)量DA；M型超聲測(cè)量心功能，包括左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、舒張末期容積(EDV)、收縮末期容積(ESV)、室壁增厚率(D)、短軸縮短率(FS)、室壁運(yùn)動(dòng)異常指數(shù)(WMSI)。造模前及造模后4 h、梗死相關(guān)冠狀動(dòng)脈再通后，分別進(jìn)行心肌造影。選擇每次造影心肌顯影達(dá)平臺(tái)時(shí)灌注缺損面積最小的圖像，應(yīng)用Matlab軟件計(jì)算DA%。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件，多組計(jì)量資料比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)特性、數(shù)目及鑒定 原代培養(yǎng)BMSCs約12 h貼壁，一般3～4 d可以傳代一次。第2代細(xì)胞形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主；傳代后呈漩渦生長(zhǎng)(圖1)。MTT細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析，培養(yǎng)第1、2、3代細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律基本一致，首先經(jīng)過(guò)1～2 d滯留期，第3天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第7天達(dá)到平臺(tái)期，此時(shí)細(xì)胞數(shù)目不再增加(圖2)，可行傳代。1 w后獲得BMSCs數(shù)量為1×107個(gè)，3 w后傳代2次，從第3代細(xì)胞中可以獲得足夠數(shù)量的BMSCs：107個(gè)/盤，共24盤。

圖1 第3代細(xì)胞(×100)

圖2 MTT分析各代培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.2培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定 CD34、CD44免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示表面抗原CD34呈陰性表達(dá)，CD44呈陽(yáng)性表達(dá)(圖3)，這是BMSCs的特異標(biāo)志。

2.3BMSCs的體外免疫組化標(biāo)記 在BrdU 摻入BMSCs 24 h后進(jìn)行免疫組化染色，細(xì)胞核染為棕褐色，證明 BrdU 已經(jīng)摻入細(xì)胞核中(圖4)。

2.4造模成功 冠狀動(dòng)脈造影顯示LAD動(dòng)脈閉塞。阻塞部位為第一、二間隔支之間，其遠(yuǎn)端再無(wú)造影劑顯示，血流中斷，證實(shí)AMI模型建立成功(圖5)。MCE同步心電圖導(dǎo)聯(lián)V1表現(xiàn)出特征性AMI變化，包括弓背向上抬高的ST段與直立的T波連接以形成單個(gè)曲線和病理Q波(圖6)。

2.5心功能和DA%的測(cè)量 各組造模后4 h心臟功能顯著降低，DA%顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)BMSCs的表面抗原(DAB染色，×200)

圖4 BMSCs的體外免疫組化染色(DAB染色，×200)

圖5 封堵前降支

圖6 特征性AMI變化

表1 各組EDV、LVEF、FS、D、WMSI和DA測(cè)量結(jié)果

與造模前比較：1)P<0.05

3 討 論

通常AMI治療包括藥物治療和手術(shù)治療，主要手術(shù)方法包括冠狀動(dòng)脈內(nèi)植入支架和冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)植入。盡管這些治療方法在挽救和改善患者生活質(zhì)量方面取得了成功，但沒(méi)有取代梗死區(qū)丟失的組織，即沒(méi)有從根本上解決問(wèn)題。由于心臟的再生能力很低，需要新的治療方法，以便在細(xì)胞和分子水平上培育新的組織并治愈心臟〔3〕。

將足夠的BMSCs安全、準(zhǔn)確地歸巢到梗死區(qū)是從根本上治療AMI的關(guān)鍵。通過(guò)同軸整體交換型OTW導(dǎo)管經(jīng)梗死相關(guān)冠狀動(dòng)脈移植的BMSCs不僅定位準(zhǔn)確，而且風(fēng)險(xiǎn)較低，易于操作；診斷超聲介導(dǎo)的微泡破壞可以增加血管通透性，促進(jìn)BMSCs歸巢到心肌梗死區(qū)〔4～6〕。為此，本文建立了犬AMI模型，驗(yàn)證冠狀動(dòng)脈內(nèi)移植和超聲介導(dǎo)的微泡破壞的組合是否可以促進(jìn)BMSCs準(zhǔn)確和有效率地移植到梗死區(qū)。

本研究結(jié)果表明，BMSCs的移植促進(jìn)BMSCs在心肌內(nèi)存活，提高α-肌動(dòng)蛋白表達(dá)，增加了能夠有效收縮的心肌細(xì)胞數(shù)量，減少了心肌梗死面積和灌注缺陷面積，心臟功能得到了有效改善。

心肌梗死發(fā)生后病變局部的微環(huán)境是細(xì)胞存活的最關(guān)鍵因素，他將影響移植細(xì)胞的黏附，遷移和定植能力及長(zhǎng)期存活〔7〕。因此選擇合適的移植時(shí)機(jī)非常重要。Gehrke等〔8〕發(fā)現(xiàn)在心肌梗死后第7天，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的分泌達(dá)到高峰，可能此時(shí)為移植細(xì)胞提供最充分的血供，且在心肌梗死7～15 d，纖維組織開(kāi)始生成，炎癥反應(yīng)較前減弱，可能此時(shí)對(duì)心肌的損害降至最低，此時(shí)移植細(xì)胞容易存活。

本研究結(jié)果也證實(shí)了BMSCs移植后能夠存活和分化，這為心肌梗死的干細(xì)胞臨床治療提供了借鑒。

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7Wang J,de Veirman K,de Beule N,etal.The bone marrow microenvironment enhances multiple myeloma progression by exosome-mediated activation of myeloid-derived suppressor cells〔J〕.Oncotarget,2015;6(41):43992-4004.

8Gehrke I,Gandhirajan RK,Poll-Wolbeck SJ,etal.Bone marrow stromal cell-derived vascular endothelial growth factor (VEGF) rather than chronic lymphocytic leukemia (CLL) cell-derived VEGF is essential for the apoptotic resistance of cultured CLL cells〔J〕.Mol Med,2011;17(7-8):619-27.