土壤類型對(duì)虎耳草光合特性及藥用成分含量的影響

賀安娜，楊 曦，梁 娟，2，周 婉，印麗娟

(1．懷化學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，湖南 懷化 418000；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湘西藥用植物與民族植物學(xué)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化 418000)

虎耳草(Saxifragastolonifera)為虎耳草科(Saxifragaceae)多年生草本植物，又名石荷葉、老虎耳等[1]，該草起源于北溫帶[2]，我國(guó)主要分布于華東、中南、西南各省區(qū)。民間以全草入藥，具有祛風(fēng)、清熱、解毒等功效[3]，較高含量的沒(méi)食子酸和巖白菜素是其發(fā)揮藥效的主要次生代謝產(chǎn)物[4]。有研究表明，虎耳草中主要活性成分沒(méi)食子酸等有機(jī)酸類，具有一定的抗雄性激素作用，可調(diào)控前列腺細(xì)胞的生長(zhǎng)與凋亡[5]，有抑制前列腺癌的作用[6]。作為開發(fā)利用前景很好的虎耳草，人工栽培方面報(bào)道尚少，本課題組對(duì)虎耳草不同光溫處理下虎耳草的光合特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同溫度處理下，沒(méi)食子酸含量與光合速率及蒸騰速率呈極顯著正相關(guān)[7]。

虎耳草分布廣泛，常生于森林邊緣、巖坡石隙[8]，其原生境的土壤類型也較豐富，常著生在薄腐殖質(zhì)層的巖石上，森林邊緣的暗棕色土壤也可見其生長(zhǎng)，筆者收集資源實(shí)地考察時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同土壤生境下虎耳草株葉形態(tài)有很大差異。這種差異與土壤的物理及化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，有研究表明，土壤的養(yǎng)分不僅影響植物直接的光合作用及生長(zhǎng)發(fā)育[9]，也影響次生代謝產(chǎn)物的形成，從而影響藥材品質(zhì)[10]。人工種植虎耳草常在單一的土壤類型上進(jìn)行，選擇合適的土壤條件對(duì)虎耳草的人工栽培非常重要，本文考慮虎耳草原生境土壤條件及南方的主要種植土類型，選取了黑色腐殖土、暗棕色粘性土和棕黃色粘性土3種不同種植土壤，研究不同土壤類型種植條件下虎耳草光合特性及藥用成分的差異，旨在為虎耳草人工種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料虎耳草來(lái)源于懷化學(xué)院生物園，經(jīng)曾漢元教授鑒定為S.stolonifera。2014年1月選取黑色腐殖土(南方混交林下腐殖土壤)、暗棕色粘性土(南方主要種植土壤)和棕黃色粘性土(南方山地土壤)，去表層后，取土深0～15 cm左右，分別做成80 cm×100 cm的土壤樣方，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每種土壤類型重復(fù)3次。選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的虎耳草為材料，在每個(gè)樣方上各種植20株，行株距為20 cm×20 cm?；⒍轂殛幧参铮鶕?jù)前期研究結(jié)果[11]，用一層黑色遮蔭網(wǎng)(透光率50%)進(jìn)行遮蔭處理，遮蔭網(wǎng)設(shè)在離地面1.5 m高處。2014年4月，開始測(cè)定各項(xiàng)數(shù)據(jù)。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

材料種植前用5點(diǎn)法取5～10 cm土層土壤，pH值采用2.5 ∶1 的水土比，用pH計(jì)測(cè)定；環(huán)刀取樣稱重，測(cè)定最大持水量；有機(jī)質(zhì)測(cè)定采用重鉻酸鉀容量法；堿解氮采用堿解蒸餾法測(cè)定；有效磷采用NaHCO3浸提-鉬藍(lán)比色法測(cè)定；速效鉀采用NH4OAc浸提-火焰光度法測(cè)定。

1.2.2 虎耳草氣體交換測(cè)定

虎耳草葉片的氣體交換采用LI-6400便攜式光合儀(美國(guó))測(cè)定，瞬時(shí)氣體交換測(cè)定選擇晴天的9:00進(jìn)行，采用自然光照，每個(gè)土壤類型測(cè)10片葉。光響應(yīng)曲線的測(cè)定利用儀器自帶程序，于晴天9:00～11:00進(jìn)行，溫度、CO2濃度等環(huán)境因子采用自然條件。光量子密度(PPED)設(shè)為2 000、1 800、1 500、1 200、1 000、800、600、400、200、150、100、50、20、0 μmol·m-2·s-1，由儀器配備的紅藍(lán)光源(6400-02B LED光源)產(chǎn)生，根據(jù)Pn-PPED曲線的初始斜率(PPED < 250 μmol·m-2·s-1)計(jì)算表觀量子效率(AQY)。參照Bassman和Zwier的方法[12]計(jì)算光飽和點(diǎn)、光補(bǔ)償點(diǎn)及最大光合速率。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

用錫箔紙包裹好葉片，使葉片經(jīng)30 min暗適應(yīng)，取下錫箔紙的同時(shí)迅速將葉片置于LI-COR 6400-40葉綠素?zé)晒馊~室中，測(cè)定原初熒光(F0)及暗中最大熒光(Fm)。打開葉室，將葉片置于光下活化30 min，設(shè)定儀器活化光，測(cè)穩(wěn)態(tài)熒光產(chǎn)量(Fs)、最大熒光(Fm′)及最小熒光(F0′)。通過(guò)公式計(jì)算：qP=(Fm′-Fs)/(Fm′-F0′)；qN=(Fm-Fm′)/(Fm-F0)；ΦPSⅡ=(Fm′-Fs)/Fm′；ETR=PPFD × ΦPSⅡ× 0.84 × 0.5。式中，qP為光化學(xué)猝滅系數(shù)， qN為非光化學(xué)猝滅系數(shù)，ΦPSⅡ?yàn)閷?shí)際光化學(xué)反應(yīng)速率，ETR為電子傳遞速率。

1.2.4 沒(méi)食子酸和巖白菜素含量測(cè)定

采集虎耳草全草，洗凈干燥至恒重，粉碎并通過(guò)0.12 mm篩。稱取1.0 g虎耳草粉末，加入甲醇，料液比為1∶25(g∶mL)，超聲波提取35 min，重復(fù)提取1次，合并兩次提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液至約5 mL，再用甲醇定容至25 mL，經(jīng)0.22 μm針孔濾膜過(guò)濾。使用LC-20AT高效液相色譜儀(日本)測(cè)定巖白菜素和沒(méi)食子酸含量，色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)。流動(dòng)相：甲醇-0.1 % 磷酸溶液(73∶29)；流速：1.02 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：272 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。按外標(biāo)法以峰面積積分值計(jì)算巖白菜素和沒(méi)食子酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Excel 2003及SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土壤理化性質(zhì)比較

除黑色腐殖土外，其他兩種土壤的pH值都偏酸(表1)，棕黃色粘性土pH值顯著最低，為6.54；最大持水量也是棕黃色粘性土最低，僅39.3%。黑色腐殖土的有機(jī)質(zhì)含量最高，為17.5%，棕黃色粘性土最低，僅為0.53%，三者差異均達(dá)顯著水平。黑色腐殖土中的堿解氮含量顯著高于其他兩種土壤，為33.2%；有效磷及速效鉀則以暗棕色粘性土最高。

表1 不同土壤的理化性質(zhì)

注：表內(nèi)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3),表5同；同列小寫字母表示0.05水平差異顯著。下同。

2.2 不同土壤種植條件下虎耳草葉片氣體交換參數(shù)比較

3種土壤條件下種植的虎耳草凈光合速率差異顯著(表2)，其中黑色腐殖土種植的虎耳草凈光合速率最高，為5.03 μmol·m-2·s-1，氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率及水分利用率也顯著高于其他兩種土壤。

表2 不同土壤種植條件下虎耳草葉片氣體交換參數(shù)

注：表內(nèi)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=10)。表3、表4同。

光量子密度150 μmol·m-2·s-1以下，3種土壤種植條件下虎耳草葉片光合速率增長(zhǎng)很快，幾乎呈直線(圖1)；光量子密度為1 200 μmol·m-2·s-1以上時(shí)，光合速率趨于平緩。黑色腐殖土種植的虎耳草光合速率一直高于暗棕色粘性土和棕黃色粘性土。

光補(bǔ)償點(diǎn)的高低可以作為判斷植物在低光照強(qiáng)度條件下能否生長(zhǎng)的標(biāo)志，光飽和點(diǎn)反映了植物利用強(qiáng)光的能力。黑色腐殖土種植的虎耳草表觀量子效率顯著最高(表3)，為0.046 μmol·m-2·s-1；3種土壤上種植的虎耳草光補(bǔ)償點(diǎn)差異顯著，依次為：暗棕色粘性土﹥棕黃色粘性土﹥黑色腐殖土，說(shuō)明黑色腐殖土上種植的虎耳草利用弱光能力最強(qiáng)。3種土壤種植的虎耳草光飽和點(diǎn)變化不顯著，但最大凈光合速率差異顯著，其中黑色腐殖土顯著最高，為6.79 μmol·m-2·s-1。

圖1 不同土壤種植條件下虎耳草葉片光合-光強(qiáng)響應(yīng)曲線的比較

2.3 不同土壤種植條件下虎耳草葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)比較

3種土壤種植條件下虎耳草葉片的Fv/Fm值無(wú)顯著差異(表4)，說(shuō)明光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心原初光能轉(zhuǎn)換效率差異不顯著。棕黃色粘性土種植條件下虎耳草葉片的Fv/F0值顯著最低，表明該條件下虎耳草葉片從捕光葉綠素a/b蛋白復(fù)合體(LHCP)到光系統(tǒng)Ⅱ的光能傳遞能力最弱。光化學(xué)猝滅系數(shù)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)兩個(gè)參數(shù)反映葉片對(duì)激發(fā)能的利用情況，黑色腐殖土種植條件下虎耳草葉片的qP值比另兩種土壤顯著要高。

表4 不同土壤種植條件下虎耳草葉綠素?zé)晒鈪?shù)

注：Fv=Fm-F0,為可變熒光；Fv/Fm為PSⅡ光化學(xué)的最大量子產(chǎn)額；Fv/F0是PSⅡ的潛在光化學(xué)活性。

不同土壤種植條件下虎耳草葉片實(shí)際光化學(xué)反應(yīng)速率和電子傳遞效率都有顯著差異，都以黑色腐殖土種植的最高，棕黃色粘性土種植的最低。

2.4 不同土壤種植條件下虎耳草有效成分含量比較

不同土壤條件下種植的虎耳草生物產(chǎn)量有較大差異，黑色腐殖土上種植得到的干重顯著高于其他兩者。沒(méi)食子酸和巖白菜素含量也均有顯著差異，表現(xiàn)為黑色腐殖土上種植的虎耳草沒(méi)食子酸及巖白菜素含量最高，分別為0.821和2.98 mg·g-1(表5)，因此，黑色腐殖土上得到的虎耳草有效成分生物量最高，其次為暗棕色粘性土。

表5 不同土壤種植條件下虎耳草沒(méi)食子酸及巖白菜素含量

2.5 相關(guān)性分析

土壤理化性質(zhì)中，pH值、有機(jī)質(zhì)含量與虎耳草的光合參數(shù)及藥用成分含量顯著或極顯著正相關(guān)(表6)，堿解氮與瞬時(shí)凈光合速率及巖白菜素含量顯著和極顯著正相關(guān)，最大持水量、有效磷、速效鉀與光合參數(shù)及藥用成分含量呈正相關(guān)，其中，最大持水量與巖白菜素含量達(dá)顯著相關(guān)水平，其余未達(dá)顯著水平。不同類型土壤中，土壤有機(jī)質(zhì)含量的增加伴隨著pH值的升高，同樣，有機(jī)質(zhì)含量升高，堿解氮的含量也隨之升高，但與有效磷及速效鉀未呈現(xiàn)這種規(guī)律。

表6 土壤理化性質(zhì)與虎耳草葉片光合參數(shù)及藥用成分含量的相關(guān)系數(shù)

注：*表示顯著相關(guān)(P<0.05)，**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

據(jù)報(bào)道，土壤有機(jī)質(zhì)含量與pH值之間的關(guān)系并不一致，甚至有許多矛盾[13]。本文中選用的3種我國(guó)南方主要種植土壤，其pH值隨有機(jī)質(zhì)含量的增加而升高，這可能與我國(guó)南方的氣候、土壤質(zhì)地及微生物種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量有關(guān)。南方種植地主要為酸性土壤，碳礦化作用弱[14]，有機(jī)質(zhì)含量較低，在微生物對(duì)土壤有機(jī)物的分解過(guò)程中，土壤微團(tuán)聚體含量升高，土壤板結(jié)和通透性得以改善[15]，表現(xiàn)為最大持水量升高；同時(shí)有機(jī)質(zhì)的增加，也改善了土壤的酸堿度，使pH值稍有上升，氮含量也受有機(jī)質(zhì)的驅(qū)動(dòng)而升高[16]，有效磷、速效鉀含量則未呈現(xiàn)該規(guī)律。

植物在不同土壤類型下種植光合作用差異較大[17]。光補(bǔ)償點(diǎn)和光飽和點(diǎn)是植物利用光強(qiáng)能力的重要指標(biāo)。黑色腐殖土上種植的虎耳草最大凈光合速率最高，同時(shí)該處理上種植的虎耳草表觀量子效率最高，光補(bǔ)償點(diǎn)最低，說(shuō)明該土壤上種植的虎耳草對(duì)強(qiáng)光及弱光的利用能力都最強(qiáng)。Fv/F0表示光反應(yīng)中心光系統(tǒng)Ⅱ的潛在活性，通過(guò)測(cè)定虎耳草葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)發(fā)現(xiàn)，黑色腐殖土與暗棕色粘性土的Fv/F0值要顯著高于棕黃色粘性土。光化學(xué)猝滅系數(shù)和非光化學(xué)猝滅系數(shù)兩個(gè)參數(shù)反映葉片對(duì)激發(fā)能的利用情況?；⒍萑~片的qP值在黑色腐殖土下顯著高于其它兩種處理，且虎耳草葉片光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的開放比例最高，虎耳草葉片實(shí)際光化學(xué)反應(yīng)速率和電子傳遞效率都顯著最高。葉綠素?zé)晒鈪?shù)值說(shuō)明黑色腐殖土種植條件下虎耳草葉片光系統(tǒng)Ⅱ反映中心開放程度、光化學(xué)效率最高，電子傳遞速率也最快。

許多研究表明，氮是植物所需營(yíng)養(yǎng)的中心元素和活性元素，氮營(yíng)養(yǎng)是影響植物生長(zhǎng)和次生代謝的重要環(huán)境因素之一，也是葉綠素的組成成分之一，葉片中的氮超過(guò)半數(shù)將分配到葉綠體中參與光合作用[18-19]。但土壤中的氮素含量應(yīng)適宜，高氮對(duì)植物光合作用促進(jìn)減弱，甚至有抑制作用[20]。試驗(yàn)所選擇的3種土壤中，黑色腐殖土的堿解氮含量顯著最高，有效磷和速效鉀的含量則略低于暗棕色粘性土，堿解氮與凈光合速率顯著正相關(guān)，在黑色腐殖土上種植的虎耳草光合作用能力表現(xiàn)最強(qiáng)，說(shuō)明土壤中氮的含量對(duì)虎耳草光合作用的影響更大，且該氮含量在虎耳草適應(yīng)范圍之內(nèi)。不過(guò)，虎耳草的最適氮素水平仍需進(jìn)一步試驗(yàn)探討。

土壤pH值和土壤肥力會(huì)影響植物外觀形態(tài)、物質(zhì)代謝、生長(zhǎng)發(fā)育以及品質(zhì)和產(chǎn)量等方面[21]。種植藥用植物不僅要考慮藥材的生物產(chǎn)量，更要考慮藥材的有效成分含量，即品質(zhì)[22-23]。本試驗(yàn)選取的黑色腐殖土壤中氮素及有機(jī)質(zhì)含量顯著高于其他兩種土壤，筆者觀察發(fā)現(xiàn)，該土壤處理下的虎耳草生長(zhǎng)最好，葉片大而飽滿，顏色翠綠，匍匐莖發(fā)達(dá)，試驗(yàn)測(cè)定產(chǎn)量也顯著最高，有機(jī)質(zhì)含量、堿解氮與虎耳草葉中的藥用成分含量均顯著正相關(guān)。氮素可以促進(jìn)植物地上部分的生長(zhǎng)，獲得高產(chǎn)，但高量氮素也容易造成植株徒長(zhǎng)，對(duì)于根莖類藥材而言還可使經(jīng)濟(jì)效益下降，甚至減產(chǎn)[24]?；⒍菔菧\根植物，具大量匍匐莖，雖用全草入藥，但地下部分產(chǎn)量很低，主要依靠地上的葉入藥。因此，地上部分的長(zhǎng)勢(shì)可直接影響虎耳草的產(chǎn)量。前期研究結(jié)果也顯示，高光合作用有利于虎耳草的生長(zhǎng)發(fā)育及有效成分的積累[7]，本試驗(yàn)中，黑色腐殖土處理下的虎耳草巖白菜素及沒(méi)食子酸含量都顯著最高，該氮素水平及有機(jī)質(zhì)含量對(duì)虎耳草品質(zhì)形成有良好的促進(jìn)作用。

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