中醫(yī)證候的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展與探析＊

何浩強(qiáng)，陳 光，高嘉良，王 階＊＊

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院心血管科 北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院 北京 100029）

證候是中醫(yī)辨證論治的基礎(chǔ)與核心，是中醫(yī)理論的精粹部分。證候研究是中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究、臨床實(shí)踐和現(xiàn)代化進(jìn)程的關(guān)鍵一環(huán)。證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究又是證候研究中必不可少的部分，也是證明中醫(yī)科學(xué)性的重要前提。目前，學(xué)者運(yùn)用傳統(tǒng)中醫(yī)方法并結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，從整體、細(xì)胞、分子等多個(gè)層面，生理、生化、超微結(jié)構(gòu)等多個(gè)方面對(duì)證候生物學(xué)基礎(chǔ)做了相關(guān)探索。尤其在進(jìn)入后基因組時(shí)代之后，有學(xué)者[1]提出中西醫(yī)可能在尋找疾病的共性物質(zhì)基礎(chǔ)時(shí)在基因水平上找到兩者的結(jié)合點(diǎn)，為證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究進(jìn)一步指明方向。目前證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究[2]在分子層面的基本思路是以探索基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組表達(dá)異常及特異代謝組分，探尋證候物質(zhì)基礎(chǔ)—“生物標(biāo)志物群”為目的。其中，轉(zhuǎn)錄組是聯(lián)系基因組與蛋白組的樞紐。研究轉(zhuǎn)錄組不僅可以解讀基因組的功能元件，揭示細(xì)胞或組織的分子成分，也可以理解細(xì)胞、組織生長和疾病發(fā)展的過程[3]，同樣有利于解釋證候—中醫(yī)疾病發(fā)展過程中某一階段的病理概括—的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。近年來，應(yīng)用現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)與方法，中醫(yī)證候在轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究取得一定進(jìn)展，主要集中在轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)，轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)兩個(gè)方面，為總結(jié)其經(jīng)驗(yàn)以促進(jìn)證候轉(zhuǎn)錄組學(xué)的進(jìn)一步研究，現(xiàn)對(duì)相關(guān)國內(nèi)外文獻(xiàn)進(jìn)行如下綜述。

1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)內(nèi)涵及研究方向

轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Transcriptomics）是在整體水平上研究特定階段或生理狀態(tài)下某一細(xì)胞或組織所有基因轉(zhuǎn)錄情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的一門學(xué)科[4]。狹義的轉(zhuǎn)錄組是指編碼蛋白質(zhì)的信使RNA（messenger RNA，mRNA），廣義的轉(zhuǎn)錄組則是指從基因轉(zhuǎn)錄的RNA總和，包括mRNA和非編碼RNA（non-coding RNA,ncNRA）。研究顯示，人體超過93%的基因轉(zhuǎn)錄成RNA，其中只有2%轉(zhuǎn)錄成mRNA，其余為ncRNA[5]，ncRNA在基因調(diào)控中扮演重要的結(jié)構(gòu)和功能角色。根據(jù)功能差異，ncRNA又可分為：①看家非編碼RNA，包括較熟悉的核糖體RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，以及小核RNA、小核仁RNA等；②調(diào)控性非編碼RNA，包括研究較多的微小RNA（microRNA，miRNA），長鏈非編碼RNA（long ncRNA，lncRNA），以及小干擾RNA，PIWI蛋白相互作用RNA等[6-8]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的主要目的包括：對(duì)所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分類；確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)，如起始位點(diǎn)，5′和3′端，剪接形式及其它轉(zhuǎn)錄后修飾等；量化細(xì)胞或組織在發(fā)育過程和不同情況下基因差異表達(dá)的水平。通過轉(zhuǎn)錄組分析，可以揭示基因表達(dá)與生命現(xiàn)象的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)理解機(jī)體發(fā)育和病理生理機(jī)制具有重要作用[3]。目前，轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)成為揭示疾病的基因突變規(guī)律、疾病發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制、發(fā)現(xiàn)致病基因調(diào)控的關(guān)鍵靶點(diǎn)等領(lǐng)域的主要研究手段，廣泛應(yīng)用于疾病預(yù)防、診斷、個(gè)性化治療和預(yù)后等領(lǐng)域[9]。在中醫(yī)藥領(lǐng)域，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)主要應(yīng)用于證候?qū)W研究、中藥復(fù)雜體系研究、中藥材鑒別、以及中藥材活性成分生物合成和調(diào)控研究等方面[10]。在證候研究中，又以探索轉(zhuǎn)錄組能否成為證候診斷、分型、干預(yù)生物標(biāo)志物可能性為主要內(nèi)容。近期，有學(xué)者提出病證結(jié)合的生物標(biāo)志物研究思路與方法，為中醫(yī)證候轉(zhuǎn)錄組研究提供了新的啟發(fā)[11]。

2 中醫(yī)證候轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的相關(guān)技術(shù)

2.1 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)，又稱DNA微陣列技術(shù)，即通過將待測(cè)RNA片段逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（complementary DNA），并用熒光標(biāo)記，然后與芯片上已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定，最后通過檢測(cè)樣品熒光信號(hào)強(qiáng)弱測(cè)定基因表達(dá)水平的技術(shù)，包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片[12]等。目前，該技術(shù)主要用于基因表達(dá)譜分析、基因突變及基因多態(tài)性表達(dá)譜分析、檢測(cè)可變剪接模式等[13,14]，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域則被用于疾病分類診斷，藥理毒理研究，藥物靶點(diǎn)篩選及藥效分析[15-17]?；蛐酒夹g(shù)發(fā)展較為成熟，具有高度平行性、高效性、自動(dòng)化等特點(diǎn)，其優(yōu)勢(shì)在于對(duì)基因表達(dá)水平估計(jì)快速準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)分析軟件及理論成熟[18]，但在新基因檢測(cè)與靈敏度上較測(cè)序技術(shù)差[19-21]。在證候轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方面，主要集中在分析不同證型間的差異基因表達(dá)水平，一般以mRNA、miRNA、lncRNA的差異表達(dá)為研究對(duì)象。

2.2 RNA測(cè)序技術(shù)

RNA測(cè)序技術(shù)，又稱RNA-seq技術(shù)，是將新一代高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于RNA逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上，從而獲得來自不同基因的RNA片段在特定樣本中的含量的技術(shù)，包括Solexa合成測(cè)序技術(shù)、454焦磷酸測(cè)序技術(shù)、SOLiD連接測(cè)序技術(shù)以及單分子測(cè)序技術(shù)等[22]，其過程是將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫，將cDNA隨機(jī)剪切為小片段，在cDNA兩端加上接頭利用高通量測(cè)序儀測(cè)序，將獲得序列通過比對(duì)或從頭組裝形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄譜[3]。目前，該技術(shù)主要用于基因表達(dá)譜分析、RNA結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)變異研究、非編碼區(qū)域功能研究和新基因發(fā)現(xiàn)等[23]，在生物學(xué)研究、臨床研究和藥物研究等領(lǐng)域被廣泛使用[3,24]。RNA-seq是測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展的新時(shí)代產(chǎn)物，具有數(shù)字化信號(hào)、高靈敏度、檢測(cè)范圍廣等特點(diǎn)，其優(yōu)勢(shì)在于無需預(yù)先設(shè)計(jì)探針，可對(duì)任何物種進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，但因測(cè)序產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)尚缺乏成熟的數(shù)據(jù)處理模型以及測(cè)序片段讀長較短是目前的主要挑戰(zhàn)[3]。

3 中醫(yī)證候與轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)研究

證候是疾病發(fā)展過程中某一階段的病理概括[25]，證候的出現(xiàn)必然存在著與形成疾病證候病理變化相應(yīng)的基因結(jié)構(gòu)或功能的改變[11]?，F(xiàn)代研究顯示轉(zhuǎn)錄組與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系[5]，其表達(dá)水平在不同病理和特定狀態(tài)下具有顯著差異。近些年，很多學(xué)者將轉(zhuǎn)錄組學(xué)引入證候研究，通過芯片或測(cè)序技術(shù)觀察和篩選不同證候間差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組，再根據(jù)已有的基因數(shù)據(jù)庫注釋信息，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，歸納其參與的生物過程與信號(hào)通路，試圖發(fā)現(xiàn)證候的生物學(xué)基礎(chǔ)。目前主要在mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA層面做了相關(guān)研究，取得一定進(jìn)展。

3.1 mRNA

mRNA是由DNA模板鏈轉(zhuǎn)錄，攜帶遺傳信息并能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類核糖核酸，其結(jié)構(gòu)包括5′帽子、非編碼區(qū)、編碼區(qū)和3′PolyA尾，除了傳遞遺傳信息，編碼蛋白質(zhì)（肽鏈）功能外[26]，還被發(fā)現(xiàn)是一種競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA），參與基因表達(dá)的調(diào)控[27]。mRNA差異表達(dá)與各系統(tǒng)疾病均存在一定聯(lián)系[28-30]，用于臨床診斷、疾病分型、個(gè)性化治療等方面[30,31]。中醫(yī)證候的mRNA差異表達(dá)研究包括冠心病血瘀證[32]，HIV/AIDS氣陰兩虛和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證[33]，慢性乙型肝炎肝郁脾虛證和脾胃濕熱證[34]等。

陳氏等[32]運(yùn)用AFFX Human Genome U133 Plus 2.0 Array芯片和RT-PCR技術(shù)（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）調(diào)查冠心病血瘀證差異表達(dá)譜，結(jié)果共有107條基因存在差異表達(dá)，上調(diào)基因48條，下調(diào)基因59條，通過GO（Gene Ontology）和信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)其中有14條差異基因和4/15的信號(hào)通路與炎癥、免疫反應(yīng)相關(guān)。張氏等[33]運(yùn)用AFFX Human Genome U133 Plus 2.0 Chips芯片技術(shù)分析HIV/AIDS氣陰兩虛和濕熱內(nèi)蘊(yùn)證基因差異表達(dá)，結(jié)合基因功能分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣陰兩虛證共有113條基因差異表達(dá)（41條上調(diào)，72條下調(diào)），與細(xì)胞活動(dòng)、通訊、蛋白質(zhì)定位、細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)等功能有關(guān)，濕熱內(nèi)蘊(yùn)證共有76條基因差異表達(dá)（14條上調(diào)，62條下調(diào)），與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，以及造血或淋巴器官發(fā)育等功能有關(guān)。范氏等[34]采用Aglient表達(dá)譜芯片篩選慢性乙型肝炎肝郁脾虛證和脾胃濕熱證患者的差異表達(dá)基因，并通過GO、Pathway、Genbank等數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行分析和動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，結(jié)果找到共表達(dá)能力差異最顯著的9個(gè)基因（LOC340508、HIST2H2BE、MPL、FLJ22536、TUBA8、NT5M、EGFL7、PTPRF、TSPAN33），主要涉及免疫反應(yīng)、細(xì)胞生長、DNA損傷、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)等生命過程。

3.2 MiRNA

MiRNA是一類長度為19-23個(gè)核苷酸（nucleotide，nt）的非編碼RNA，具有高度序列保守性、時(shí)序性和組織特異性等特點(diǎn)，以及調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞早期發(fā)育，參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡等生物學(xué)功能。醫(yī)學(xué)研究顯示，miRNA差異表達(dá)在腫瘤、心臟、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病呈現(xiàn)一定規(guī)律，目前被應(yīng)用于疾病診斷，個(gè)性化治療和預(yù)后判斷中[35-37]。一些學(xué)者將其用于證候研究，分析了冠心病血瘀證[38]、高血壓血瘀證[39]、乙型肝炎肝膽濕熱證和肝腎陰虛證[40]、胰腺癌濕熱證[41]miRNA的差異表達(dá)。

王氏等[38]使用Agilent RNA 6000 Nano assay芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證miRNA差異表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p，miR-199a-5p在血瘀證組表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），認(rèn)為其可能成為血瘀證診斷的生物標(biāo)志物。何氏等[39]使用Illumina HiSeq2000測(cè)序和qRT-PCR技術(shù)篩選了高血壓血瘀證相關(guān)miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p和miR-1283在血瘀證組表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），因此認(rèn)為其可能是高血壓病血瘀證形成的特異性相關(guān)miRNA。張氏等[40]使用Agilent Human miRNA microarray V3芯片和qRT-PCR技術(shù)，分析了慢性乙型肝炎肝膽濕熱證、肝腎陰虛證患者與健康人血清miRNA差異表達(dá)，結(jié)果顯示miR-583和miR-663分別在肝膽濕熱證和肝腎陰虛證患者血清中顯著上調(diào)（P＜0.001），溶解曲線結(jié)果提示指標(biāo)具有較好靈敏度和特異度，可被用作證型區(qū)分的標(biāo)志性分子。高氏等[41]采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)胰腺癌濕熱證、脾虛證和無證型患者唾液中miR-21、miR-181a表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-21、miR-181a在濕熱組表達(dá)水平顯著降低。同時(shí)，高氏研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌濕熱證患者預(yù)后較好，因此推斷miR-21、miR-181a可能作為胰腺癌預(yù)后判斷的指標(biāo)之一。

3.3 LncRNA

長鏈非編碼RNAs通常指長度超過200 nt的非編碼RNA，其序列保守性較低，表達(dá)具有組織和時(shí)空特異性。lncRNA參與染色質(zhì)重塑、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞分化等多種生物過程，與冠狀動(dòng)脈疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等具有一定關(guān)聯(lián)性，被應(yīng)用于疾病診斷、判斷預(yù)后、藥物靶標(biāo)研究等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[42,43]。目前證候研究方面，主要是對(duì)冠心病血瘀證[44]，乳腺癌肝郁證[45]，肺結(jié)核[46]不同證候的lncRNA 差異表達(dá)譜的研究。

王氏等[44]采用Illumina HiSeq 2 500測(cè)序和qRTPCR技術(shù)篩選冠心病血瘀證相關(guān)差異表達(dá)lncRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冠心病血瘀證組39個(gè)lncRNA差異表達(dá)（Fold change＞2，p-value＜0.05），其中3個(gè)lncRNA上調(diào)，36個(gè)lncRNA下調(diào)。許氏等[45]采用Human IncRNA MicroarrayV3.0芯片和qRT-PCR技術(shù)篩選乳腺癌及其肝郁證相關(guān)IncRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNARP4-583P15.10和lncRNARPll-445H22.4與乳腺癌的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)，進(jìn)一步分組分析發(fā)現(xiàn)lncRNARPll-445H22.4在肝郁證組中明顯上調(diào)（P＜0.001）且溶解曲線分析提示敏感度和特異度較好，具有作為乳腺癌肝郁證患者早期診斷生物標(biāo)志物的潛力。Jiang等[46]運(yùn)用Human LncRNA Microarray V3.0分析肺結(jié)核患者不同證候的lncRNA表達(dá)譜，結(jié)果顯示肺陰虛證有566個(gè)lncRNA、肝火傷陰證有55個(gè)lncRNA、氣陰兩虛證60個(gè)lncRNA存在差異表達(dá)（Fold change＞2，p-value＜0.05）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes）通路分析顯示差異表達(dá)基因與Hippo信號(hào)通路以及蛋白質(zhì)消化、吸收途徑有關(guān)。

4 中醫(yī)證候與轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究

證候表現(xiàn)是基因表達(dá)成蛋白質(zhì)，并由蛋白質(zhì)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的結(jié)果，基因表達(dá)受多環(huán)節(jié)、多因素調(diào)控，解析基因表達(dá)的調(diào)控對(duì)于理解證候的發(fā)生、轉(zhuǎn)化具有重要的作用?；虮磉_(dá)的調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，轉(zhuǎn)錄組水平的調(diào)控是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是目前研究的熱點(diǎn)。一些研究[47]已經(jīng)闡明了miRNA-mRNA通過多重網(wǎng)絡(luò)調(diào)控基因表達(dá)的復(fù)雜機(jī)理。miRNA是關(guān)鍵的基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子。最新研究[27]表明，不同種類的RNA之間存在相互作用關(guān)系，且都可以憑借miRNA海綿的角色調(diào)控基因表達(dá)。這些RNA分子統(tǒng)稱為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs），它們通過與“共享”的miRNA競爭性結(jié)合互相傳遞信息或者互相調(diào)控。進(jìn)一步探索ceRNAs之間調(diào)控關(guān)系將對(duì)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生新的認(rèn)識(shí)，也對(duì)人類的發(fā)展和疾病具有重要意義，對(duì)于闡明證候機(jī)制亦是同等重要。一些學(xué)者在證候的轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面也進(jìn)行了探索性研究并取得一定成果，主要涉及 miRNA-mRNA[38,48]，lncRNA-miRNA-mRNA[44]調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但總體來講，研究的數(shù)量和深度尚且不足。

王氏等[38]采用Agilent RNA 6000 Nano assay芯片技術(shù)篩查血瘀證患者miRNA和mRNA差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)401個(gè)mRNA和11個(gè)miRNA差異表達(dá)，然后運(yùn)用miRWalk軟件根據(jù)miRNA預(yù)測(cè)相關(guān)靶基因并參照差異表達(dá)mRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p，miR-199a-5p和23個(gè)目標(biāo)mRNA形成了血瘀證的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（P＜0.01），經(jīng)另一獨(dú)立隊(duì)列的qRT-PCR驗(yàn)證得到相同結(jié)果，因此認(rèn)為該網(wǎng)絡(luò)可用于血瘀證診斷。王氏等[49]又通過血塞通治療冠心病不穩(wěn)定型心絞痛血瘀證觀察其對(duì)miR-146b-5p和miR-199a-5p及其富集的干預(yù)抗原呈遞和處理通路、p53信號(hào)通路和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用通路上的靶基因（KIR3DS1,HLA-DPB1,TP53SESN2,NCR1,PRF1）的影響，治療前后結(jié)果經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p、miR-199a-5p可作為診斷標(biāo)志物，且靶基因的變化趨勢(shì)提示miR-146b-5p、miR-199a-5p可以影響以上3條信號(hào)通路。另外，王氏等[44]采用Illumina HiSeq 2500測(cè)序和qRT-PCR技術(shù)進(jìn)一步篩選冠心病血瘀證相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果顯示冠心病血瘀證相關(guān)差異基因包括39個(gè)lncRNA，229個(gè)miRNA和221個(gè)mRNA。通過聯(lián)合Pearson相關(guān)分析和starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)獲得的基因間調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建lncRNA，miRNA，mRNA之間的共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。符合共調(diào)控條件的共有9個(gè)lncRNA，31個(gè)mRNA和24個(gè)miRNA構(gòu)成共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括76個(gè)基因間調(diào)控關(guān)系。此外，武氏等[48]采用AFFX Human Genome U133 Plus 2.0芯片技術(shù)分析HIV/AIDS濕熱內(nèi)蘊(yùn)證miRNA和mRNA表達(dá)情況，通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了105對(duì)mRNA-miRNA，73條靶基因，靶基因主要參與對(duì)組織反應(yīng)、調(diào)節(jié)增殖、凋亡等。

5 中醫(yī)證候轉(zhuǎn)錄組學(xué)的挑戰(zhàn)和前景

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得我們能夠從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的層面認(rèn)識(shí)證候，但轉(zhuǎn)錄組學(xué)蘊(yùn)含龐大且復(fù)雜的信息給證候研究帶來新的挑戰(zhàn)：其一，高通量芯片和測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)與證候本身的復(fù)雜性使生物信息學(xué)處理與數(shù)據(jù)分析困難化；其二，研究多通過少量樣本尋找差異表達(dá)的RNA而未進(jìn)行大樣本量的驗(yàn)證，或驗(yàn)證與篩選結(jié)果不一致使結(jié)論可信度降低；其三，即使篩選得到差異RNA，但缺乏“證候模型”下的細(xì)胞功能學(xué)驗(yàn)證使發(fā)生機(jī)制尚不明確；其四，使用轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究證候復(fù)雜系統(tǒng)，使復(fù)雜模型更加復(fù)雜化；其五，病證結(jié)合模式下的簡單分組對(duì)照研究，無法甄別差異RNA為疾病特異性還是證候特異性使結(jié)果模糊化。針對(duì)以上問題，亟需研究者深入思考并加以改進(jìn)，比如保持轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)與組學(xué)數(shù)據(jù)處理分析方法的更新，規(guī)范證候轉(zhuǎn)錄組研究的流程與方法，優(yōu)化證候差異RNA篩選的分組設(shè)計(jì)方案等等。另外，環(huán)狀RNA[50]已作為新發(fā)現(xiàn)的ceRNA被廣泛用于西醫(yī)疾病研究，其高度保守性可能更利于臨床檢測(cè)，能否將其引入中醫(yī)證候研究也需進(jìn)一步探索。

雖然中醫(yī)證候的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究還面臨諸多挑戰(zhàn)，但憑借高通量芯片、新一代測(cè)序及其它組學(xué)技術(shù)，中醫(yī)證候研究在轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面以取得一定進(jìn)展，通過分析轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，已發(fā)現(xiàn)部分證候相關(guān)RNA和轉(zhuǎn)錄組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，它們將扮演證候生物標(biāo)志物角色或用于闡明證候發(fā)生機(jī)制。借助此類研究，可為證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究開辟新的道路，也能為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)證候的早期診斷、早期治療以及促進(jìn)中醫(yī)藥精準(zhǔn)化醫(yī)療奠定夯實(shí)基礎(chǔ)。

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