灰樹花蛋白β-葡聚糖的抗抑郁效果及生物學(xué)機制研究進展與探析＊

保紅坤，朱科銘，賈 岳，劉天美，李浩然，杜 靜

（1.云南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 昆明 650091；2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 昆明 650091）

抑郁癥已成為現(xiàn)代社會的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率還在不斷升高。世界衛(wèi)生組織預(yù)測到2020年時，抑郁癥將成為世界上僅次于心血管病第二大疾病，到2030年時抑郁癥將成為高收入國家第一位的疾病負擔(dān)[1,2]。隨著社會經(jīng)濟文化的發(fā)展和公眾健康意識的提高，我國抑郁癥障礙的患病率呈現(xiàn)逐步上升趨勢，這類疾病對患者及其家屬造成的痛苦，以及對社會造成的損失，是許多其他疾病所無法比擬的。然而，目前我國臨床使用的有關(guān)抑郁癥治療的西藥基本被進口藥與合資化藥所壟斷，而且抑郁癥患者服用這類藥物后大多表現(xiàn)出起效慢、有效率低、副作用大、停藥后易復(fù)發(fā)等缺陷。中醫(yī)藥因在抑郁癥的治療中具有較好的效果而日益受到關(guān)注。因此，從中醫(yī)藥中研發(fā)具有起效快、靶點明確、安全等特點的新型抗抑郁藥物具有重要的社會價值和理論意義。

灰樹花（Grifola frondosa）是一種藥用真菌，別名又稱舞茸、栗子蘑、貝葉多孔菌、云蕈、千佛菌、蓮花菌等（圖1）。野生的灰樹花呈淺灰色，長在柿樹、板栗樹、榆樹的根部周圍。我國就是最早利用真菌治病的國家，真菌具有很高的藥用價值。而藥用蘑菇在中國作為傳統(tǒng)中藥用來預(yù)防和治療疾病已經(jīng)具有較長的歷史[3]。1709年，日本貝原益軒的《大和本草》中收載了灰樹花，其藥理作用最早記載于日本坂然的《菌譜》中，記載其“性甘、平、無毒，可益壽延年”。我國中醫(yī)學(xué)認為灰樹花有“扶正固本”之效，在《神農(nóng)本草經(jīng)》里有“調(diào)和脾胃，安定神志”的記載。此外，灰樹花還具有極高的醫(yī)療保健功能，其藥用潛能包括各種生理效果，從增強免疫系統(tǒng)、降低血糖、到改善脾臟、肝硬化、高血壓、胃和神經(jīng)功能等[4]?；覙浠ㄗ鳛橹兴幨褂茫渌幮Ш拓i苓等效，對小便不利、水腫、腳氣、肝硬化腹水及糖尿病等具有非常好的治療效果，因此它是非常寶貴的藥用真菌之一。

1 GFPβG研究進展

1.1 簡介

GFPβG（別名灰樹花D組分）是灰樹花中最為有效的活性成分，研究表明它具有較強的抗癌效果，因此，灰樹花被譽為“真菌之王，抗癌奇葩”。GFPβG是從優(yōu)質(zhì)灰樹花的子實體中提取后，經(jīng)分離、精制得到的糖蛋白，它的多糖和蛋白的比例是8:2，平均分子量是一百萬左右，多糖部分是以β-(1→6)結(jié)合為主鏈、β-(1→3)結(jié)合為側(cè)鏈的葡聚糖和以β-(1→3)結(jié)合為主鏈、β-(1→6)結(jié)合為側(cè)鏈的葡聚糖（圖2）[5]。GFPβG無論是其化學(xué)結(jié)構(gòu)，或是組成成分，亦或是分子量都有別于從香菇、云芝、靈芝等其他菌類中提取的同類物質(zhì)，其生物活性作用遠遠超過這些同類物質(zhì)。此外，大量研究證實GFPβG具有多種生理藥效，包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和抗抑郁等功效[5,6]。

1.2 抗腫瘤作用

GFPβG具有較強的抗腫瘤活性，單用或聯(lián)合用藥都表現(xiàn)出較好的治療效果。β-葡聚糖免疫活性強弱與它的側(cè)鏈、空間結(jié)構(gòu)、以及分子量等密切相關(guān)，由于GFPβG具有獨特的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，盡管它與香菇多糖、靈芝多糖、云芝多糖、茯苓多糖等同樣是以多糖為主要成分，但是它的抗腫瘤作用則明顯優(yōu)于這些菌類提取物。最新研究表明GFPβG對乳腺癌具有較好的抑制作用，以及對浸潤性膀胱癌患者具有緩解作用[7,8]。Soares等人研究發(fā)現(xiàn)GFPβG對人類乳腺癌細胞的生存能力和凋亡有影響，其起效機制是通過激活BAK-1基因來誘導(dǎo)乳腺癌細胞的凋亡[9]。在聯(lián)合用藥上，GFPβG同樣表現(xiàn)出較好的抗腫瘤效果。Pyo等人采用GFPβG聯(lián)合IFN-α處理體外前列腺癌PC-3細胞的研究表明，該聯(lián)合用藥使前列腺癌PC-3細胞的生長速率減少65%[10]。1995年，第一款灰樹花提取物產(chǎn)品（舞茸精滴劑）在美國上市，由于其有效性和安全性得到醫(yī)療界和患者的充分肯定，1998年，美國FDA打破慣例，批準(zhǔn)舞茸精滴劑產(chǎn)品免除一期安全毒理試驗，直接進入晚期癌癥患者二期臨床，并被收載入2003年版《美國醫(yī)生桌上參考手冊》（非處方藥和輔助營養(yǎng)品分冊），廣泛用于腫瘤康復(fù)補充替代治療和亞健康人群的保健。

圖1 灰樹花

圖2 灰樹花β-葡聚糖分子結(jié)構(gòu)

1.3 免疫調(diào)節(jié)作用

先天性免疫系統(tǒng)是抵御病菌入侵的第一道防線，它能夠立即識別和處理病菌入侵的感染。雖然現(xiàn)已知不同β-葡聚糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的活性具有較長的時間，但其潛在的細胞和分子生物學(xué)機制尚不清楚[11]。GFPβG具有關(guān)鍵的β-葡聚糖作為它的天然生物活性成分結(jié)構(gòu)，因此，β-葡聚糖是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)活性作用的關(guān)鍵[5]?；覙浠é?葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)作用主要包括能夠促進有絲分裂和激活免疫效應(yīng)細胞，如淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和自然殺傷（NK）細胞，來刺激產(chǎn)生各種細胞因子和趨化因子，如白細胞介素（IL-1β，IL-6，IL-8，IL-12等），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ）[12]。越來越多的研究表明，Dectin-1受體與β-葡聚糖結(jié)合后能夠介導(dǎo)多種細胞免疫調(diào)節(jié)作用，如吞噬作用、內(nèi)吞作用和氧化爆發(fā)，以及誘導(dǎo)促炎細胞因子、趨化因子的產(chǎn)生（TNF-α，IL-12）和巨噬細胞炎癥蛋白-2（MIP-2）[13,14]。現(xiàn)有研究表明GFPβG具有較強的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用[5]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥的發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)[15,16]，尤其是正常功能膠質(zhì)細胞的受損會導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生，并損傷了行使相關(guān)功能的神經(jīng)突觸的可塑性和神經(jīng)的生長[17]。

圖3 [18]CD-1小鼠腹腔給藥GFPβG低劑量（5 mg·kg-1，灰β低）、中劑量（8 mg·kg-1，灰β中）、高劑量（12.5 mg·kg-1，灰β高）、丙咪嗪（15 mg·kg-1）和生理鹽水，給藥2 h后進行懸尾實驗或連續(xù)給藥5天后對通過免疫印跡對小鼠大腦前額葉組織中Dectin-1表達水平檢測。單因素方差分析（post hoc Tukey’s檢驗，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。（A）GFPβG連續(xù)注射5天后上調(diào)了其特異性受體Dectin-1表達水平。（B）GFPβG的受體Dectin-1的抗抑郁效果被其特異性拮抗劑Laminarin所阻斷。

2 抗抑郁效果研究

2.1 具有快速和較強的抗抑郁效果

按低劑量（5 mg·kg-1）、中劑量（8 mg·kg-1）、高劑量（12.5 mg·kg-1）給小鼠腹腔注射GFPβG，生理鹽水和丙咪嗪（15 mg·kg-1g）處理組分別作為陰性對照組和陽性對照組，處理60 min后或5天后進行懸尾實驗或強迫游泳實驗，發(fā)現(xiàn)GFPβG（5-12.5 mg·kg-1）具有快速和較強的抗抑郁效果[18]：小鼠行為學(xué)實驗結(jié)果顯示，腹腔注射60 min后顯著降低了小鼠在懸尾和強迫游泳實驗中的不動時間；連續(xù)腹腔注射5天后，同樣顯著降低了小鼠在懸尾和強迫游泳實驗中的不動時間，該結(jié)果與陽性對照藥物丙咪嗪（15 mg·kg-1）結(jié)果類似。

2.2 作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)

最初的研究發(fā)現(xiàn)，Dectin-1是在樹突狀細胞表面上表達的特異性受體，特將它命名為樹突狀細胞相關(guān)的C型植物凝集素。但在后來的研究中發(fā)現(xiàn)除樹突狀細胞外，其作為β-葡聚糖的主要受體廣泛分布在小膠質(zhì)細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞等[19,20]。Dectin-1通過對真菌的識別參與免疫效應(yīng)細胞的吞噬及殺傷過程，來誘導(dǎo)機體分泌一些免疫細胞因子及趨化因子，進而參與到機體防御真菌病原體的天然免疫反應(yīng)過程中。有研究表明，GFPβG是由98%的葡聚糖和2%的蛋白組成[6]。在炎癥狀態(tài)下，葡聚糖能夠與其運載體結(jié)合透過血腦屏障[20-22]。我們研究發(fā)現(xiàn)GFPβG在特異性的劑量范圍內(nèi)（5-12.5 mg·kg-1）與其受體Dectin-1相結(jié)合后透過血腦屏障在小鼠中發(fā)揮了較強的抗抑郁效果。免疫印跡實驗結(jié)果表明，GFPβG連續(xù)處理5天后，較生理鹽水對照組顯著增加了Dectin-1受體在小鼠前額葉組織中的表達水平，而丙咪嗪（15 mg·kg-1）連續(xù)處理5天后，未檢測到小鼠前額葉皮層中Dectin-1受體表達水平的變化[18]（圖3A）。而后，進一步通過懸尾實驗來測定GFPβG的特異性受體Dectin-1抗抑郁效果是否被其特異性拮抗劑Laminarin所阻斷，CD-1小鼠在行為學(xué)前2 h注射Laminarin，緊接著行為學(xué)前1 h再次注射GFPβG，懸尾實驗結(jié)果表明，Dectin-1特異性拮抗劑Laminarin幾乎完全阻斷了GFPβG所產(chǎn)生的抗抑郁效果[18]（圖3B）。該實驗結(jié)果提示GFPβG通過與Dectin-1受體結(jié)合而透過小鼠大腦血腦屏障后作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)來發(fā)揮抗抑郁作用。研究表明β-葡聚糖與大腦中Dectin-1受體相結(jié)合能夠?qū)е耂yk/NF-κB信號通路的活化進而調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫系統(tǒng)[23]。因此，GFPβG靶向作用其受體Dectin-1可能成為治療抑郁癥的一種新的策略。

2.3 上調(diào)前額葉中p-GluA1(S845)磷酸化和GluA1表達水平

圖4 [18]CD-1小鼠腹腔給藥GFPβG低劑量（5 mg·kg-1，灰β低）、中劑量（8 mg·kg-1，灰β中）、高劑量（12.5 mg·kg-1，灰β高）、丙咪嗪（15 mg·kg-1）和生理鹽水，給藥60 min或5天后，通過免疫印跡對小鼠大腦前額葉組織中AMPA受體p-GluA1(S845)及其亞基GluA1、GluA2、GluA3表達水平檢測。單因素方差分析（post hoc Tukey’s檢驗，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。GFPβG處理60 min后上調(diào)了p-GluA1(S845)磷酸化水平（A），而對GluA1（B）、GluA2（C）、GluA3（D）的表達水平?jīng)]有影響。GFPβG處理5天后上調(diào)了p-GluA1(S845)磷酸化（E）和GluA1（F）的表達水平，而對GluA2（G）、GluA3（H）的表達水平?jīng)]有影響。

大量研究表明AMPA受體亞基GluA1在Ser845位點的磷酸化是一個蛋白激酶A（PKA）位點，GluA1 Ser845磷酸化可以誘導(dǎo)神經(jīng)元中AMPA受體活化，增加AMPA受體在神經(jīng)元膜上的嵌入，促進LTP的發(fā)生，進而調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸可塑性，因此GluA1 Ser845磷酸化被認為是一個廣泛的通道開關(guān)[24-27]。臨床研究結(jié)果表明，在抑郁癥患者前額葉中AMPA受體亞基GluA1較正常人群表達水平顯著降低[28,29]。我們研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)GFPβG腹腔給藥60 min后，可以快速增加CD-1小鼠前額葉中GluA1 Ser845位點的磷酸化水平，并促進前額葉皮層中GluA1在突觸的定位，與陽性對照丙咪嗪結(jié)果相似[18]（圖4A）。當(dāng)連續(xù)給藥5天后，GFPβG和丙咪嗪均增加了小鼠前額中GluA1 S845的磷酸化水平，并促進了AMPA受體GluA1在前額葉及其突觸部位的定位（圖4E），值得一提的是，只有GFPβG增加了AMPA受體亞基GluA1水平[18]（圖4F），該結(jié)果與氯胺酮能夠增強AMPA受體亞基GluA1信號來快速誘導(dǎo)突觸的生長，使得氯胺酮具有持續(xù)一周左右的抗抑郁效果相似[30-32]。這些結(jié)果表明，GFPβG可以快速且持續(xù)的增加小鼠前額葉中GluA1 Ser845的磷酸化水平，進而活化AMPA受體亞基GluA1在前額葉及其突觸部位的定位，而AMPA受體介導(dǎo)的神經(jīng)突觸可塑性異常與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[33]。

2.4 增強突觸中p-GluA1(S845)磷酸化和AMPA亞基的表達水平

大腦中AMPA受體四聚體類型主要有三種：即GluA1/2、GluA2/3和GluA1/3[34-36]。Ampuero等人研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)抗抑郁藥物氟西汀的抗抑郁效果是通過調(diào)節(jié)大鼠前額葉皮層中GluA1/2型AMPA受體實現(xiàn)的[34]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，GFPβG與丙咪嗪處理60 min或連續(xù)5天后，均顯著增加了小鼠前額葉的突觸中GluA1 Ser845位點的磷酸化水平；而在連續(xù)處理5天后，GFPβG與丙咪嗪均顯著增加了小鼠前額葉的突觸中GluA1、GluA2和GluA3的表達水平[18]。這些結(jié)果表明，GFPβG與丙咪嗪的抗抑郁效果也是通過調(diào)節(jié)前額葉中GluA1/2和GluA2/3 AMPA受體實現(xiàn)的。

2.5 GFPβG處理后的動物在停止給藥后表現(xiàn)出延長的抗抑郁效果

先前研究表明氯胺酮等抗抑郁藥物在動物行為學(xué)實驗中表現(xiàn)出持續(xù)延長的抗抑郁效果，而且在總蛋白中上調(diào)了AMPA受體亞基GluA1分子水平[31,37]。我們研究中發(fā)現(xiàn)GFPβG在動物行為學(xué)實驗中具有較強的抗抑郁效果，同時在總蛋白中也上調(diào)了AMPA受體亞基GluA1分子水平。我們研究中給CD-1小鼠腹腔連續(xù)注射高劑量GFPβG（12.5 mg·kg-1）和丙咪嗪（15 mg·kg-1）5天，而后停止給藥長達3天或5天后進行抗抑郁行為學(xué)檢測。實驗結(jié)果表明GFPβG在小鼠懸尾和強迫游泳實驗中表現(xiàn)出具有延長3天的抗抑郁效果，而停藥5天后的強迫游泳實驗結(jié)果表明，GFPβG延長的抗抑郁效果消失了[18]。

2.6 AMPA受體功能的增強在GFPβG發(fā)揮抗抑郁作用中具有重要作用

之前研究表明，鋰鹽、蟲草素和右美沙芬等在小鼠懸尾和強迫游泳實驗中表現(xiàn)出快速的抗抑郁效果是通過增強AMPA受體活性來實現(xiàn)的，并且AMPA受體特異性抑制劑能夠阻斷其抗抑郁效果[38-40]。研究表明，在小鼠慢性溫和未知壓力抑郁樣模型懸尾實驗中，AMPA受體抑制劑GYKI 52466有效抑制了氟西汀的抗抑郁效果[41]；此外，Gould等人使用鋰鹽處理小鼠后，顯著降低了小鼠在懸尾和強迫游泳實驗中的不動時間，并且上調(diào)了AMPA受體亞基GluA1和GluA2的表達水平，且GYKI 52466幾乎完全阻斷了鋰鹽在動物抑郁樣行為學(xué)實驗中產(chǎn)生的抗抑郁效果[38]，表明該抗抑郁效果是通過調(diào)節(jié)AMPA受體介導(dǎo)的信號通路實現(xiàn)的。與上述研究相似，我們使用AMPA受體特異性抑制劑GYKI 52466可以有效地抑制由GFPβG引起的快速抗抑郁效果[18]，表明GFPβG的快速抗抑郁效果可能涉及AMPA受體介導(dǎo)的信號通路。

2.7 GFPβG的快速和較強的抗抑郁效果不同與神經(jīng)興奮性藥物

雖然研究證實了氯胺酮具有快速且持續(xù)的抗抑郁效果[42]，但考慮到其潛在的擬精神病效果和強烈的藥物依賴性等副作用[30]，目前美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）還未將其列為臨床治療抑郁癥的藥物。還有研究表明其他一些神經(jīng)興奮性藥物，如可卡因或安非他命也具有快速抗抑郁效果，但研究均顯示這兩種藥物存在巨大的興奮性神經(jīng)毒性，并容易造成受試者強烈的藥物成癮性[43,44]。此外，這類神經(jīng)興奮性藥物在停藥期間會導(dǎo)致個體出現(xiàn)抑郁癥狀[45,46]。我們先前研究觀察到GFPβG在小鼠體系中具有快速和能夠延長3天左右的抗抑郁效果，與氯胺酮具有相似的效果，且曠野實驗結(jié)果表明GFPβG處理組小鼠在總框和中心區(qū)域的移動距離較陰性對照生理鹽水組無統(tǒng)計學(xué)差異，排除了其興奮性中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用；此外，GFPβG連續(xù)腹腔注射小鼠5天后并未影響體重變化，提示我們來自于藥食同源性的野生菌灰樹花中的GFPβG是一種相對比較安全的天然活性成分，具有較大的應(yīng)用潛力和價值[18]。

3 總結(jié)與展望

中醫(yī)藥作為我國獨特的藥物資源優(yōu)勢，在許多疾病治療中都具有獨特的作用。中國已把中醫(yī)藥發(fā)展提升到國家戰(zhàn)略高度，把“堅持中西醫(yī)并重”確立為衛(wèi)生與健康工作方針的重要內(nèi)容，今后推動其落到實處將會大大提升居民健康水平。中藥科學(xué)家屠呦呦研究員因在中藥黃花蒿中發(fā)現(xiàn)青蒿素，使瘧疾患者死亡率顯著降低，獲得2015年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，這是中醫(yī)藥現(xiàn)代化對全球衛(wèi)生與健康事業(yè)的突出貢獻。

隨著大量中醫(yī)藥對抑郁癥疾病的深入研究，中醫(yī)藥在抑郁癥的治療上得到越來越多的認可和接受。近年來，國內(nèi)外研究工作者都十分關(guān)注從傳統(tǒng)藥物、天然植物及菌類中尋找新型的抗抑郁活性藥物，努力致力于中醫(yī)藥現(xiàn)代化的研究發(fā)展。

GFPβG是藥食同源性的野生菌灰樹花中的一種主要有效活性成分，我們先前研究發(fā)現(xiàn)GFPβG處理后的動物在行為實驗中具有快速和延長3天的抗抑郁效果，深入其生物學(xué)機制研究表明，GFPβG是通過激活其受體Dectin-1增強神經(jīng)突觸興奮性而產(chǎn)生的抗抑郁作用。這一發(fā)現(xiàn)將有利于開發(fā)出起效快、有延長抗抑郁藥物作用、副作用小、安全的新型抗抑郁藥物，也將有利于推動我國傳統(tǒng)天然抗抑郁藥物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展和進程。今后對于GFPβG發(fā)揮抗抑郁效果的作用生物學(xué)機制還有很多值得研究的方面，如需繼續(xù)在抑郁樣動物模型（如慢性溫和不可預(yù)知壓力模型、LPS誘導(dǎo)的炎癥抑郁樣模型和社會壓力挫敗模型等）中來深入研究：經(jīng)GFPβG治療后①神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)作用與抑郁癥治療之間的關(guān)系；②也將進一步檢測Dectin-1下游信號分子的改變，從而來探討GFPβG新的抗抑郁作用機制；③此外，也有大量文獻表明抑郁癥的發(fā)病與中樞神經(jīng)中調(diào)控情緒的邊緣系統(tǒng)密切相關(guān)，因此，除了大腦前額葉外，后續(xù)也將進一步檢測邊緣系統(tǒng)各關(guān)鍵腦區(qū)（如下丘腦、紋狀體或海馬等）中Dectin-1及AMPA受體在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的變化?？傊?，中醫(yī)藥及其活性有效成分越來越多的被發(fā)現(xiàn)具有抗抑郁的潛能，尤其是中國擁有得天獨厚的中藥動植物和菌類資源，未來中醫(yī)藥在抑郁癥臨床和臨床前的研究中都將值得進一步研究和挖掘。

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