姜黃素對(duì)波動(dòng)性高血糖處理下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DNA氧化損傷的影響

周淑琴 張守法 張 偉 張洪濤

(濟(jì)南市第四人民醫(yī)院保健科，山東 濟(jì)南 250031)

糖尿病可導(dǎo)致多種血管并發(fā)癥并且是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素〔1〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管正常結(jié)構(gòu)及功能方面具有重要作用。動(dòng)脈粥樣硬化多繼發(fā)于多種因素所致的內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷〔2〕。在這些危險(xiǎn)因素中，氧化應(yīng)激的致動(dòng)脈粥樣硬化作用已得到廣泛闡釋〔3〕。氧化應(yīng)激即體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與消除失衡，可導(dǎo)致人體脂質(zhì)、蛋白及DNA的氧化損傷。目前已知，DNA氧化損傷可致機(jī)體核內(nèi)遺傳信息的缺損。當(dāng)機(jī)體抗氧化能力不足時(shí)，累及的氧化損傷DNA將導(dǎo)致相應(yīng)細(xì)胞功能的喪失?，F(xiàn)有的研究表明，DNA的氧化損傷不僅是動(dòng)脈粥樣硬化的伴隨損傷，而是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要原因〔4〕。糖尿病患者除了慢性持續(xù)性高血糖外，波動(dòng)性高血糖(IHG)是另一常見的異常血糖狀態(tài)〔5〕。IHG較持續(xù)性高血糖(SHG)更易通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞黏附至內(nèi)皮細(xì)胞及誘發(fā)氧化應(yīng)激而參與糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展〔6～8〕。姜黃素是一種具有多種生物活性的中藥材。抗氧化作用是姜黃素發(fā)揮藥用作用的重要機(jī)制，通過清除氧自由基，改善體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)〔9〕。本研究觀察濃度姜黃素對(duì)IHG狀態(tài)下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DNA氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)自上海醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。傳代至10～20代的正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)于包含11.1 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清pH7.4 RPMI1640培養(yǎng)基，并被置于37℃含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞先用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2遍，并被分為不同處理組〔10〕：正常對(duì)照(11.1 mmol/L葡萄糖)、SHG(25.0 mmol/L葡萄糖)、IHG(11.1與25.0 mmol/L葡萄糖每隔12 h交替培養(yǎng))及滲透壓對(duì)照組，各培養(yǎng)72 h。處理組細(xì)胞均保證每日換液一次。在姜黃素保護(hù)作用研究中，姜黃素溶于RPMI1640培養(yǎng)基中致終濃度分別為2.5、5.0及10.0 μmol/L。

1.2胞內(nèi)活性氧的檢測(cè) 選用2,7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)作為檢測(cè)探針。不同處理組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，先沖洗2次，然后置于含10 μmol/L DCFH-DA的培養(yǎng)基中處理30 min。處理后再次沖洗一遍并將細(xì)胞收集于PBS中。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)2′,7′-二氯熒光素(DCF)熒光用于計(jì)算胞內(nèi)活性氧濃度。

1.3總抗氧化能力檢測(cè) 培養(yǎng)細(xì)胞上清液中總抗氧化能力的檢測(cè)基于將Fe3+-TPTZ轉(zhuǎn)化為Fe2+-TPTZ的能力。檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成并嚴(yán)格按照試劑盒的說明執(zhí)行。

1.48-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)濃度檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法完成，試劑盒購(gòu)自美國(guó)OXIS公司。首先應(yīng)用DNA提取試劑盒提取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DNA，并用酶標(biāo)儀在OD260 nm/OD280 nm定量DNA量。每200 μg DNA溶于50 μl反應(yīng)混合液中，并在室溫下用1 μl DNase Ⅰ消化10 min。消化后的樣本置于已包被8-OHdG抗體的檢測(cè)孔中，于OD450 nm處檢測(cè)吸光度。

1.5單細(xì)胞凝膠電泳 即彗星實(shí)驗(yàn)。不同處理后的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞懸浮于瓊脂糖溶液并平鋪于玻片上成單細(xì)胞層，隨后置于4℃冰箱5 min。玻片隨后置于預(yù)冷的裂解液中去除細(xì)胞蛋白，僅留核酸部分。裂解過后，放玻片至電泳槽，置于新鮮電泳液于48℃共20 min。取出玻片，用水沖洗晾干并用EB標(biāo)記。用熒光顯微鏡觀察拖尾情況。每一標(biāo)本均選3個(gè)不同玻片，每一玻片至少隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。無(wú)拖尾細(xì)胞即無(wú)DNA氧化損傷細(xì)胞。每個(gè)玻片均由2個(gè)不同人員獨(dú)立計(jì)數(shù)，取兩者平均值計(jì)數(shù)彗星率〔11〕。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量變化 與正常培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)胞相比，SHG培養(yǎng)細(xì)胞胞內(nèi)活性氧水平升高約160%，而IHG處理細(xì)胞具有更高的活性氧水平(P<0.01)。姜黃素可劑量依賴性減輕IHG所致內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)活性氧的水平(P<0.01)，見表1，表2。

2.2內(nèi)皮細(xì)胞DNA氧化損傷 高血糖處理細(xì)胞內(nèi)具有更高水平的8-OHdG水平，且在IHG處理組更明顯(P<0.01)。姜黃素可劑量依賴性地減輕IHG所致內(nèi)皮細(xì)胞胞內(nèi)8-OHdG的水平(P<0.01)。類似的結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)于彗星實(shí)驗(yàn)：與正常培養(yǎng)細(xì)胞相比，SHG與IHG培養(yǎng)細(xì)胞分別具有約2.0倍與3.1倍高的DNA氧化損傷(P<0.01)，而姜黃素可顯著減輕上述病理?yè)p傷(P<0.01)，見表1，表2。

2.3胞內(nèi)總抗氧化能力的含量變化 與正常培養(yǎng)細(xì)胞相比，高血糖培養(yǎng)細(xì)胞具有較低的總抗氧化能力，且IHG組更明顯(P<0.01)。而姜黃素可劑量依賴性地改善IHG所致內(nèi)皮細(xì)胞總抗氧化能力的降低(P<0.01)，見表1，表2。

表1 IHG加重人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷

與正常對(duì)照組：1)P< 0.01，下表同

表2 姜黃素劑量依賴性的減輕IHG所致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IHG較SHG更易導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞DNA氧化損傷及抗氧化功能失調(diào)。同時(shí)，姜黃素可劑量依賴性地改善高血糖所致內(nèi)皮細(xì)胞DNA氧化損傷?；钚匝醍a(chǎn)生于氧代謝過程，是血管發(fā)育不同階段中一種重要的調(diào)節(jié)因子〔12〕。然而，氧化與抗氧化的失衡將導(dǎo)致體內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，胞內(nèi)重要的生物分子包括脂質(zhì)、蛋白及DNA等均會(huì)出現(xiàn)損傷并進(jìn)而參與許多病理?yè)p傷的發(fā)生〔13〕。比如，持續(xù)過量的活性氧產(chǎn)生及DNA氧化損傷的積累被認(rèn)為參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展〔4〕。

通常，糖尿病患者內(nèi)皮功能失調(diào)被更多關(guān)注于SHG的毒性作用。在正常人體中，血糖被嚴(yán)格控制在一個(gè)較窄的范圍內(nèi)。然而，糖尿病患者由于自身調(diào)節(jié)血糖能力的不足，血糖水平通常在1 d內(nèi)表現(xiàn)為較大幅度的變化，而這種變化通常伴隨氧化應(yīng)激的產(chǎn)生〔5〕。目前已有部分研究發(fā)現(xiàn)SHG更易誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并上調(diào)黏附分子與炎性因子的表達(dá)〔6，8，14，15〕。然而，IHG致內(nèi)皮細(xì)胞DNA氧化損傷的潛在毒性作用卻缺乏相關(guān)研究。

總抗氧化能力被廣泛用于檢測(cè)反映組織細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)〔16〕。因而，本研究結(jié)果證實(shí)IHG可致更嚴(yán)重的內(nèi)皮細(xì)胞DNA氧化損傷，且這一毒性作用基于胞內(nèi)總抗氧化能力的降低。姜黃素具有較強(qiáng)的抗氧化活性〔9〕。本課題組既往的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過其抗氧化作用可減輕缺血再灌注所致兔脊神經(jīng)的損傷〔17〕。本研究結(jié)果證實(shí)姜黃素可同時(shí)減輕SHG與IHG所致內(nèi)皮細(xì)胞DNA氧化損傷。IHG所致內(nèi)皮細(xì)胞DNA氧化損傷的機(jī)制至少部分類似于SHG的毒性作用，且其毒性作用更為明顯。目前，IHG更高毒性作用的具體機(jī)制尚不明確。一種可能的解釋是在慢性高血糖狀態(tài)下，機(jī)體組織細(xì)胞逐漸適應(yīng)并據(jù)此調(diào)整機(jī)體功能以適應(yīng)這種變化。而IHG將減緩這種自身調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)而導(dǎo)致更嚴(yán)重的毒性作用〔10〕。

1Zhang H，Dellsperger KC，Zhang C.The link between metabolic abnormalities and endothelial dysfunction in type 2 diabetes：an update 〔J〕.Basic Res Cardiol，2012；107：237.

2Vita JA.Endothelial function 〔J〕.Circulation，2011；124：e906-12.

3Lum H，Roebuck KA.Oxidant stress and endothelial cell dysfunction 〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol，2001；280：C719-41.

4Gray K，Bennett M.Role of DNA damage in atherosclerosis--bystander or participant 〔J〕? Biochem Pharmacol，2011；82：693-700.

5Cho JH，Chang SA，Kwon HS，etal.Long-term effect of the Internet-based glucose monitoring system on HbA1c reduction and glucose stability：a 30-month follow-up study for diabetes management with a ubiquitous medical care system 〔J〕.Diabetes Care，2006；29：2625-31.

6Quagliaro L，Piconi L，Assaloni R，etal.Intermittent high glucose enhances ICAM-1，VCAM-1 and E-selectin expression in human umbilical vein endothelial cells in culture：the distinct role of protein kinase C and mitochondrial superoxide production 〔J〕.Atherosclerosis，2005；183：259-67.

7Piconi L，Quagliaro L，Da Ros R，etal.Intermittent high glucose enhances ICAM-1，VCAM-1，E-selectin and interleukin-6 expression in human umbilical endothelial cells in culture：the role of poly(ADP-ribose) polymerase 〔J〕.J Thromb Haemost，2004；2：1453-9.

8Ge QM，Dong Y，Zhang HM，etal.Effects of intermittent high glucose on oxidative stress in endothelial cells 〔J〕.Acta Diabetol，2010；47(Suppl 1)：97-103.

9Tapia E，Sánchez-Lozada LG，García-Nio WR，etal.Curcumin prevents maleate-induced nephrotoxicity：relation to hemodynamic alterations，oxidative stress，mitochondrial oxygen consumption and activity of respiratory complex Ⅰ 〔J〕.Free Radic Res，2014；48(11)：1342-54.

10Hou ZQ，Li HL，Gao L，etal.Involvement of chronic stresses in rat islet and INS-1 cell glucotoxicity induced by intermittent high glucose 〔J〕.Mol Cell Endocrinol，2008；291：71-8.

11Wang J，Xing SS，Guo SB，etal.Oxidative DNA damage of lymphocytes in peripheral blood and ascites in cancer patients 〔J〕.Curr Oncol，2012；19(Suppl 2)：eS10-4.

12Zhou Y，Yan H，Guo M，etal.Reactive oxygen species in vascular formation and development 〔J〕.Oxid Med Cell Longev，2013；2013：374963.

13Floyd RA，Towner RA，He T，etal.Translational research involving oxidative stress and diseases of aging 〔J〕.Free Radic Biol Med，2011；51：931-41.

14Quagliaro L，Piconi L，Assaloni R，etal.Intermittent high glucose enhances apoptosis related to oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells：the role of protein kinase C and NAD(P)H-oxidase activation 〔J〕.Diabetes，2003；52：2795-804.

15Piconi L，Quagliaro L，Assaloni R，etal.Constant and intermittent high glucose enhances endothelial cell apoptosis through mitochondrial superoxide overproduction 〔J〕.Diabetes Metab Res Rev，2006；22：198-203.

16Somogyi A，Rosta K，Pusztai P，etal.Antioxidant measurements 〔J〕.Physiol Meas，2007；28：R41-55.

17Liu ZQ，Xing SS，Zhang W.Neuroprotective effect of curcumin on spinal cord in rabbit model with ischemia/reperfusion 〔J〕.J Spinal Cord Med，2013；36：147-52.