人源性抗食管癌細胞單鏈抗體的表達純化及活性鑒定

喬媛媛，熊 鳴，瞿秀華，王欲曉，周麗君，張達矜

食管癌是常見的惡性腫瘤，年死亡率居惡性腫瘤的第六位，嚴重危害人類健康。食管癌由于缺乏有效的檢測標志物和靶向治療藥物，5年的生存率僅有10%[1]。噬菌體抗體庫是篩選獲得人源抗體的重要技術平臺。將基因型與表型集中于一體，將選擇能力與擴增能力偶聯(lián)起來，在體外環(huán)境模擬體內(nèi)抗體形成過程，具有較強的篩選能力[2]。單鏈抗體避免了傳統(tǒng)的單克隆抗體免疫原性強、穿透力弱等缺點，在血清學檢測和靶向治療方面有較大的應用潛力。

本研究以完整活細胞為靶，利用噬菌體抗體展示技術篩選食管癌細胞的抗體，得到抗食管癌細胞表面抗原的單鏈抗體[3-4]。將兩株攜帶噬菌體單鏈抗體的基因進行改造，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中后，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件使目標蛋白表達，獲得重組的抗體蛋白。利用人源大容量噬菌體抗體庫篩選腫瘤細胞抗體的策略，為食管癌的檢測標志物和靶向治療藥物的研發(fā)和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α和pET-28a、pET-SUMO質粒、Mix PCR試劑、DNA凝膠純化試劑盒(購自TIANGEN公司)；Bio-teke多功能DNA純化回收試劑盒購自北京百泰克公司；Pfu DNA聚合酶為美國Thermo Fisher Scientific產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(BamHI、NotI和CpoI)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalac-toside，IPTG)購自Fermentas公司；Anti-Flag、鹽酸胍、咪唑為美國Sigma公司產(chǎn)品；Anti-SUMO為天津三箭公司出品；Yeast Extract和Tryptone為英國OXOID產(chǎn)品；各種鹽類試劑購自國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為美國Millipore純水系統(tǒng)生產(chǎn)?？故彻馨┠[瘤細胞表面抗原ScFv表達質粒由本室構建，質粒提取采用堿裂解法；電泳及酶標儀為美國Bio-Rad公司設備。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增 抽提NFC20b、NFC70a單鏈抗體基因重組質粒，進行PCR擴增，NFC20b擴增引物序列如下：

Forward P：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′

Reverse P：5′-GAATTTTCTGTATGAGG-3′

NFC70a擴增引物序列：

Forward P：5′-CTGCCGGTCCGTCTGTGCTGACGC-3′

Reverse P：5′-CTGCGCGGCCGCTGAGGAGACG-3′

配制150 μL PCR反應體系：NFC20b質粒模板15 μL、引物各8 μL、Mix混合液75 μL、雙蒸水44 μL；反應條件為94 ℃預變性3 min、98 ℃變性10 s、55 ℃退火15 s、72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。NFC70a質粒模板15 μL、引物各8 μL、Mix混合液75 μL、ddH2O 44 μL；反應條件為94 ℃預變性3 min、95 ℃變性15 s、55 ℃退火15 s、72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。分別取兩者擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Bio-teke多功能DNA純化回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2 表達質粒的構建及其轉化 用NotI和BamHI內(nèi)切酶雙酶切pET-28a質粒和NFC20b的PCR擴增片段并以T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細菌。NotI和CpoI內(nèi)切酶雙酶切pET-SUMO質粒和NFC70a的PCR擴增片段并以T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉化TOP10感受態(tài)細胞。轉染后挑取克隆，由諾賽基因公司測序鑒定，測序正確的重組質粒分別命名為pET-NFC20b，pET-NFC70a。

1.2.3 單鏈抗體重組基因的表達鑒定 挑選含重組質粒的多個大腸桿菌單菌落至3 mL含卡那的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至600 nm波長處的吸光值OD600約0.6。取部分菌液作為對照組，余下菌液加入IPTG至終濃度0.5 mmol/L，37℃震蕩培養(yǎng)3 h。留樣后收集菌體，12 000 rpm離心2 min，菌體沉淀以40 μL 1×上樣緩沖液重懸裂解，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測，篩選最優(yōu)化的蛋白誘導表達條件。

1.2.4 單鏈抗體重組蛋白大量表達 取SDS-PAGE檢測有表達的克隆菌液100 μL接種于100 mL含卡那的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜。取100 mL菌液接種于2 L LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃擴大培養(yǎng)至OD600約0.6，降低培養(yǎng)溫度到18 ℃，加入IPTG誘導劑至終濃度0.5 mmol/L，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)3 h。8 000 rpm離心3 min收集菌體，重懸于50 mL預冷NTA-0緩沖液中，冰浴30 min。超聲破碎菌體，參數(shù)設置為功率200 W、工作3 s、暫停4 s、99個循環(huán)。16 000 rpm 4℃離心50 min，收集上清液以及沉淀，取少量上清液及沉淀進行SDS-PAGE檢測。

1.2.5 包涵體蛋白的處理 SDS-PAGE檢測確定重組蛋白以包涵體形式進行表達。將菌體破碎離心后的沉淀用50 mL NTA-0緩沖液重懸，加入二硫蘇糖醇至終濃度1 mmol/L。超聲促進蛋白溶解，設置參數(shù)為功率200 W、工作3 s、暫停3 s、99個循環(huán)。超聲處理后用10 000 rpm 4 ℃離心10 min，去上清液。重復以上步驟至上清液透明。去上清，以3 mL 6M鹽酸胍重懸包涵體，加二硫蘇糖醇至終濃度5 mmol/L，220 rpm 37 ℃震蕩3 h至包涵體全部溶解。10 000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清液進行SDS-PAGE檢測。

1.2.6 包涵體蛋白的復性 以2倍體積的3M鹽酸胍稀釋蛋白溶液，在4℃環(huán)境下用注射器慢速地逐滴加入到200 mL復性液(pH 8.0)中，轉速調節(jié)至最大，攪拌24 h。降低轉速再攪拌24 h，取蛋白溶液于透析袋中，以PEG20000濃縮體積至100 mL。4 ℃以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)透析過夜，以PEG20000濃縮體積至4 mL。再次于4℃用PBS緩沖液透析過夜，取蛋白溶液進行SDS-PAGE檢測。

1.2.7 復性蛋白純化 蛋白溶液用0.22 μm過濾器過濾備用，準備Ni-NTA柱，以1 mL/min的流速上樣上清蛋白溶液，以NTA-0緩沖液(pH 8.0)洗柱至流出液不含蛋白(G250檢測液不變色)；分別以20 mmol/L、60 mmol/L、200 mmol/L和500 mmol/L咪唑洗脫，分段收集洗脫液至G250檢測液不變色，對收集的洗脫液進行SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.8 復性后抗體蛋白的生物學活性 食管癌細胞系KYSE-170、KYSE-150及肝癌細胞系SMMC7721細胞，各以5×104/孔細胞數(shù)接種96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)1 h后水平離心，棄去上清液，用4%多聚甲醛固定30 min后，經(jīng)PBS洗滌3次。用2.5%脫脂奶粉-PBS封閉，加入NFC20b和NFC70a蛋白及陰性對照卵清蛋白，每孔約0.5 μg，37 ℃孵育1 h后，用含0.05%Tween20的PBS洗滌3次后，加入二抗，NFC20b蛋白加入Anti-Flag，MFC70a加入二抗Anti-SUMO，濃度均以1∶1 000稀釋，充分洗滌后，加入HRP-羊抗小鼠IgG，37 ℃反應1 h后加入OPD底物顯色，20%硫酸終止后，酶標儀讀取A490吸光度值。

2 結果

2.1 pET-NFC20b和pET-NFC70a表達質粒的構建分別用NFC20b、NFC70a質粒為模板，分別用引物擴增得到750 bp目的基因片段，NFC20b質粒用NotI和BamHI雙酶切后與原核表達載體pET-28a進行連接，NFC70a質粒用NotI和CpoI雙酶切后與原核表達載體pET-SUMO進行連接。轉化感受態(tài)細胞后鋪瓊脂糖培養(yǎng)盤，挑取克隆，用相應的引物進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增，電泳檢測結果顯示插入載體的750 bp片段與預期片段大小一致，測序結果顯示插入的外源基因與ScFv基因序列完全相同，說明成功構建了pET-NFC20b和pET-NFC70a重組質粒(圖1)。

M:marker；1-3:pET-NFC20b重組質粒的PCR鑒定；4-6:pET-NFC70a重組質粒的PCR鑒定圖1 pET-NFC20b和pET-NFC70a重組質粒PCR鑒定

2.2 單鏈抗體基因的原核表達 挑選含重組質粒的單菌落進行小量培養(yǎng)，取部分菌液作為誘導陰性對照，實驗組加入IPTG誘導劑至終濃度為1 mmol/L，經(jīng)3 h培養(yǎng)后離心取菌體裂解后進行SDS-PAGE檢測，結果顯示IPTG的誘導下重組蛋白進行了表達(圖2)。

A：1，marker；2，pET-NFC20b的未誘導全菌蛋白；3，IPTG誘導全菌蛋白。B：1，marker;2，pET-NFC70a的未誘導全菌蛋白；3，IPTG誘導全菌蛋白箭頭所指為表達的重組蛋白圖2 pET-NFC20b和pET-NFC70a誘導與未經(jīng)誘導陽性菌株全菌蛋白SDS-PAGE電泳圖

2.3 包涵體表達 取保存的陽性克隆菌株進行擴大培養(yǎng)，收集菌體后進行破碎釋放蛋白，經(jīng)高速離心，取上清和沉淀即不溶性大小進行SDS-PAGE檢測，結果顯示重組蛋白主要以包涵體形式進行表達(圖3)。

A：1，marker；2，pET-NFC20b誘導表達破碎后的不溶蛋白;3，誘導表達破碎后的上清蛋白。B：1，marker；2，pET-NFC70a誘導表達破碎后的不溶蛋白；3，誘導表達破碎后的上清蛋白箭頭所指為表達的重組蛋白圖3 pET-NFC20b和pET-NFC70a大量表達的菌體破碎上清液及沉淀SDS-PAGE電泳圖

2.4 包涵體復性及純化 蛋白純化將包涵體溶解后進行滴定復性，得到的可溶性重組蛋白經(jīng)過鎳柱復性技術，得到純度更高的重組，大量表達獲得的重組蛋白包涵體經(jīng)復性及Ni-NTA純化技術純化得到重組蛋白2 mg，重組蛋白純度為90%。經(jīng)SDS-PAGE檢測可知純化后的包涵體蛋白純度達到90%，考馬斯亮藍染色幾乎未見明顯雜帶(圖4)。

A：1，marker；2，pET-NFC20b咪唑洗脫蛋白。B：1，marker；2，pET-NFC70a咪唑洗脫蛋白。箭頭所指為洗脫純化的蛋白。圖4 pET-NFC20b和pET-NFC70a咪唑洗脫蛋白的SDS-PAGE電泳圖

2.5 復性后抗體蛋白的生物學活性 將上述制備表達的NFC20b和NFC70a蛋白進行細胞ELISA的實驗，鑒定其生物學活性。用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)作為對照鑒定其特異性，結果顯示表達的NFC20b和NFC70a單鏈抗體可以與相應的食管癌細胞系KYSE-170、KYSE-150及肝癌細胞系SMMC7721等細胞結合，具有腫瘤細胞的生物學活性，同時與人肺泡上皮細胞A549也有結合(表1)。

表1 復性后蛋白與不同腫瘤細胞的結合活性

注：與OVA組比較，#P<0.05

KYSE-170，KYSE-150:食管癌腫瘤細胞；SMMC7721：肝癌細胞；A549：人肺泡上皮細胞

3 討論

重組蛋白在生物醫(yī)藥研究中的應用增加，原核生物、酵母、哺乳動物細胞等表達重組蛋白系統(tǒng)發(fā)展迅速。原核生物表達系統(tǒng)，主要是大腸桿菌表達系統(tǒng)，具有操作簡便、遺傳背景清楚、表達成本低、周期短且表達蛋白水平高等優(yōu)點，是重組蛋白藥物研究和生產(chǎn)中使用最廣泛的表達系統(tǒng)。大腸桿菌表達系統(tǒng)目前有融合表達、非融合表達、分泌表達、帶純化標簽的表達載體等，而融合表達載體又有pET系列、pTYB、pGEM及pGEX等[5-6]。用于表達的載體類型很多，在實際研究中，要根據(jù)需求選擇合適的、高效穩(wěn)定的表達載體。

本研究運用了pET-20a表達載體構建NFC20b蛋白的表達載體，pET系列應用較廣泛，但對有些蛋白的表達卻不是很理想，本研究中的一個蛋白用此載體就沒有得到表達。而其他一些融合蛋白表達系統(tǒng)蛋白表達量雖然很高，但多數(shù)表達的目的蛋白可溶性較差。這就要求我們?nèi)ふ腋嗟母咝Х€(wěn)定、可溶性較好的表達系統(tǒng)以滿足不同類型基因的表達。

我們采用相關的載體研究本實驗中一個蛋白。SUMO是一種小分子泛素修飾蛋白，廣泛存在于各種真核細胞中，參與調解細胞凋亡、信號轉導、RNA轉錄、蛋白的核質運輸及其細胞周期等生理進程[7]。SUMO有約100個氨基酸組成的保守多肽家族，近年來作為重組蛋白表達的融合標簽和分子伴侶，具有抗蛋白酶水解、增加蛋白表達量，增加重組蛋白的正確折疊等作用，為重組蛋白的純化奠定基礎[8-10]。本研究應用了SUMO作為融合標簽和分子伴侶，與NFC70a融合表達，使重組蛋白能夠在原核表達系統(tǒng)中正確表達折疊，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定，獲得了純度較高的成熟蛋白。細胞ELISA鑒定具有一定的生物學活性。

在37 ℃的條件下誘導3 h得到的融合蛋白的表達量最高，經(jīng)蛋白的可溶性分析，目標蛋白主要以包涵體形式存在。本研究將SUMO和表達基因融合，而SUMO可以和Ni2+結合，為蛋白通過Ni金屬親和層析純化帶來便利，從而獲得較純的重組蛋白。

大腸桿菌表達的外源蛋白質可高達菌體總蛋白質的50%，但是高表達的重組蛋白質會相互交聯(lián)在一起形成包涵體[11]。包涵體比較復雜，由膜包裹的高密度、不溶的蛋白質顆粒，與胞質內(nèi)蛋白質生成速率有關，還被認為是與宿主菌的培養(yǎng)條件等因素有關。包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學活性，要得到具有生物學功能的蛋白必須將包涵體變性，并進行蛋白質的復性。包涵體復性是蛋白制備的難題，不同的蛋白復性條件各不相同，很多學者對包涵體的形成及復性的各種合適條件進行研究。我們使用6M的鹽酸胍處理，使包涵體更好地溶解，采用含有2M尿素的谷胱甘肽氧化還原復性緩沖液體對蛋白進行復性。重組的目的蛋白C端帶有His標簽，可與帶有鎳離子(Ni2+)的親和層吸柱螯和，洗脫純化重組蛋白。經(jīng)Ni-NTA柱純化后獲得了純度為90%的變性蛋白，得到的純化重組蛋白采用間接細胞ELISA法檢測其結合活性，結果顯示蛋白與食管腫瘤細胞系能夠結合。

本研究通過人源的大容量抗體庫篩選食管癌細胞相關抗原的抗體的方法，得到兩個抗食管癌腫瘤細胞表面抗原單鏈抗體NFC20b和NFC70a，是經(jīng)過白細胞差減淘篩，經(jīng)細胞ELISA鑒定能與食管癌細胞等上皮來源的細胞膜有特異性結[12]，可以將大容量抗體庫中篩選的抗體作為腫瘤檢測的標志物，因此通過噬菌體抗體庫篩選腫瘤細胞抗體是切實可行的策略。

之后通過載體構建，原核細胞內(nèi)實現(xiàn)抗體蛋白的表達，又綜合包涵體變性、復性、純化等步驟，為今后食管癌的檢測及治療方面的應用研究奠定了基礎。

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