ZNF268 基因干擾片段轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移的影響及其機(jī)制

夏震，張琳，蘇琛輝

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院附屬深圳市人民醫(yī)院，廣東深圳518000)

卵巢癌是婦科常見的腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌和子宮頸癌[1]。卵巢癌早期缺乏特異性臨床癥狀，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于晚期[2]；卵巢癌存在多種亞型，不同亞型的組織學(xué)來源不同，治療方法也存在著差異，因此卵巢癌的針對(duì)治療尤為困難[3]。鋅指268(ZNF268)翻譯的蛋白在結(jié)構(gòu)上分為KRAB結(jié)構(gòu)以及鋅指結(jié)構(gòu)基序兩個(gè)部分，。Hamilton等[4]發(fā)現(xiàn)KRAB型鋅指蛋白雖然在脊椎動(dòng)物中大量存在，在進(jìn)化進(jìn)程上卻是很晚才出現(xiàn)的，調(diào)查發(fā)現(xiàn)它在魚類、酵母、細(xì)菌等低等生物中不表達(dá)，在高等生物如人、鼠、雞體內(nèi)廣泛存在，提示KRAB型鋅指蛋白參與物種的進(jìn)化。目前關(guān)于ZNF268在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究較少。cyclin D2、 cyclin E2和CDK2為細(xì)胞周期作為從G0/G1向S期運(yùn)行的正向調(diào)節(jié)蛋白其表達(dá)水平是否得到有效的提高，對(duì)研究ZNF268在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制有著重要的作用。為此，2017年5～10月，我們觀察了抑制ZNF268基因表達(dá)對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖、遷移、周期的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑及儀器 卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3 購自中科院上海細(xì)胞庫。攜帶ZNF268 基因干擾片段的重組慢病毒載體(SKOV-3-sh-ZNF268)由廣州賽業(yè)生物科技有限公司構(gòu)建，其中質(zhì)粒載體為pLLU2G，帶有GFP 標(biāo)簽，sh-control 為對(duì)照載體，sh-ZNF268 為干擾實(shí)驗(yàn)載體，其病毒液滴度均為 4.0×108TU/mL，用無血清無雙抗的DMEM 稀釋10 倍后分裝，每管120 μL，-80 ℃可長期保存。限制性內(nèi)切酶系統(tǒng)(Takara)購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA 聚合酶(KOD Plus TOYOBO)購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；T4 DNA 連接酶(Takara)購自寶生物工程(大連)有限公司；RNase A(10 mg/mL)購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；β-actin(C4)(Santa Cruz)購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司；anti-SD為本實(shí)驗(yàn)室制備，含有針對(duì)ZNF268 蛋白的空間域，能夠檢測ZNF268a 和ZNF268b2 兩種蛋白表達(dá)，兔來源；anti-E3為本實(shí)驗(yàn)室制備，針對(duì)ZNF268 基因3 號(hào)外顯子的編碼產(chǎn)物，能夠檢測ZNF268a 蛋白的抗體，兔來源；細(xì)胞周期蛋白及相關(guān)蛋白激酶cyclinD1、cyclin D2、cyclinD3、cyclinE1、cyclin E2、CDK2、CDK4、CDK6檢測試劑盒購自美國Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗 (HRP-IgG)購自Pierce,公司。超純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自美國OMEGA生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace-α,TOYOBO)購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；熒光定量試劑盒Realtime PCR Master Mix(SYBR Green)購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞分組及SKOV-3-sh-ZNF268轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長期SKOV-3 細(xì)胞，分為觀察組和對(duì)照組兩組，分別轉(zhuǎn)染SKOV-3-sh-ZNF268、SKOV-3-sh-control，后通過實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting兩種方法檢測兩組細(xì)胞SKOV-3-sh-control和SKOV-3-sh-ZNF268中ZNF268在轉(zhuǎn)錄以及翻譯水平上的表達(dá)情況，顯示觀察組中ZNF268 mrNA及蛋白的表達(dá)均下調(diào)，證明已成功構(gòu)建下調(diào)ZNF268的穩(wěn)定卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3-sh-ZNF268和空白對(duì)照細(xì)胞系SKOV-3-sh-control，用上述兩細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 兩組細(xì)胞增情況觀察 ①M(fèi)TT法觀察OD值。取兩組細(xì)胞， 消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后準(zhǔn)備鋪 96 孔板共5 塊，兩組各6 個(gè)復(fù)孔；用 McCoy's 5A 培養(yǎng)基重懸稀釋細(xì)胞使其濃度為8×104/mL，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，放置在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每隔一天取出一塊 96孔板，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg/mL，pH值7.4)，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h；將培養(yǎng)基與 MTT 吸出，避免液體殘留影響吸光值的測定，每孔加入100 μL的DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解；采用自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在 570 nm波長處的光密度值(OD)。取平均值。②軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察克隆形成率。將事先配好的 0.9%和1.6%的軟瓊脂微波加熱溶解，然后置于42 ℃水浴鍋中保溫；按照 1∶2 的比例混合1.6%的瓊脂糖和McCoy's 5A 培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20%的胎牛血清)，取3 mL 混合液注入直徑6 cm 平皿中，冷卻凝固，作底層瓊脂置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中備用。取對(duì)數(shù)生長期兩組細(xì)胞消化離心收集，用含有 20%血清的McCoy's 5A 培養(yǎng)基重懸稀釋至濃度為4 000 /mL 和12 000 /mL 兩個(gè)濃度梯度；按照 1∶2 的比例混合0.9%的瓊脂糖和上述細(xì)胞懸液，取3 mL 注入鋪有1.6%瓊脂糖底層平皿中，每組濃度鋪3 個(gè)平行皿，待上層瓊脂凝固后，用封口膜密封，置入 37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖，當(dāng)能夠觀察到明顯細(xì)胞克隆形成后，每個(gè)平皿加入1 mL 的碘硝基四唑紫，放入培養(yǎng)箱染色1 h，拍照計(jì)數(shù)，觀察兩組細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 兩組細(xì)胞遷移情況觀察 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期兩組細(xì)胞，消化細(xì)胞后鋪 6 孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為106個(gè)；細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶 80%左右準(zhǔn)備劃痕，用200 μL的槍頭比著直尺均勻地劃橫縱線，大約每隔1 cm 劃1道；1×PBS 緩沖液清洗細(xì)胞3 次，去處劃痕后脫落下的細(xì)胞，加入含有2%胎牛血清的McCoy's 5A 培養(yǎng)基；將 6 孔板放回37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每過 12 h 觀察，劃痕后24時(shí)拍照。測量兩組劃痕寬度并計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移數(shù)量。

1.5 兩組細(xì)胞周期分布檢測 采用碘化丙啶(PI)單染法和流式細(xì)胞術(shù)。待細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，消化離心收集細(xì)胞SKOV-3-sh-control和SKOV-3-sh-ZNF268各3瓶于1.5 mL離心管中，約2×106個(gè)細(xì)胞；加入1 mL冰預(yù)冷的1×PBS緩沖液清洗細(xì)胞兩次，用移液槍輕輕吹打使細(xì)胞分散。室溫下1 000 g離心5 min，棄上清；加入500 μL 70%的乙醇，置于4 ℃冰箱固定2 h；加入1 mL冰預(yù)冷的1×PBS清洗細(xì)胞兩次；室溫下1 000 g離心5 min，棄上清；加入RNase(10 mg/mL)使其終濃度為1 mg/mL，將離心管置于37 ℃，水浴30 min(此步驟勿渦旋振蕩)；加入500 μL的PI綜合染液染色5 min，振蕩混勻，避免細(xì)胞成團(tuán)；用300目的濾網(wǎng)過濾，轉(zhuǎn)移到流式管中，在流式細(xì)胞儀上，采用488 nm的激發(fā)波長，在FL3通道檢測。使用 Flowjo 軟件計(jì)算各期細(xì)胞比例。

1.6 兩組細(xì)胞cyclin D2、cyclin E2和CDK2蛋白檢測 收集5×105～10×105個(gè)細(xì)胞于1.5 mL離心管中，2 000 g離心5 min，棄上層培養(yǎng)基；每管加入1 mL PBS重懸，2 000 g離心5 min，用移液槍吸盡上清，準(zhǔn)備制蛋白樣或放入-80 ℃冰箱保藏。配制反應(yīng)液：按ReagentA∶ReagentB=50∶1的比例配制反應(yīng)液(按每孔200 μL的用量配制)；待測樣品的準(zhǔn)備：在96孔板中用去離子水稀釋5倍蛋白樣(20 μL H2O+5 μL Sample)；每孔加入200 μL反應(yīng)液，37 ℃低速振蕩反應(yīng)30 min；于570 nm波長下測吸光值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞OD570比較 轉(zhuǎn)染不同時(shí)間兩組細(xì)胞OD570比較見表1。轉(zhuǎn)染1、2、3、4、5 d觀察組細(xì)胞OD570均高于對(duì)照組 (P均<0.05)。

表1不同轉(zhuǎn)染時(shí)間兩組細(xì)胞OD570比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞克隆形成率比較 對(duì)照組、觀察組細(xì)胞克隆形成率分別為9.7%±2.31%和19.2%±1.5%，兩組細(xì)胞克隆形成率相比，P<0.05。

2.3 兩組劃痕寬度和遷移細(xì)胞數(shù)比較 培養(yǎng)24 h后兩組細(xì)胞的劃痕仍然明顯存在，但是觀察組、對(duì)照組劃痕寬度分別為(2.53±0.12)、(1.28±0.11)μm，兩組劃痕寬度相比，P<0.05；觀察組、對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量分別為(67.59±6.54)、(136.92±10.28)個(gè)，兩組細(xì)胞遷移數(shù)量相比，P<0.05。

2.4 兩組細(xì)胞周期比較 觀察組處于細(xì)胞周期G0/G1、S和G2/M期的細(xì)胞比例分別為62.3%±1.9%、23.0%±1.2%和14.7%±1.8%，對(duì)照組處于細(xì)胞周期G0/G1、S和G2/M期的細(xì)胞比例分別為53.8%±1.8%、19.1%±0.4%和27.1%±2.2%。與對(duì)照組比較，觀察組處于G0/G1期和S期的細(xì)胞比例增加，而G2/M期的細(xì)胞比例減少，P均<0.05。

2.5 兩組細(xì)胞cyclin D2、cyclin E2和CDK2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 兩組細(xì)胞cyclin D2、cyclin E2和CDK2蛋白相對(duì)表達(dá)量見表2。觀察組細(xì)胞cyclin D2、cyclin E2和CDK2蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 兩組細(xì)胞cyclin D2、cyclin E2和CDK2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05。

3 討論

卵巢癌是婦科常見的腫瘤之一，在所有婦科癌癥中，其發(fā)病率僅次于乳腺癌和子宮頸癌，位居第三位，并且早期的卵巢癌由于缺乏特異性癥狀而難以被檢測出，大多數(shù)患者在檢測出卵巢癌時(shí)疾病已經(jīng)發(fā)展為晚期，而此時(shí)已錯(cuò)過了癌癥治療的最佳時(shí)間。另一方面，由于卵巢癌存在多種亞型，不同亞型的組織學(xué)來源不同，相應(yīng)的治療方法也存在著差異，因此針對(duì)卵巢癌的治療顯得尤為困難[5，6]。目前研究發(fā)現(xiàn)ZNF268與多種癌癥相關(guān)。

Zhao等[11]選取了45例惡性血細(xì)胞瘤患者以及17例健康人的外周血，用巢式PCR的方法檢測了不同轉(zhuǎn)錄本在癌癥患者以及健康人體內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZNF268a、ZNF268c、ZNF268f和ZNF268g轉(zhuǎn)錄本有差異表達(dá)，提示上述轉(zhuǎn)錄本可能成為惡性血液細(xì)胞瘤的檢測標(biāo)志。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)在人類T細(xì)胞白血病1型病毒(HTLV-1)感染后的Hut102細(xì)胞中，癌蛋白Tax能夠通過調(diào)節(jié)CREB-1而非CREB-2結(jié)合ZNF268上的結(jié)合位點(diǎn)來抑制其表達(dá)，提示ZNF268可能參與與HTLV-1感染引起的T細(xì)胞淋巴白血病。Zeng等[13]在研究ZNF268對(duì)造血分化的作用時(shí)，利用慢病毒介導(dǎo)的干擾片段下調(diào)ZNF268表達(dá)，以血細(xì)胞系K562為研究模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)ZNF268后K562細(xì)胞本地水平的凋亡受到抑制，體外細(xì)胞計(jì)數(shù)以及裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)下調(diào)ZNF268能夠促進(jìn)K562細(xì)胞的增殖，以上結(jié)果表明ZNF268可能是個(gè)潛在的抑癌基因。另外，ZNF268在染色體上的定位為12q24.33，而Engelmark等[14]利用全基因組連鎖掃描的方法發(fā)現(xiàn)12q24是宮頸癌發(fā)生的敏感位點(diǎn)，并且該位點(diǎn)是許多跟抵抗病毒感染、免疫調(diào)節(jié)及抑制腫瘤增殖基因所處的區(qū)域，提示ZNF268可能與宮頸癌的發(fā)生具有一定聯(lián)系。

文獻(xiàn)報(bào)道，ZNF268在卵巢癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，而在正常卵巢組織中沒有表達(dá)[15]，故筆者推測下調(diào)ZNF268能夠抑制卵巢癌的發(fā)生發(fā)展，并進(jìn)行了本研究。通常情況下，癌癥的發(fā)展首先是由細(xì)胞無節(jié)制的增殖引起的，當(dāng)癌細(xì)胞發(fā)展到一定的程度，便會(huì)向周圍組織器官轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[16]。盡管增殖與遷移擴(kuò)散具有某些共同的信號(hào)通路，如NF-κB，然而增殖與遷移是兩個(gè)不同的生理過程，細(xì)胞增殖是通過細(xì)胞分裂增加細(xì)胞數(shù)量的過程，是生物繁殖和癌癥發(fā)生所必需的；而細(xì)胞遷移是細(xì)胞群的移動(dòng)，并非癌癥發(fā)生的必經(jīng)階段。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要標(biāo)志[17，18]，同時(shí)也是癌癥患者的主要死亡原因。本研究用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察了下調(diào)ZNF268對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3遷移的影響，結(jié)果顯示下調(diào)ZNF268表達(dá)的觀察組細(xì)胞的劃痕寬度大于對(duì)照組，遷移細(xì)胞數(shù)量少于對(duì)照組，表明遷移速度慢于對(duì)照組，表明下調(diào)ZNF268表達(dá)能夠抑制SKOV-3細(xì)胞的遷移。

細(xì)胞無限增殖是癌細(xì)胞的重要標(biāo)志，本研究用體外MTT以及克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察下調(diào)ZNF268對(duì)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示下調(diào)ZNF268能夠促進(jìn)SKOV-3細(xì)胞增殖。提示ZNF268在卵巢癌SKOV-3細(xì)胞系中可能發(fā)揮一種抑制癌癥發(fā)展的作用，ZNF268表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)，癌癥進(jìn)一步發(fā)展[19，20]。同時(shí)，本研究就下調(diào)ZNF268對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3促進(jìn)細(xì)胞增殖效應(yīng)的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探討，采用PI單染法檢測細(xì)胞周期變化，結(jié)果顯示下調(diào)ZNF268能夠改變SKOV-3細(xì)胞周期的分布。隨后用Western blotting法檢測了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)ZNF268以后，cyclin D2、cyclin E2及CDK2的表達(dá)水平均提高。以上結(jié)果提示，下調(diào)ZNF268細(xì)胞促進(jìn)SKOV-3細(xì)胞增殖的可能通過上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D2、cyclin E2及CDK2表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來實(shí)現(xiàn)。

[1] 陳俊臣,劉恩令.卵巢癌靶向治療藥物偶聯(lián)靶點(diǎn)的研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué),2016,45(30):4305-4307,4313.

[2] 張愛民,常艷敏,郝艷萍，等.卵巢癌早期檢測的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2016,20(10):1795-1798.

[3] 梁凡,陳亞萍,楊恭，等.癌間質(zhì)細(xì)胞與卵巢癌治療相關(guān)性研究進(jìn)展[J].中國癌癥雜志,2016,26(4):351-357.

[4] Hamilton AT, Huntley S, Kim J, et al. Lineage-specific expansion of KRAB zinc-finger transcriptionfactor genes: implications for the evolution of vertebrate regulatory networks[J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 2003,68(8):131-140.

[5] 李萬春, 涂頻.MicroRNA與卵巢癌[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2012,25(12):1337-1340.

[6] 楊筱鳳, 郭艷平.重視與遺傳相關(guān)的卵巢癌[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2017,38(5):625-632.

[7] 黎靜, 宋蘭林, 鐘梅.鋅指蛋白217基因?qū)θ寺殉矟{液性囊腺癌上皮細(xì)胞HO-8910生物學(xué)行為的影響[J].中華腫瘤雜志,2013,35(3):170-174.

[8] 袁軍, 江曉紅.抗苗勒管激素和鋅指蛋白-265在卵巢顆粒細(xì)胞瘤及Sertoli細(xì)胞瘤中的表達(dá)[J].浙江實(shí)用醫(yī)學(xué),2016,21(3):164-166.

[9] 劉道真, 鄭敏云.Annexin3 A3與鋅指蛋白217在卵巢癌組織表達(dá)與鉑類藥物耐藥的關(guān)系[J].江西醫(yī)藥,2017,52(2):113-115,120.

[10] Chun JN, Song IS, Kang DH, et al. A splice variant of the C(2)H(2)-type zinc finger protein, ZNF268s,regulates NF-kappaB activation by TNF-alpha[J]. Mol Cells, 2008,26(2):175-180.

[11] Zhao Z, Wang D, Zhu C, et al. Aberrant alternative splicing of human zinc finger gene ZNF268 inhuman hematological malignancy[J]. Oncol Rep, 2008. 20(5):1243-1248.

[12] Wang D, Guo MX, Hu HM, et al. Human T-cell leukemia virus type 1 oncoprotein tax represses ZNF268expression through the cAMP-responsive element-binding protein/activating transcriptionfactor pathway[J]. J Biol Chem, 2008,283(24):16299-16308

[13] Zeng Y, Wang W, Ma J, et al. Knockdown of ZNF268, which is transcriptionally downregulated byGATA-1, promotes proliferation of K562 cells[J]. PLoS One, 2012,7(1):29518.

[14] Engelmark MT, Ivansson EL, Maqnusson JJ, et al. Identification of susceptibility loci for cervical carcinoma bygenome scan of affected sib-pairs[J]. Hum Mol Genet, 2006,15(22):3351-3360.

[15] Hu L, Wang W, Cai J, et al. Aberrant expressionof ZNF268 alters the growth and migration of ovarian cancer cells[J]. Oncol Lett, 2013 ,6(1):49-54.

[16] Zhang X, You X, Wang Q, et al. Hepatitis B virus X protein drives multiple cross-talk cascade loops involving NF-kappaB, 5-LOX, OPN and Capn4 to promote cell migration[J]. PLoS One, 2012,7(2):31458.

[17] 黃鶯,吳黎明,張玲,等.MACC1對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2016,20(10):1623-1626.

[18] 孫艷,齊政,王德華,等.miR-186通過靶定CEA抑制宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[J].天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,22(4):288-290,294.

[19] 朱晨剛,郭明雄,邵煥杰,等.ZNF268基因在實(shí)體瘤中的差異拼接模式[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,44(1):66-70.

[20] 朱晨剛,郭明雄,邵煥杰,等.hUPF1的兩個(gè)功能位點(diǎn)對(duì)調(diào)控ZNF268基因轉(zhuǎn)錄活性的影響[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,39(1):60-64.