表達IP10基因重組新城疫病毒的拯救

郭順利，謝美玉，賓曉蕓，石明霞，陳安寧，陳思宇，周素芳

(廣西醫(yī)科大學，南寧530021)

近年溶瘤病毒能夠增強腫瘤相關(guān)抗原的表達，引起腫瘤特異性免疫反應(yīng)[1]。新城疫病毒(NDV)作為溶瘤病毒家族中的一員也逐漸被人們認識[2]。NDV為副黏病毒科、腮腺炎病毒屬的單股負鏈RNA病毒，核酸長度為15 186 bp，核酸序列為3＇-NP-P-M-F-HN-L-5＇，每個基因都有獨立的基因起始區(qū)(GS)、基因終止區(qū)(GE)和基因間序列[3]。根據(jù)對鳥類致病力不同可將病毒分為強毒株、中強毒株、弱毒株。NDV的致病性通常被認為由F基因所決定。F基因產(chǎn)生的F蛋白以F0融合蛋白形式存在，只有經(jīng)胰蛋白酶作用后才具有重新感染細胞的能力[4]。NDV感染人體后，不依賴于人體細胞分裂，能夠獨立復制，且不會將基因組整合到人的基因組中。另外，NDV能夠誘導腫瘤細胞凋亡，而對人體正常細胞無明顯不良反應(yīng)[5]。雖然中強毒株對腫瘤的殺傷作用更強，但如保存和利用的不恰當，會給鳥類和家禽業(yè)帶來重大損失；并且中強毒株對正常細胞的殺傷作用也遠高于弱毒株。因此，弱毒株組Lasota是溶瘤的最好選擇。干擾素γ誘導蛋白10(IP10/CXCL10)是細胞因子，為CXC趨化因子家族的一員。通過與CXCR3配體結(jié)合，能夠趨化自然殺傷(NK)細胞，活化CD4+T細胞和CD8+T細胞等[6]。并且，IP10具有抑制血管生成的作用，它能夠獨自[7]或與其他藥物共同作用[8]治療腫瘤。隨著反向遺傳學技術(shù)的迅速發(fā)展，為NDV與免疫治療相結(jié)合提供了可能。2016年6月～2017年1月，本研究將具有腫瘤選擇性的NDV Lasota株和具有趨化免疫細胞的IP10進行基因序列重組，利用反向遺傳學技術(shù)拯救重組病毒rNDV-IP10；且驗證重組病毒的生長動力學和IP10基因的表達，為以后的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、質(zhì)粒及試劑 能穩(wěn)定表達T7 RNA聚合酶的BSR-7細胞、原代雞胚成纖維細胞(CEF細胞)和乳倉鼠腎細胞(BHK-21細胞)均用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)，生長環(huán)境為37 ℃、5% CO2。用弱毒株Lasota作為重組病毒的載體。重組NDV基因組轉(zhuǎn)錄載體pBRN-FL-PmeⅠ及輔助質(zhì)粒pBS-NP、pBS-P、pBS-L、細胞均由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。人肝癌細胞低轉(zhuǎn)移株(MHCC-97L細胞)為本實驗室保存，使用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)。IP10的編碼基因序列由長沙優(yōu)寶生物科技有限公司合成，由pMD18-T載體攜帶。SPF雞胚由哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。重組酶和Taq酶均購自諾唯贊公司。PmeⅠ限制性內(nèi)切酶購自NEB公司。磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司。小鼠抗人Ip10單克隆抗體購自Abcam公司。小鼠抗人β-actin抗體購自武漢三鷹。FITC標記山羊抗鼠抗體購自sigma公司。攜帶IgG-HRP標記的山羊抗小鼠抗體購自北京全式金公司。ECL超敏化學發(fā)光檢測試劑盒購自索萊寶公司。熒光顯微鏡購自奧林巴斯公司。

1.2 攜帶IP10基因質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶切開pBRN-FL-PmeⅠ載體中P和M基因間的PmeⅠ位點。使用IP10上游引物(5′-AGGTCCAACTCTGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAAGTGCC-ACCATGAATCAAACTGCCATTCTG-3′)和下游引物(5′-ATTGCCGCTTGGGTTTAAACTTAAGGAGATCTT-TTAGACCTTTCC-3′)擴增出攜帶GN和GE的IP10基因序列。用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化目的基因片段。將純化的產(chǎn)物用重組酶克隆入pBRN-FL-PmeⅠ載體中，構(gòu)建出攜帶IP10基因的質(zhì)粒。對構(gòu)建的質(zhì)粒進行測序，挑選出正確質(zhì)粒pBRN-FL-IP10。

1.3 重組病毒的拯救 將BSR-7細胞鋪于六孔板中，細胞長滿六孔板約80%，將pBRN-FL-IP10質(zhì)粒5 μg、pBS-NP質(zhì)粒2.5 μg、pBS-P質(zhì)粒1.25 μg、pBS-L質(zhì)粒1.25 μg共轉(zhuǎn)染BSR-7細胞。12 h后用10%的DMSO休克細胞2.5 min，加入完全培養(yǎng)基，24 h后換為opti-MEM并加入1 μg/mL甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮。將細胞放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后刮取細胞，用0.25 μm過濾器過濾混合液，濾液注入9～11日齡SPF雞胚尿囊腔中(400 μL/枚)。注射后的雞胚在孵化箱中繼續(xù)孵育5 d。隨后抽取雞胚尿囊液50 μL，用1%濃度的雞紅細胞測病毒效價。收取效價陽性雞胚尿囊液，于-80 ℃保存。

1.4 重組病毒生長動力學檢測 將NDV和rNDV-IP10以感染復數(shù)(MOI)=0.01分別感染24孔板中的CEF細胞1 h，去除病毒稀釋液，隨后加入含10% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。隔24 h收集細胞培養(yǎng)液，將收集的培養(yǎng)液再次感染CEF細胞。病毒滴度使用終點滴定檢測和50%組織細胞感染量計算。

1.5 重組病毒上外源基因IP10表達檢測 采用間接免疫熒光技術(shù)。分別用NDV、rNDV-IP10以MOI=0.000 1感染BHK-21細胞1 h，去除病毒稀釋液換成含10% FBS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，用1×PBST洗2次；4%的多聚甲醛室溫固定15 min。棄固定液，用1×PBST洗3次，每次5 min。用含1%的BSA溶液室溫封閉1 h。小鼠抗人IP10抗體室溫孵育1 h；棄抗體稀釋液，用1×PBST洗3次，每次5 min；用FITC標記的山羊抗鼠抗體避光孵育30 min。1×PBST洗洗3次，每次5 min。用顯微鏡觀察熒光。

1.6 MHCC-97L細胞內(nèi)IP10蛋白表達檢測 采用Western blotting法。分別用NDV、rNDV-IP10以MOI=0.1感染MHCC-97L細胞1 h，隨后加入含10% FBS的高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，36 h后收獲細胞。將樣品用12% SDS-PAGE分離，然后將凝膠中的樣品通過濕轉(zhuǎn)法90 mA、25 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。小鼠抗人IP10特異性抗體和小鼠抗人β-actin特異性抗體4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體孵育1 h。ECL發(fā)光液浸泡后進行成像分析。

2 結(jié)果

2.1 重組病毒rNDV-IP10的產(chǎn)生 IP10基因序列插入重組病毒質(zhì)粒的P和M基因間，將重組質(zhì)粒命名為pBRN-FL-IP10。重組質(zhì)粒pBRN-FL-IP10和pBS-NP、pBS-P和pBS-L共轉(zhuǎn)染BSR-7細胞，拯救出重組病毒rNDV-IP10。收集培養(yǎng)液注入9～ 11日齡雞胚尿囊腔中擴增，5 d后收取尿囊液測得血凝效價滴度約為1∶256，收取陽性尿囊液。

2.2 重組病毒生長特征 用無外源基因的親本NDV作為對照組。兩種病毒生長特征相似，約72 h時滴度最高。插入外源基因的rNDV-IP10在CEF細胞中能夠如親本一樣正常生長復制。見圖1。

圖1 病毒NDV和rNDV-IP10的生長動力曲線

2.3 重組病毒上外源基因IP10表達情況 間接免疫熒光技術(shù)證實，感染了親本NDV的BHK-21細胞未見綠色熒光，而感染了rNDV-IP10病毒的BHK-21細胞可見綠色熒光。由此可鑒，rNDV-IP10病毒能夠表達IP10。

2.4 IP10基因在MHCC-97L細胞中的表達 感染了rNDV-IP10的MHCC-97L細胞蛋白樣品有特異條帶，而感染了NDV的MHCC-97L細胞未出現(xiàn)條帶。

3 討論

NDV對Ⅰ型干擾素較敏感，許多腫瘤細胞缺乏干擾素信號轉(zhuǎn)導通路，因而NDV能在腫瘤細胞中復制而不能在正常細胞中生長[9]。另外，腫瘤細胞也缺乏相應(yīng)的抗病毒信號通路[10]。數(shù)據(jù)表明，NDV在腫瘤細胞中的復制能力是正常細胞的10 000倍，并且不具有嗜神經(jīng)性[11]。臨床研究結(jié)果表明，即使當人體感染NDV后也僅表現(xiàn)出輕微流感樣病理反應(yīng)，而無其他嚴重的病理反應(yīng)[12]。另外，NDV可刺激機體的免疫功能，通過誘導細胞毒性T細胞、NK細胞、單核細胞等來增強機體的抗瘤作用[13]。雖然部分NDV株被用于臨床，并取得一定的療效[14]，但是其溶瘤療效仍需提高。隨著反向遺傳學技術(shù)的成熟，研究者正通過對NDV進行基因改造來增強溶瘤效果。將外源基因插入NDV基因中發(fā)現(xiàn)，外源基因的插入不會影響病毒的復制，并且目的基因能夠正常表達。更重要的是，重組NDV對腫瘤細胞的選擇性殺傷作用改變，并增強了對腫瘤細胞的殺傷作用。重組NDV明顯抑制了腫瘤的生長，延長了小鼠的生存時間[15]。由于溶瘤病毒能夠打破腫瘤的免疫耐受性，且具有殺傷腫瘤細胞的能力，越來越受人們的關(guān)注。

IP10通過與CXCR3配體結(jié)合定向趨化CD4+T、CD8+T、NK細胞等抑制腫瘤，并且能夠與其他基因或藥物聯(lián)合治療腫瘤，明顯延長了動物生存時間和抑制了腫瘤血管的生成，聯(lián)合治療效果明顯要好于單獨給藥[8]。因此，可將IP10的抗瘤作用與NDV的選擇性作用相結(jié)合治療腫瘤。

本研究中，通過反向遺傳技術(shù)將IP10序列插入NDV基因組中。由于IP10基因序列較短，而Lasota載體過大，使用T4連接酶連接效率過低。本研究通過使用重組酶將此連接陽性率增加。重組酶能夠簡單、高效的將小片段基因連接到大片段載體上，甚至無需對線性化載體及PCR產(chǎn)物進行純化便有很高的連接效率。通過基因組測序選出正確的重組質(zhì)粒，最終成功拯救出了表達IP10基因的rNDV-IP10病毒。為以后探究rNDV-IP10的聯(lián)合抗瘤作用奠定基礎(chǔ)。

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