擬血管生成在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的初步研究

閆 明，馮紅超，許 華，張 偉，李麗艷

(1.河北省眼科醫(yī)院口腔頜面外科，河北邢臺(tái) 054000；2.貴州省貴陽市口腔醫(yī)院口腔頜面外科 550000；河北省眼科醫(yī)院：3.口腔內(nèi)科；4.眼外傷科；5.科教科，河北邢臺(tái) 054000)

實(shí)體腫瘤在生長(zhǎng)和血行轉(zhuǎn)移過程中，必須有血液供應(yīng)。有研究者早在1971年提出腫瘤的血管生成理論[1]，此理論認(rèn)為腫瘤血管的生成是促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。隨后，該理論成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，一直被研究者認(rèn)為是腫瘤獲得血液供應(yīng)的唯一途徑。國(guó)外學(xué)者在1999年研究葡萄膜黑色素瘤時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種新的腫瘤供血微循環(huán)結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)由腫瘤細(xì)胞圍成無內(nèi)皮細(xì)胞參與的管道結(jié)構(gòu)，此管道功能與血管相同，將這種新結(jié)構(gòu)命名為擬血管生成(VM)[2]。VM結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的腫瘤血管生成不同，后經(jīng)國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究證實(shí)，VM存在于多種腫瘤中，例如肝癌、前列腺癌、乳腺癌等[1]，亦包括口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)。OSCC是一類嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤[3]，占口腔惡性腫瘤的80%，在頭頸鱗癌(HNSCC)中也占較大比例，病死率也較高。當(dāng)前治療手段是手術(shù)切除病灶，但其有著較高的術(shù)后5年復(fù)發(fā)率[4]，因此研究OSCC的血液供應(yīng)模式，找到有效的抗血管措施就顯得尤為重要。OSCC中是否存在VM尚不清楚。本研究使用特殊組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)結(jié)合的雙重染色技術(shù)證實(shí)了OSCC中存在VM，并進(jìn)一步探討了VM的生物學(xué)行為及其存在的臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科及河北省眼科醫(yī)院口腔頜面外科2013年2月至2016年9月收治的并經(jīng)病理證實(shí)的42例OSCC患者，同時(shí)收集其經(jīng)手術(shù)切除、并經(jīng)甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋的組織標(biāo)本。其中男34例，女8例；年齡41～74歲，中位年齡53歲；發(fā)生于舌者26例，發(fā)生于頰部者9例，發(fā)生于牙齦者4例，發(fā)生于其他部位者(包括腭、口底)3例；按病理分級(jí)劃分，Ⅰ級(jí)7例，Ⅱ級(jí)20例，Ⅲ級(jí)15例；正常黏膜7例。

1.2儀器與試劑 Mouse anti-CD31鼠抗人CD31單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，編號(hào)：ZM-0044)；PV-9000二步法檢測(cè)系統(tǒng)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，編號(hào)：PV-9000-3)；通用型SP系列工作液試劑盒(SP-9000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；AB-PAS染色試劑盒(上海源葉生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，編號(hào)：zsZLI-9031)。

1.3方法 病理切片的脫蠟、水化、抗原修復(fù)：將切片置于檸檬酸緩沖溶液(0.01 mol/L，pH=6.0)熱修復(fù)專用容器中，高壓鍋中放水煮沸，后噴霧2 min取出。每張標(biāo)本切片滴加1滴一抗(anti-CD31，1∶100)，置于4 ℃冰箱過夜孵育。次日將孵育完成的切片取出，冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)每個(gè)切片沖洗3次，每次3 min。每張標(biāo)本切片滴加1滴聚合物增強(qiáng)劑，37 ℃孵育20 min；再用PBS沖洗3次，每次3 min。每張標(biāo)本切片滴加1滴辣根酶標(biāo)記的羊抗兔/小鼠IgG聚合物，37 ℃孵育30 min，之后用PBS液沖洗3次，每次3 min。DAB顯色約5～8 min，顯微鏡下觀察到血管內(nèi)皮顯色后，立即使用自來水沖洗3 min終止顯色反應(yīng)。使用0.5%的過碘酸溶液將切片浸泡還原8～10 min。使用流水沖洗3 min，將其置入Schiff液中，避光進(jìn)行反應(yīng)約13 min。之后用蒸餾水反復(fù)沖洗3次，每次1 min，再用自來水沖洗5 min。蘇木素淺染細(xì)胞核1～2 min，再次使用自來水沖洗終止染色反應(yīng)。鹽酸酒精分化后，自來水返藍(lán)。常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠將標(biāo)本封片。嚴(yán)格控制所用試劑應(yīng)用條件，采用腎臟組織切片作為過碘酸雪夫染色(PAS)陽性片，PBS為陰性對(duì)照；采用已知的OSCC作為CD31的陽性片，PBS為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定

1.4.1陽性結(jié)果判定 CD31陽性結(jié)果為相應(yīng)部位呈棕黃色顆粒著色，主要位于細(xì)胞膜；PAS陽性部位為基底膜，相應(yīng)部位呈淡粉色著色。

1.4.2腫瘤微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)與方法 MVD參考文獻(xiàn)[5]的方法：棕黃或棕褐色的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán)、如分界清楚則作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)。10×10倍視野下掃視整個(gè)切片，尋找3個(gè)高血管密度區(qū)，換成10×40倍視野，計(jì)微血管個(gè)數(shù)。取平均數(shù)，計(jì)算MVD值(個(gè)/單位面積)，反映新血管生成密度。

1.4.3VM的判斷標(biāo)準(zhǔn) 參考文獻(xiàn)[2]的方法。VM的形態(tài)學(xué)和生理特征：(1)腫瘤細(xì)胞組成了管壁；(2)管壁結(jié)構(gòu)無內(nèi)皮細(xì)胞，PAS染色陽性物質(zhì)將管壁結(jié)構(gòu)與其余腫瘤組織分開；(3)管腔內(nèi)有紅細(xì)胞；(4)VM周圍腫瘤壞死現(xiàn)象很少見到；(5)免疫組織化學(xué)染色的內(nèi)皮特異標(biāo)記(CD31、CD34等)呈陰性反應(yīng)；(6)良性腫瘤及低侵襲性腫瘤中少見，主要被發(fā)現(xiàn)于高侵襲性腫瘤中。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。等級(jí)資料的組間比較采用非參數(shù)的秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1染色結(jié)果 經(jīng)過了CD31、PAS雙染的42例OSCC患者石蠟切片，經(jīng)光鏡觀察，其中有15例(35.71%)中存在典型的VM。內(nèi)皮構(gòu)成的血管在光鏡下顯示為：由CD31染色陽性的內(nèi)皮圍成管腔樣或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，PAS染色的基質(zhì)存在于腫瘤與管壁間。與典型的內(nèi)皮血管不同的是，VM直接由腫瘤細(xì)胞圍成管道樣結(jié)構(gòu)，管道中可見紅細(xì)胞。CD31染色陽性的物質(zhì)不存在于此結(jié)構(gòu)中，這說明了此結(jié)構(gòu)無內(nèi)皮細(xì)胞參與構(gòu)成。PAS陽性物質(zhì)可連續(xù)或者不連續(xù)的存在于紅細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間。VM的另一種結(jié)構(gòu)方式也可在本研究中觀察到：PAS染色陽性的物質(zhì)呈條索狀或網(wǎng)狀。在VM結(jié)構(gòu)周圍無壞死腫瘤細(xì)胞、炎性細(xì)胞。其中，另外一種重要的陽性管道結(jié)構(gòu)——淋巴管的顯微鏡下形態(tài)特點(diǎn)是管腔較大，很不規(guī)則，由連續(xù)的單層內(nèi)皮細(xì)胞圍成。內(nèi)皮細(xì)胞外無基底膜，偶見有內(nèi)皮細(xì)胞連接處。

2.2OSCC中VM與臨床病理資料的關(guān)系 OSCC中VM與性別、年齡、腫瘤部位等無明顯相關(guān)性(P>0.05)，腫瘤直徑≥1.5 cm的VM陽性率(38.23%)高于腫瘤直徑<1.5 cm組的陽性率(25.00%)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；無壞死組VM陽性率(41.37%)雖然高于有壞死組陽性率(23.07%)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3OSCC中VM與病理分級(jí)的關(guān)系 病理分級(jí)為Ⅰ級(jí)的患者中有1例VM生成[14.28%(1/7)]，Ⅱ級(jí)患者中有6例VM生成[30.00%(6/20)]；Ⅲ級(jí)患者中有8例VM生成[53.33%(8/15)]。秩和檢驗(yàn)結(jié)果提示，病理分級(jí)惡性程度越高，VM陽性率也越高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.193，P=0.028)。

2.4OSCC中VM與頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 在16例頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，VM陽性11例；在27例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，VM陽性5例。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，OSCC發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者其VM陽性率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.286，P<0.01)。

表1 OSCC中VM與臨床病理資料的關(guān)系(n)

2.5OSCC中VM與MVD的關(guān)系 OSCC中VM陽性組的MVD值(44.20±11.42)高于VM陰性組的MVD值(36.25±9.27)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.333)。

3 討 論

3.1OSCC的臨床病理特征 42例OSCC患者中男∶女為4.25∶1，與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的男性發(fā)病率高于女性符合[4]。發(fā)生部位以舌多見，其次為頰、牙齦，其他部位亦有發(fā)病者，例如腭、口底，但均少見；OSCC患者易發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，42例中有16例發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；其與臨床病理特征及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致。

3.2OSCC中VM的形態(tài)特征 經(jīng)過CD31、PAS雙染后，光鏡下可見腫瘤細(xì)胞組成了管道樣結(jié)構(gòu)存在于OSCC標(biāo)本中，此結(jié)構(gòu)無內(nèi)皮細(xì)胞參與，管腔與內(nèi)皮性血管相通，紅細(xì)胞存在于此結(jié)構(gòu)中。CD31即血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(PECAM-1)，是一種表達(dá)于血管內(nèi)皮的連接分子，其在免疫組織化學(xué)中的作用是標(biāo)記血管，是內(nèi)皮依賴性血管存在的標(biāo)志。VM結(jié)構(gòu)無內(nèi)皮參與，CD31染色陰性，為了鑒別VM與內(nèi)皮性血管，其在本研究中用來標(biāo)記腫瘤內(nèi)皮性血管。結(jié)合HE染色鏡下觀察，本研究發(fā)現(xiàn)，在部分OSCC中存在PAS陽性，而構(gòu)成這些管道的細(xì)胞anti-CD31抗體染色陰性，部分管道內(nèi)有紅細(xì)胞的存在，說明構(gòu)成這種管道樣結(jié)構(gòu)的非內(nèi)皮細(xì)胞而可能是口腔鱗癌細(xì)胞，光鏡下觀察符合定義的VM結(jié)構(gòu)[6]，與文獻(xiàn)[7-8]在晚期卵巢惡性腫瘤組織及在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)的VM結(jié)構(gòu)一致。這表明OSCC中也存在VM。

PAS主要表達(dá)于纖維結(jié)締組織，VM結(jié)構(gòu)中其作用是分隔腫瘤細(xì)胞與紅細(xì)胞，在正常內(nèi)皮性血管中則構(gòu)成基底。本研究發(fā)現(xiàn)，PAS陽性物質(zhì)是VM組成的一部分，且VM腔內(nèi)也發(fā)現(xiàn)有PAS染色陽性物質(zhì)，其來源可能是腫瘤細(xì)胞分泌。

有研究發(fā)現(xiàn)，很多黑色素瘤體積很大，卻并沒有出現(xiàn)壞死現(xiàn)象[2]。LUO等[2]研究卵巢癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，有VM結(jié)構(gòu)的腫瘤組織壞死很少或者沒有壞死，而沒有VM結(jié)構(gòu)的則有明顯壞死。本研究只得出了有VM組壞死率低于無VM組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能原因?yàn)閂M為腫瘤組織提供了血供，使腫瘤發(fā)生壞死的可能性降低。亦有可能是樣本量不足，異質(zhì)性大所造成，此方面本課題組將在今后做深入研究。

有研究者發(fā)現(xiàn)使用微循環(huán)注射熒光染料進(jìn)管腔后，染料播散至整個(gè)腫瘤組織[9-10]，F(xiàn)RANCESCONE等[6]構(gòu)建的WIBC-9荷瘤鼠模型都證明了VM是具有功能的管道，其作用是聯(lián)通內(nèi)皮性血管，為腫瘤供血。本研究使用了MVD計(jì)數(shù)方法，按照有無VM分為兩組，兩組結(jié)果的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能與樣本數(shù)量少有關(guān)，無法證明VM為一種功能性管道。

3.3OSCC中VM的生物學(xué)意義 本次研究發(fā)現(xiàn)VM管腔內(nèi)有紅細(xì)胞。姚伶俐等[11]在人前列腺癌中發(fā)現(xiàn)VM結(jié)構(gòu)存在紅細(xì)胞，表明VM作為一種特殊的微循環(huán)結(jié)構(gòu)為腫瘤提供血供。腫瘤的生長(zhǎng)需要血液供應(yīng)，當(dāng)發(fā)生缺氧時(shí)可以誘導(dǎo)VM，否則腫瘤細(xì)胞會(huì)因?yàn)槿毖毖醢l(fā)生壞死。這也解釋了VM中的腫瘤內(nèi)少有壞死現(xiàn)象的出現(xiàn)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，VM為OSCC的頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供了途徑，有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者VM陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。因此VM的存在對(duì)OSCC是否發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著重要意義。

綜上所述，腫瘤中有無VM結(jié)構(gòu)，對(duì)腫瘤的治療效果影響較大。當(dāng)前對(duì)VM的診斷無金標(biāo)準(zhǔn)，只能通過雙染觀察其是否符合VM特征，因此在普通病理學(xué)檢查上通過PAS、CD31雙染進(jìn)行檢測(cè)其結(jié)構(gòu)，可制訂出針對(duì)腫瘤治療更詳盡的策略及更準(zhǔn)確的預(yù)后評(píng)估，并對(duì)選擇手術(shù)切除和(或)血管栓塞治療的適應(yīng)證提供客觀依據(jù)。

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