黑米發(fā)芽的工藝條件研究

付 欣，魯 明，王小鶴，于 淼

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品與加工研究所，沈陽 110161）

黑米為米中珍品，入口香甜醇厚，質(zhì)地好。黑米營養(yǎng)豐富，含有黑米色素、氨基酸、B族維生素、蛋白質(zhì)、礦物元素等功能性成分，而白米中的這些成分幾乎不含或含量較少。但黑米口感粗糙，降低了人們對它的喜愛程度。研究表明，發(fā)芽處理可使黑米組織軟化，提高加工性、適口感和商品價值。以黑米為原料，采用不同條件進行黑米發(fā)芽，根據(jù)發(fā)芽過程中的蛋白酶活力變化，確定黑米發(fā)芽的最佳工藝條件，以期為黑米發(fā)芽工藝提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米由遼寧省稻作研究所提供。

三氯乙酸（TCA）、磷酸二氫鈉、氯化鈣均為分析純，由國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。醋酸緩沖液（pH3.6）標準品，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；LXJ-ⅡB型離心機：上海安亭科學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠；電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；HH-601A型水浴鍋：江蘇金壇榮華儀器公司

1.3 單因素試驗

1.3.1 黑米發(fā)芽處理方法取篩選除雜后的黑米，用0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min，再用去離子水沖洗。待糙米表面干燥后，分別用0.5 mmol／L氯化鈣（Ca2+）和自來水浸泡24 h，每隔8 h撈出放置1 h。

在培養(yǎng)皿中放置3層紗布，再放入處理好的黑米，用3層紗布蓋在表面，置于培養(yǎng)箱內(nèi)（黑暗條件下）發(fā)芽。每天在表面噴灑1～2次水，確保黑米處于濕潤狀態(tài)。每個試驗重復(fù)3次。

1.3.2 浸泡溫度、時間對黑米吸水率的影響將黑米樣品分成4份，用紗布包好，放入裝有無菌水的燒杯中，分別置于20，25，30，35℃恒溫水浴鍋，每4 h取出晾干稱重，計算黑米的吸水率。

1.3.3 浸泡溫度、時間對黑米發(fā)芽率的影響取黑米樣品4份，分別放入 20，25，30，35 ℃的無菌水中浸泡，每隔6 h定量取出，在22℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽48 h，計算發(fā)芽率。

1.3.4 前處理Ca2+濃度對蛋白酶活力的影響取20 g黑米樣品7份，分別放入100 mL無菌水，以及滅菌后的0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol／L Cacl2溶液中， 于 28℃下浸泡24 h，放入培養(yǎng)箱（22℃）發(fā)芽，測定其蛋白酶活力。

1.3.5 溫度對蛋白酶活力的影響取 300 g黑米樣品，用28℃的1 000 mL無菌水浸泡24 h；取出，分成等重6份， 分別置于 14，18，22，26，30，34 ℃的培養(yǎng)箱發(fā)芽，考察發(fā)芽溫度對黑米蛋白酶活力的影響。

1.3.6 時間對黑米發(fā)芽過程中蛋白酶活力的影響取350 g黑米，在28℃下用1 000 mL無菌水浸泡24 h；取出，分成等重7份，放入22℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽，在1，2，3，4，5，6，7 d 分別取出一份發(fā)芽黑米，測定蛋白酶活力，考察發(fā)芽時間對黑米蛋白酶活力的影響。每個試驗重復(fù)3次。

1.4 響應(yīng)面法試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取3個影響最顯著的因素為自變量，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面試驗，設(shè)計因素水平見表1。采用Design-Expert8.0.5b對試驗數(shù)據(jù)進行優(yōu)化分析。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素水平Table 1 Factor levels of RSD

1.5 蛋白酶活力測定

1.5.1 酪氨酸標準曲線取 18支試管，分成 6組（每組3支，平行樣）并編號，分別加入標準酪氨酸、去離子水、濃度0.4 mol／L的碳酸鈉溶液和福林-酚試劑，混勻，置于40℃水浴保溫20 min，用分光光度計進行比色測定（波長660 nm）。以酪氨酸反應(yīng)液作為空白對照，繪制標準曲線。

1.5.2 蛋白酶活力測定方法參照Harvey等的測定方法并稍做修改。稱取2.00 g發(fā)芽黑米，冰浴條件下加8 mL醋酸緩沖液研磨勻漿，在4℃、10 000 r／min條件下離心30 min，上清液即為蛋白酶粗提液。

在40℃下取酪蛋白底物、蛋白酶粗提液各1 mL，保溫10 min，在90℃水浴條件下滅酶5 min，加入 0.4 mol／LTCA溶液 2 mL， 常溫下放置 15 min沉淀殘余蛋白質(zhì)，4 500 r／min離心15 min，取上清液，在波長275 nm處測定吸光值。

以酪氨酸為標準，將1.00 g發(fā)芽黑米蛋白酶粗提液催化酪蛋白每分鐘產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位（U）。以反應(yīng)前先加入TCA溶液的體系為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 溫度和前處理對黑米芽長的影響脫殼后的黑米是完整的植物種子，富含營養(yǎng)物質(zhì)和生命物質(zhì)，在適宜的溫度、水分條件下就會發(fā)芽。不同發(fā)芽溫度及前處理方法對黑米芽長的影響見表2。

表2 黑米發(fā)芽過程中的芽長變化Table 2 Bud length change during germination of black rice ／mm

由表2得出，黑米在溫度較高的環(huán)境中長芽更快，芽長更長。在22℃條件下，用Ca2+處理的黑米比用去離子水處理的黑米長芽趨勢好。

2.1.2 浸泡溫度和時間對黑米吸水率的影響適宜的浸泡溫度和時間，利于黑米充分吸水，浸泡溫度和時間對黑米吸水率的影響見圖1。

圖1 浸泡溫度和時間對吸水率的影響Figure 1 Effect of immersion temperature and time on the water absorption rate of black rice

從圖1可以看出：浸泡溫度和浸泡時間對黑米的吸水率影響較大；隨著浸泡溫度的提高，黑米吸水飽和時間逐漸縮短；在35℃下浸泡25 h后，黑米的吸水率基本達到飽和。

2.1.3 浸泡溫度和時間對黑米發(fā)芽率的影響發(fā)芽率與浸泡溫度、浸泡時間的關(guān)系見圖2。

圖2 浸泡溫度和浸泡時間對發(fā)芽率的影響Figure 2 Effect of immersion temperature and time on the germination rate of black rice

由圖2可知：當浸泡時間為6～18 h時，隨著浸泡溫度的提高，黑米的發(fā)芽率有小幅度增加；在35℃下浸泡 18 h、25～30℃浸泡 24 h、20℃浸泡 30 h后，發(fā)芽率達到最高值；此后，隨著浸泡時間的延長，發(fā)芽率反而降低。綜合考慮，選擇浸泡溫度25～30℃，浸泡時間20～24 h為宜。

2.1.4 Ca2+濃度對蛋白酶活力的影響在 22℃條件下，將不同濃度Ca2+浸泡的黑米放入培養(yǎng)箱 （黑暗條件）發(fā)芽。Ca2+濃度對蛋白酶活力的影響見圖3。

圖3 不同Ca2+濃度對蛋白酶活力的影響Figure 3 Effect of different Ca2+concentration on protease activity

如圖 3 所示，當 Ca2+濃度低于 0.6 mmol／L 時，黑米中的蛋白酶活力隨Ca2+濃度增高逐漸增加；當Ca2+濃度大于0.6 mmol／L時，蛋白酶活力逐漸降低。所以選擇0.6mmol／L的Ca2+進行黑米發(fā)芽前處理。

2.1.5 溫度對蛋白酶活力的影響溫度對蛋白酶活力的影響見圖4。

圖4 不同溫度對蛋白酶活力的影響Figure 4 Effect of different temperatures on protease activity

由圖4可知：發(fā)芽期間，黑米蛋白酶活力隨著溫度升高而顯著增加，在22℃時達最大值，之后開始下降。因此選擇22℃作為黑米發(fā)芽溫度。

2.1.6 時間對蛋白酶活力的影響發(fā)芽時間對黑米發(fā)芽過程中蛋白酶活力的影響如圖5所示。

圖5 不同發(fā)芽時間對黑米發(fā)芽過程中蛋白酶活力的影響Figure 5 Effect of different germination time on protease activity of black rice during germination

由圖5可知：蛋白酶活力隨著發(fā)芽時間的增加總體呈上升趨勢，在第5 d達到最大值，之后逐漸降低。最佳發(fā)芽時間為5 d。

2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。利用Design-Expert8.0.5b對試驗數(shù)據(jù)進行優(yōu)化分析，得出3因素與蛋白酶活力（Y）之間的回歸方程式：

Y ＝350.58+11.19A+25.59B+21.63C-2.25AB-2.87AC-14.43BC-41.64A2-74.64B2-63.81C2響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of RSD test

表4 響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of RSM test

P值的大小體現(xiàn)顯著性檢驗結(jié)果，當模型P值小于0.05時，表明在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的。通過表4結(jié)果可知，該模型 P＜0.05，說明具有統(tǒng)計學(xué)意義，且二次項 A2，B2，C2極顯著（P＜0.0001）。

失擬項表示所用模型與試驗擬合的程度，表4中的失擬項 P 值為 0.8956＞0.05，表明失擬不顯著。 模型的校正決定系數(shù) R2adj＝0.9834，說明模型能解釋約98.34%響應(yīng)值的變化；決定系數(shù) R2＝0.9927，說明模型擬合度較好，試驗誤差小，可以利用該回歸方程確定黑米最佳發(fā)芽條件。

Ca2+濃度、發(fā)芽溫度、發(fā)芽時間三個因素對黑米發(fā)芽過程中蛋白酶活力的影響見響應(yīng)面曲面圖6——8。

由圖6——8可以看出：響應(yīng)面存在極值；通過Design-Expert8.0.5b 軟件分析可得，當 Ca2+濃度 0.51 mmol／L、發(fā)芽溫度 22.62 ℃、發(fā)芽時間為 5.15 d 時，蛋白酶活力為 354.867 U。

考慮實際操作，對結(jié)果進行修正得到的黑米發(fā)芽最佳工藝條件為：Ca2+濃度 0.5 mmol／L、發(fā)芽溫度 22℃、發(fā)芽時間5 d。驗證試驗表明，此工藝條件下的蛋白酶活力為 347.5 U。

圖6 Ca2+濃度-發(fā)芽溫度對黑米發(fā)芽過程中蛋白酶活力的影響Figure 6 Effect of Ca2+concentration and temperature on protease activity of black rice during germination

3 結(jié)論

通過單因素試驗篩選出Ca2+濃度、發(fā)芽溫度、發(fā)芽時間作為響應(yīng)面試驗因素，應(yīng)用響應(yīng)面分析3個因素對黑米發(fā)芽過程中蛋白酶活力的影響，確定影響順序為發(fā)芽溫度＞發(fā)芽時間＞Ca2+濃度。黑米發(fā)芽的最佳工藝條件為：Ca2+濃度 0.5 mmol／L、發(fā)芽溫度 22 ℃、發(fā)芽時間5 d。在此工藝條件下，蛋白酶活力為347.5 U。

圖7 Ca2+濃度-發(fā)芽時間對黑米發(fā)芽過程中蛋白酶活力的影響Figure 7 Effect of Ca2+concentration and germination time on protease activity of black rice during germination

圖8 發(fā)芽溫度-發(fā)芽時間對黑米發(fā)芽過程中蛋白酶活力的影響Figure 8 Germination temperature and time on protease activity of black rice during germination