靶向沉默異黏蛋白基因?qū)Π螂装┘毎蛲龅挠绊懠捌渥饔脵C制

尹合奎，袁敬東

1陽新縣婦幼保健院，湖北黃石 435200；2武漢市第一醫(yī)院，湖北武漢 430000

膀胱癌是發(fā)生在膀胱黏膜上的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率在我國泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤中占首位。目前認為遺傳、吸煙和接觸芳香類化學(xué)物質(zhì)等是導(dǎo)致膀胱癌的主要原因[1]。世界上每年死于膀胱癌的人數(shù)約為15萬，我國2015年膀胱癌的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)分別為8.05萬和3.29萬[2-3]，多數(shù)患者就診時已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后效果很差，尋找新的有效治療手段已成為一種迫切需要。研究表明，在膀胱癌中存在異常表達的特定基因，且與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能作為膀胱癌治療的新靶點[4]。異黏蛋白(metadherin，MTDH)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種癌基因，在乳腺癌、胃癌和肝癌等多種腫瘤細胞中過表達，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[5-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，MTDH在膀胱癌中過表達[11]。目前關(guān)于MTDH基因在膀胱癌中的作用機制并不清晰，RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是一種通過小的雙鏈RNA(small interference RNA，siRNA)促使體內(nèi)特定基因mRNA降解，實現(xiàn)基因沉默或關(guān)閉的常用方法。本研究通過siRNA干擾技術(shù)沉默MTDH基因，探討其對膀胱癌BIU-87細胞凋亡的影響及其作用機制，為深入研究MTDH在膀胱癌細胞生物學(xué)功能及其分子機制提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 實驗材料 人膀胱上皮永生化細胞株SVHUC-1和人膀胱癌細胞株BIU-87購于中科院上海研究所。10%胎牛血清購于杭州四季青公司，胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司。兔抗MTDH單克隆抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫 酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(IgG-HRP)抗體均購于美國Sigma公司。兔抗B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)單克隆抗體和兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)單克隆抗體購于美國Sigma公司。膜聯(lián)蛋白-V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白含量檢測試劑盒分別購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司和南京凱基生物科技有限公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和蛋白提取試劑盒均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品。MTDH1-siRNA、MTDH2-siRNA、MTDH3-siRNA、Control-siRNA和PCR擴增引物序列由上海吉瑪公司合成。MTDH1-siRNA正義鏈序列為5'-GCCAUCUGUAAUCUUAUCATT-3'，反義鏈序列為5'-UGAUAAGAUUACAGAUGGCTT-3'；MTDH2-siRNA正義鏈序列為5'-GCUGUUCGAACACCUCAA ATT-3'，反義鏈序列5'-UUUGAGGUGUUCGAACA GCTT-3'；MTDH3-siRNA正義鏈序列為5'-GCCG UAAUCAACCCUAUAUTT-3'，反義鏈序列為5'-AU AUAGGGUUGAUUACGGCTT-3'；Control-siRNA 正義鏈序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反義鏈序列為5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。

2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 取保存于液氮中的膀胱癌BIU-87細胞和膀胱上皮永生化SV-HUC-1細胞，于37℃水浴中復(fù)蘇后，種植于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在溫度為37℃、體積分數(shù)為5% CO2和濕度為95%的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長密度為80%以上時，加入0.25%胰酶消化，以1∶2傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期BIU-87細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞濃度以10 000/ml接種于6孔細胞板中，將其隨機分組：以轉(zhuǎn)染MTDH1-siRNA序列的細胞為siRNA MTDH1組，轉(zhuǎn)染MTDH2-siRNA序列的細胞為siRNA MTDH2組，轉(zhuǎn)染MTDH3-siRNA序列的細胞為siRNA MTDH3組，轉(zhuǎn)染Control-siRNA序列的細胞為siRNA NC組，以不做任何處理的細胞為NC組。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書的操作步驟轉(zhuǎn)染上述各組細胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基，在常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

3 RT-PCR檢測MTDH mRNA的表達 收集對數(shù)生長期BIU-87細胞和SV-HUC-1細胞，培養(yǎng)48 h后，根據(jù)Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，以BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測RNA濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增。擴增條件：95℃預(yù)變性5 min(1個循環(huán))，95℃變性30 s(40個循環(huán))，60℃退火30 s(40個循環(huán))，72℃延伸45 s(40個循環(huán))，72℃總延伸5 min(1個循環(huán))?？偡磻?yīng)體系為20 μl。以GAPDH為內(nèi)參，計算BIU-87細胞和SV-HUC-1細胞中MTDH mRNA的相對表達量。其中MTDH上游引物序列為5'-GGGGAAGGAGTTGGAGTGAC-3'，下游引物序列為5'-GTAGACTGAGAAACTGGCT CAGCAG-3'；GAPDH上游引物為5'-CGGAGTCAA CGGATTTGGTCGTAT-3'，下游引物5'-AGCCTTCT CCATGGTGGTGAAGAC-3'。采用同樣方法檢測培養(yǎng) 48 h的 siRNA MTDH1組、siRNA MTDH2組、siRNA MTDH3組、siRNA NC組和NC組細胞中MTDH mRNA的相對表達量。

4 Western blot檢測MTDH蛋白的表達 收集培養(yǎng)48 h后的BIU-87細胞和SV-HUC-1細胞，按照細胞蛋白提取試劑盒說明書提取細胞蛋白，BCA法檢測提取的蛋白樣品的濃度及純度。以每孔50 μg蛋白樣品，上樣到十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，與稀釋1∶800的特異性一抗體(兔抗MTDH單克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體)在4℃孵育24 h后，再與稀釋1∶1 000倍的二抗(IgG-HRP)37℃孵育2 h。以化學(xué)發(fā)光法顯色，Bio-Rad凝膠電泳成像儀拍照。以GAPDH為內(nèi)參，采用Quantity One軟件進行條帶灰度分析，以MTDH蛋白條帶的灰度/GAPDH蛋白條帶灰度的比值表示BIU-87細胞和SV-HUC-1細胞中MTDH蛋白表達量。同樣方法檢測siRNA MTDH1組、siRNA MTDH2組、siRNA MTDH3組、siRNA NC組和NC組細胞中MTDH蛋白的相對表達量。

5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h的siRNA MTDH 組 (即 siRNA MTDH3組 )、siRNA NC組和NC組細胞，調(diào)整細胞濃度為5 000/ml，經(jīng)預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，根據(jù)Annexin-V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書步驟進行操作，以流式細胞儀檢測各組細胞的細胞凋亡率，實驗重復(fù)3次。

6 Western blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達 取NC組、siRNA NC組、siRNA MTDH組(即siRNA MTDH3組)細胞培養(yǎng)48 h后，以細胞蛋白提取試劑盒提取各組細胞蛋白，再按照上文中的實驗步驟檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達情況。

7 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，以-x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTDH在膀胱癌BIU-87細胞中高表達 圖1和表1結(jié)果顯示，與膀胱上皮永生化SV-HUC-1細胞相比，膀胱癌BIU-87細胞中MTDH mRNA和蛋白表達量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2 MTDH-siRNA下調(diào)膀胱癌BIU-87細胞中MTDH的表達 圖2和表2結(jié)果顯示，與NC組相比，siRNA MTDH2和siRNA MTDH3組細胞中MTDH mRNA和蛋白表達量明顯降低(P＜0.05)，且siRNA MTDH3組較siRNA MTDH2組降低幅度要大；siRNA NC組與siRNA MTDH1中MTDH mRNA和蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。由于siRNA MTDH3組中MTDH的表達下降最為顯著，故后續(xù)選用siRNA MTDH3進行實驗。

3 MTDH基因沉默可誘導(dǎo)膀胱癌BIU-87細胞凋亡 轉(zhuǎn)染MTDH-siRNA 48 h后，流式細胞儀檢測結(jié)果(圖3)顯示，NC組、siRNA NC組和siRNA MTDH組中BIU-87細胞凋亡率分別為9.95%±1.26%、10.21%±1.58%和38.86%±2.52%。NC組、siRNA NC組和siRNA MTDH組中BIU-87細胞凋亡率經(jīng)單因素方差分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，與NC組細胞凋亡率相比，siRNA MTDH組顯著升高(P=0.000)， siRNA-NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞ 0.05)。

表1 SV-HUC-1細胞和BIU-87細胞中MTDH mRNA和蛋白的相對表達Tab. 1 Relative expression of MTDH, mRNA and protein in SV-HUC-1 cells and BIU-87 cells (n=5)

圖1 Western blot檢測SV-HUC-1細胞和BIU-87細胞中MTDH蛋白表達結(jié)果Fig. 1 Expression of MTDH protein in SV-HUC-1 cells and BIU-87 cells detected by Western blot

圖2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染MTDH-siRNA后膀胱癌BIU-87細胞MTDH蛋白表達結(jié)果Fig. 2 Detection of MTDH protein expression in bladder cancer BIU-87 cells transfected with MTDH-siRNA by Western blot

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA-MTDH對膀胱癌BIU-87細胞凋亡的影響 左為NC組，中為siRNA NC組，右為siRNA MTDH組Fig. 3 Effect of siRNA-MTDH transfection on apoptosis of bladder cancer cell line BIU-87 Left: NC group; Middle: siRNA NC group; Right: siRNA MTDH group

表2 轉(zhuǎn)染MTDH-siRNA對膀胱癌BIU-87細胞MTDH mRNA和蛋白表達的影響Tab. 2 Effect of transfection of MTDH-siRNA on expression of MTDH mRNA and protein in bladder cancer BIU-87 cells (-x±s, n=5)

4 MTDH基因沉默可上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2蛋白表達 表3和圖4結(jié)果顯示，與NC組相比，轉(zhuǎn)染MTDH-siRNA后BIU-87細胞中p-Akt和Bcl-2蛋白表達量顯著降低，p53和Bax蛋白表達量則顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。siRNA NC組與NC組相比，p53、p-Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖4 轉(zhuǎn)染MTDH-siRNA對p53、p-AKT、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響Fig. 4 Effect of transfection of MTDH-siRNA on the expression of p53, p-AKT Bcl-2 and Bax proteins

表3 轉(zhuǎn)染MTDH-siRNA后BIU-87細胞中p53、p-AKT、Bcl-2和Bax蛋白的相對表達量Tab. 3 Relative expression of p53, p-AKT Bcl-2 and Bax proteins in BIU-87 cells after transfection with MTDH-siRNA (n=5)

討 論

MTDH基因最早被發(fā)現(xiàn)于人胚胎初級星形膠質(zhì)細胞，該基因位于人類8q22染色體上，由12個外顯子和11個內(nèi)含子構(gòu)成，分布在胞膜、胞核、胞質(zhì)及一些特定的核膜、核質(zhì)和核仁中[12]。MTDH基因在多種腫瘤細胞中表達異常，可通過多種信號通路參與細胞生物學(xué)行為，被認為是一個提高化療療效、減少轉(zhuǎn)移風(fēng)險和調(diào)控人惡性腫瘤的潛在治療靶點[13]。Meng等[14]研究發(fā)現(xiàn)敲除MTDH基因能夠促進死亡受體TRAIL配體和HDAC抑制劑LBH589聯(lián)合誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜癌細胞死亡。Wang等[15]通過成功構(gòu)建和轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒使乳腺癌MDA-MB-231細胞中MTDH基因的表達下降，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除MTDH基因可顯著抑制MDA-MB-231細胞增殖、運動和遷移。膀胱癌是一種威脅人們生命和健康的惡性腫瘤，其常見的組織病理類型有尿路上皮癌、鱗狀細胞癌和腺細胞癌，其中尿路上皮癌占90%左右。膀胱癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，其發(fā)病機制尚不完全明確，尋找新的有效的分子靶點對膀胱癌的篩查、預(yù)后和治療具有重要意義。Zhou等[16]研究發(fā)現(xiàn)MTDH基因在膀胱癌中呈現(xiàn)高表達，推測其與膀胱癌患者病情進展及整體存活率低密切相關(guān)。為了探討MTDH基因與膀胱癌細胞凋亡的相關(guān)性，本研究通過siRNA干擾技術(shù)沉默膀胱癌BIU-87細胞中MTDH基因的表達，觀察MTDH基因沉默后對BIU-87細胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BIU-87細胞凋亡率明顯升，提示MTDH基因沉默可誘導(dǎo)膀胱癌細胞凋亡。

Bcl-2蛋白家族是目前公認的與細胞凋亡密切相關(guān)的蛋白家族，Bc1-2蛋白為抑凋亡蛋白，Bax蛋白為促凋亡蛋白，在細胞凋亡的基因調(diào)控過程中起著重要作用；野生型p53是一種抑癌基因，而其突變后則成為癌基因，失去了對細胞生長及凋亡的調(diào)控作用；Akt是經(jīng)典PI3K/Akt信號通路中重要的激酶，活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，調(diào)節(jié)細胞的增殖和凋亡等生理過程[17-19]。Bc1-2、Bax、p53在膀胱癌中異常表達，與腫瘤細胞的病理分級密切相關(guān)，并且升高p53表達可誘導(dǎo)細胞膀胱癌細胞凋亡；并且經(jīng)過Akt抑制劑處理后的膀胱癌細胞增殖能力明顯受到抑制，凋亡能力明顯增強[20-22]。Bc1-2、Bax、p53和Akt通過激活一系列下游基因或蛋白在膀胱癌腫瘤細胞的凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。杜成等[23]在研究轉(zhuǎn)移黏附基因下調(diào)對乳腺癌SKBR-3細胞增殖和凋亡的影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MTDH基因表達可誘導(dǎo)乳腺癌SK-BR-3細胞凋亡，其作用機制可能與Bcl-2的表達下調(diào)有關(guān)。Zou等[24]研究發(fā)現(xiàn)，MTDH shRNA可能通過降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和增加促凋亡蛋白Bax表達誘導(dǎo)非小細胞肺癌A549細胞凋亡。Li等[25]研究發(fā)現(xiàn)，敲除MTDH后，抑制肝癌細胞生長，并誘導(dǎo)細胞凋亡，其作用機制可能與促進PTEN和p53的表達、抑制Akt磷酸化有關(guān)。為了探討MTDH基因在膀胱癌細胞凋亡中的作用機制，本研究通過Western blot檢測沉默MTDH基因后BIU-87細胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl-2蛋白的表達明顯下降，Bax蛋白的表達明顯上升。結(jié)果提示，MTDH基因沉默誘導(dǎo)BIU-87細胞凋亡，其作用機制可能與上調(diào)Bax蛋白的表達和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達有關(guān)。

綜上所述，MTDH基因在膀胱癌細胞凋亡過程中具有重要作用，本研究通過siRNA干擾技術(shù)沉默MTDH基因的表達后，可通過上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2蛋白的表達誘導(dǎo)BIU-87細胞凋亡。因此我們推測，MTDH基因可能是治療膀胱癌的一個潛在靶點，為MTDH基因在膀胱癌的治療提供了新的方向。

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