五味苦參腸溶膠囊對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶1、白細(xì)胞介素-1β蛋白的影響

羅 丹，高 路，仝戰(zhàn)旗，張 晨

1解放軍總醫(yī)院 南樓中醫(yī)針灸科，北京 100853；2天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300913

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全明確的慢性反復(fù)發(fā)作性、非特異性、炎癥性腸病，以腹瀉、黏液膿血便、里急后重等為主要癥狀，其與克羅恩病不同，結(jié)腸鏡下病變主要見于直腸和乙狀結(jié)腸，甚至可達(dá)全結(jié)腸，病變局限于黏膜和黏膜下層?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為本病主要由免疫異常、感染、環(huán)境、遺傳、心理等因素導(dǎo)致[1]，常用治療藥物有水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等方法，但仍存在反復(fù)發(fā)作、不良反應(yīng)較多、耐藥等問題[2]。本實(shí)驗(yàn)所用五味苦參腸溶膠囊為仝戰(zhàn)旗老師及其團(tuán)隊(duì)針對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎研制而成的一種國(guó)家新藥，由苦參、白芨、青黛、地愉、生甘草5味藥組成。通過多中心、隨機(jī)、雙盲、對(duì)照研究試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此藥總有效率高達(dá)92%，療效并不劣于艾迪莎[3]。故本文進(jìn)一步探討五味苦參腸溶膠囊治療UC的療效及作用機(jī)制，為其藥理研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)別BALB/C雄性小鼠50只，體質(zhì)量20 ～ 22 g，由軍事科學(xué)院醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-(軍 )2012-0004。

2 藥物與主要儀器 五味苦參結(jié)腸溶膠囊(藥物組成：苦參、地榆、青黛、白及、生甘草，北京中惠藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20160601)；Mouse IL-1βELISA試劑盒(Andygene，北京欣怡公司，批號(hào)：HTLR20532)、Mouse Caspase-1 ELISA試劑盒(Andygene，北京欣怡公司，批號(hào)：HTLV21002)；3%戊巴比妥鈉(德國(guó)，k2208)；葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt，DSS)：(分子量 36 000 ～ 50 000，批號(hào)：9011-18-1)；匹拉米洞半定量檢測(cè)盒(BA-20200)。TLL-C臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司)，長(zhǎng)風(fēng)水浴箱(XMTD-6000)，多功能酶標(biāo)儀(Thermo，C400044)，顯微鏡。

3 動(dòng)物分組與UC模型制備 將50只小鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組(10只)、模型組(10只)、五味苦參低劑量組(10只)、五味苦參中劑量組(10只)、五味苦參高劑量組(10只)。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，除空白組外，均自由飲用3% DSS，每日觀察小鼠的體質(zhì)量、精神狀態(tài)以及糞便性狀、隱血情況等。7 d后隨機(jī)取3只模型組小鼠處死，確認(rèn)是否造模成功，若造模成功則開始干預(yù)。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：小鼠一般情況較差，糞便隱血試驗(yàn)陽(yáng)性，肉眼觀察結(jié)腸組織有水腫、潰瘍，結(jié)腸組織病理顯示結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)紊亂，腺體減少或消失，杯狀細(xì)胞減少，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

4 干預(yù)方法 空白組、模型組分別以等量0.9%氯化鈉注射液灌腸。將五味苦參腸溶膠囊內(nèi)容物溶于0.9%氯化鈉注射液，按臨床成人日劑量的10、20、40倍劑量換算，五味苦參組低、中、高劑量組分別給予 1.92 g/(kg·d)、3.84 g/(kg·d)、7.68 g/(kg·d)，混懸于0.9%氯化鈉注射液，每日灌腸1次。灌腸方法：采用頭皮針與一次性注射針組合的灌腸器灌腸[4]，從肛門插入，深度約2 cm左右推入灌腸液并倒立約1 min。干預(yù)7 d后禁食24 h，取全結(jié)腸(回盲部至肛門口上1 cm)病理觀察。

5 結(jié)腸長(zhǎng)度和脾系數(shù)、結(jié)腸系數(shù)檢測(cè) 稱取各組小鼠處死前體質(zhì)量并做好記錄，麻醉解剖后取出其結(jié)腸、脾，于預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液中洗凈，濾紙吸干后稱取質(zhì)量、結(jié)腸用直尺量出長(zhǎng)度并做好記錄。脾系數(shù)增大，提示脾充血、水腫、肥大等炎性病變；結(jié)腸系數(shù)減小，提示結(jié)腸萎縮[5]。

脾系數(shù)=脾質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)

結(jié)腸系數(shù)=結(jié)腸質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)

6 小鼠結(jié)腸病理觀察 如上述取病變最明顯處組織置于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染料染色，脫水封固后，用于結(jié)腸組織形態(tài)觀察、光鏡觀察。

7 結(jié)腸組織Caspase-1、IL-1β蛋白含量的檢測(cè)

取50 mg結(jié)腸組織，樣本質(zhì)量與勻漿液PBS (pH 7.2)按1∶9的比例采用玻璃勻漿器充分勻漿后，4℃，3 000 r/min離心20 min，仔細(xì)收集上清，分裝待測(cè)。檢測(cè)方法按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，終止反應(yīng)后，將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀槽內(nèi)，選擇450 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，確定標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照區(qū)域，檢測(cè)相應(yīng)的吸光度(OD)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算相應(yīng)的濃度。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以-x±s表示(數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布)，多組間樣本均值比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪圖采用GraphPad Prism 5繪圖軟件。

結(jié) 果

1 各組結(jié)腸長(zhǎng)度比較 圖1、表1可見，與空白對(duì)照組比較，造模后各組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度均有不同程度縮短。與模型組相比，五味苦參低、中、高劑量組結(jié)腸長(zhǎng)度均有不同程度的增長(zhǎng)。結(jié)果提示，模型組結(jié)腸長(zhǎng)度與中、高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均＜0.01)，而中劑量組與高劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2 各組脾系數(shù)和結(jié)腸系數(shù)比較 由表1可見，與空白對(duì)照組相比，造模后各組脾系數(shù)均有不同程度升高，結(jié)腸系數(shù)均有不同程度降低。與模型組相比，五味苦參低、中、高劑量組脾系數(shù)均有不同程度的降低，其中中劑量組降低顯著(P＜0.01)。與模型組比較，五味苦參各組結(jié)腸系數(shù)均有不同程度的升高，其中五味苦參中、高劑量組均顯著升高(P均＜0.05)。

3 結(jié)腸組織病理形態(tài)分析 制作病理切片，HE染色后光鏡下觀察，模型組標(biāo)本可見結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)紊亂，杯狀細(xì)胞減少，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中以中性粒細(xì)胞為主，伴有淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞等，大量腺體被破壞，腺腔消失，局部有水腫，病變主要累及黏膜及黏膜下層，少數(shù)可達(dá)漿膜層，可見淋巴細(xì)胞聚集形成的淋巴濾泡。大多數(shù)小鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸損傷程度比近端結(jié)腸嚴(yán)重。由圖2可見，經(jīng)五味苦參灌腸干預(yù)后，與模型組對(duì)比，治療組小鼠的結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)排列較整齊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，潰瘍淺而少。

4 各組結(jié)腸組織Caspase-1、IL-1β蛋白水平比較 由表1可見，與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中Caspase-1、IL-1β蛋白水平升高；與模型組比較，五味苦參各組均有不同程度降低，由此可推測(cè)，UC可導(dǎo)致小鼠結(jié)腸黏膜中Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)的升高，而五味苦參腸溶膠囊能夠有效降低這些炎性因子，其中五味苦參中劑量組療效最佳。

圖1 各組UC模型小鼠五味苦參作用后結(jié)腸長(zhǎng)度比較Fig. 1 Comparison of colonic length of mice with UC in each group

討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為潰瘍性結(jié)腸炎歸屬于“下痢”、“腸僻”等范疇?！夺t(yī)貫》云：“利為濕熱甚于腸胃，怫郁而成，其冰皆熱證也，俗以白痢為寒誤也。”《諸病源候論》曰：“凡痢皆由榮衛(wèi)不足，腸胃虛弱，冷熱之氣，乘虛入客于腸間，腸虛則泄，故為痢也?！敝嗅t(yī)認(rèn)為本病多虛實(shí)夾雜、本虛標(biāo)實(shí)，脾胃虛弱為本，腸道濕熱蘊(yùn)結(jié)為標(biāo)，濕熱與水谷相互搏結(jié)，耗氣傷津，損傷腸絡(luò)，下痢為血。因本病往往纏綿難愈，反復(fù)發(fā)作，日久氣血虧虛，嚴(yán)重影響患者日常生活質(zhì)量，甚至可發(fā)展為結(jié)腸癌[6]。

圖2 各組小鼠結(jié)腸病理學(xué)觀察(HE×400) A：空白對(duì)照組； B：模型對(duì)照組； C：五味苦參低劑量組； D：五味苦參中劑量組； E：五味苦參高劑量組)Fig. 2 Pathological changes of colon tissue in mice in each group (HE×400) A：Nctrl group； B：model group； C：low dose of CSCC group； D：moderate dose of CSCC group； E：high dose of CSCC group

表1 各組結(jié)腸組織檢測(cè)指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of detecting indicators in colonic tissue in each group (-x±s)

本實(shí)驗(yàn)所用五味苦參腸溶膠囊由苦參、白芨、青黛、地愉、生甘草5味藥組成，其中以苦參為君藥，入大腸、心、膀胱經(jīng)，可清熱燥濕、止血止痢；地愉入大腸、肝經(jīng)，可涼血止血、解毒斂瘡，青黛與地愉同用，可增強(qiáng)其清熱解毒、涼血止血之效，乃臣藥；白芨有收斂止血、消腫生機(jī)之效，佐助君臣藥；生甘草可調(diào)和諸藥，清熱解毒，并緩急鎮(zhèn)痛?，F(xiàn)代藥理研究亦發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有抗炎抑菌、抗腫瘤、免疫抑制等作用[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組的結(jié)腸長(zhǎng)度縮短，結(jié)腸系數(shù)降低，脾系數(shù)升高，Caspase-1和IL-1β蛋白表達(dá)增加，提示炎癥反應(yīng)的存在。而與模型組相比，五味苦參各組均有不同程度的改善。其中高劑量組療效不是最佳，可能是因?yàn)闈舛冗^高，而該組方中含白芨、青黛等生藥，其性收斂，吸水性強(qiáng)，故混懸液太黏稠可能致結(jié)腸吸收效果不佳。

現(xiàn)代研究普遍認(rèn)為腸道黏膜免疫異常是UC發(fā)病的關(guān)鍵因素[8]，其中較熱門的有固有淋巴細(xì)胞NLRP3炎性小體、T淋巴細(xì)胞等[9]。有學(xué)者認(rèn)為成熟的IL-1β可誘導(dǎo)表達(dá)Th17細(xì)胞[10]，Th17細(xì)胞是一種CD4+輔助T淋巴細(xì)胞，分泌IL-17、IL-6等促炎性因子，從而導(dǎo)致UC[11]。而Caspase-1是一種半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白水解酶，參與細(xì)胞凋亡、調(diào)控炎癥反應(yīng)。正常情況下，細(xì)胞質(zhì)中存在無活性的Caspase-1，即pro-Caspase-1[12]。pro-Caspase-1可在激活的NLRP3(NACHT、LRR and PYD domains-containing protein 3)炎性小體作用下轉(zhuǎn)為有活性的Caspase-1，而被激活的Caspase-1可將IL-1β、IL-18促炎性因子的前體等剪切加工成熟，從而介導(dǎo)UC[13-16]。也有研究提出，NLRP3炎性小體只在早期炎癥反應(yīng)中起作用，并不能阻止其病情的發(fā)展[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)Caspase11與NLRP3炎性小體結(jié)合同樣可分泌IL-1β、IL-18[18]，但最新研究提示Caspase11只在急性炎癥反應(yīng)中起作用[19-20]。而有研究發(fā)現(xiàn)通過巨噬細(xì)胞THP-1炎性小體細(xì)胞模型篩選出的一種活性較好的小分子化合物Fclla-2，F(xiàn)clla-2能夠抑制NLRP3炎性小體釋放IL-1β，其機(jī)制是通過抑制Caspase-1活化從而抑制NLRP3炎性小體介導(dǎo)IL-1β的釋放[21]。由此可推測(cè)，被NLRP3炎性小體激活的Caspase-1可通過剪切加工成熟IL-1β，誘導(dǎo)表達(dá)Th17細(xì)胞，分泌IL-17、IL-6等促炎性因子，介導(dǎo)UC的發(fā)生。綜上所述，五味苦參腸溶膠囊可能是通過下調(diào)Caspase-1表達(dá)，減少成熟IL-1β蛋白的含量，從而阻斷Th17細(xì)胞誘導(dǎo)下游炎性細(xì)胞因子的釋放，從而有效緩解UC癥狀，減輕炎癥反應(yīng)。故本實(shí)驗(yàn)組擬進(jìn)一步研究五味苦參腸溶膠囊是否也能夠下調(diào)NLRP3炎性小體，減少Th17細(xì)胞的表達(dá)。

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