玫及乳膏促進大鼠Ⅲ期壓瘡潰瘍愈合的實驗研究*

李善華 熊萬寧 朱愛萍 李 莉

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000）

壓瘡（PU）又名壓力性潰瘍，具有難愈合性的臨床特點，一旦發(fā)生則經(jīng)久不愈，Ⅲ期以上PU常伴發(fā)感染，PU潰瘍面皮膚組織破損及壞死，患者最終因全身器官功能衰竭而死亡，已成為截癱患者的直接死亡原因之一［1］。目前對PU的研究比較深入，其中皮下組織缺血-再灌注損傷是其主要病理基礎(chǔ)，認(rèn)為皮膚損傷程度與缺血-再灌注損傷時間呈正相關(guān)［2］。分子生物學(xué)研究表明，在壓瘡的愈合過程中金屬蛋白酶-2（MMP-2）、纖維結(jié)合蛋白（FN）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等均發(fā)揮著作用重要作用。MMP在PU的形成過程中是導(dǎo)致膠原纖維降解的始動因素［3］。VEGF是最強的促血管形成的始動因子，在受損組織中具有很強的誘導(dǎo)和促進血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生、促進微小血管新生的能力［4］。而TGF-β1具有促進間質(zhì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成功能［5］。FN是廣泛存在于細(xì)胞表面、基膜、相鄰細(xì)胞間及結(jié)締組織中，其對維持表皮細(xì)胞完整性及防御功能具有重要作用，可促進創(chuàng)傷修復(fù)［6］。筆者采用自制玫及乳膏外敷治療PU的臨床療效顯著，但關(guān)于其治療機制還無相關(guān)研究。為探索其治療機制，本實驗建立大鼠缺血-再灌注Ⅲ期PU模型并在PU部位涂敷玫及乳膏，研究其對PU形成過程中MMP-2、FN、TGF-β1及VEGF等相關(guān)因素的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠120只，雄性，體質(zhì)量160～170g，大鼠由湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗大鼠中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（鄂）2017-0008，設(shè)施許可證號：SYXK（鄂）2017-0031。

1.2 藥品與試劑 玫及乳膏（十堰市太和醫(yī)院藥劑科自制）； 大鼠 MMP-2、FN、TGF-β1 及 VEG ELISA 試劑盒（上海雙贏生物科技有限公司）。

1.3 造模及分組 大鼠造模前室溫分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，造模后自由飲水及進食，自然光照，動物房溫度22～24℃，恒濕60%～70%。實驗前采用隨機數(shù)字表編號后，隨機取40只設(shè)為空白對照組，另80只大鼠造模。術(shù)前禁食12 h，不禁水，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg），約5 min后大鼠麻醉好。備皮：用電動剔須刀剔去左側(cè)臀部鼠毛，消毒。手術(shù)造模：在臀部切開長約2 cm皮膚，注意應(yīng)深至肌肉，用玻璃分針鈍性分離臀大肌，然后將直徑16 mm、厚2 mm的磁片植入到臀大肌內(nèi)，縫合肌肉組織-筋膜-皮膚，消毒。待24 h后，于植入磁片的皮膚處放置磁鐵，利用磁鐵引力加壓造成局部缺血，加壓2 h后取下外源磁鐵恢復(fù)加壓皮膚和肌肉組織血流，間隔30 min重復(fù)以上步驟，每日3次。術(shù)后所有大鼠均單籠正常喂養(yǎng)以防咬傷。成模標(biāo)準(zhǔn)：4 d后，當(dāng)受壓皮膚變黑、變硬，用針刺不出血時，即可判斷為Ⅲ期PU［7］。本PU模型構(gòu)建簡單，成模率為100%。成模后將造模的80只大鼠隨機分為模型組及實驗組?？瞻讓φ战M40只備皮后不再做任何處理作為對照。模型組及實驗組均每日清創(chuàng)處理創(chuàng)面，清創(chuàng)時用0.9%氯化鈉注射液浸泡沖洗PU創(chuàng)面，剪或切除局部壞死結(jié)痂組織，清理到新鮮組織后再用3%雙氧水徹底沖洗消毒，然后用0.9%氯化鈉注射液徹底沖洗創(chuàng)面和周圍皮膚以除去消毒液，用無菌棉拭干。實驗組上藥：將玫及乳膏均勻涂在PU表面，厚度以1 mm為宜，然后用紗布覆蓋。模型組清創(chuàng)處理同實驗組，清創(chuàng)消毒后用0.9%氯化鈉注射液紗布覆蓋創(chuàng)面。空白對照組用0.9%氯化鈉注射液沖洗浸泡與模型組及實驗組相同部位，也用0.9%氯化鈉注射液紗布覆蓋。以上處理每日1次，治療21 d。如創(chuàng)面愈合可停止治療。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）統(tǒng)計模型組及實驗組PU顯效時間、愈合速度并計算PU愈合率。創(chuàng)面愈合率＝（原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。PU愈合速度＝創(chuàng)面最終愈合時間/創(chuàng)面的最大直徑。2）組織檢測指標(biāo)。在第1、3、7、14日時，每組隨機選取10只大鼠，處死后取PU肉芽組織制成勻漿，1000 r/min離心 10 min，取上清液，作為 MMP-2、FN、TGF-β1 及VEGF的待測樣品，采用固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測 VEGF及 FN 的含量。 MMP-2、FN、TGF-β1等檢測時用相應(yīng)的ELISA試劑盒，嚴(yán)格按實驗步驟操作讀取相應(yīng)值并換算出相應(yīng)濃度即可。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗及 χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠 MMP-2、FN、TGF-β1及 VEGF含量比較 見表1。在治療3、7、14 d時，模型組MMP-2升高，F(xiàn)N、TGF-β1及VEGF均降低，且在7 d時 MMP-2含量升高達峰值，在第14日時FN、TGF-β1及VEGF含量降低達低峰，與空白對照組同期比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。實驗組在第7日時MMP-2含量降低達低峰，在第14日時FN、TGF-β1及VEGF含量最高，實驗組與模型組在第7日和14日時MMP-2、FN、TGF-β1及VEGF含量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表 1 各組大鼠 MMP-2、FN、TGF-β1 及 VEGF 含量比較（±s）

表 1 各組大鼠 MMP-2、FN、TGF-β1 及 VEGF 含量比較（±s）

與模型組同期比較，*P＜0.05；與空白對照組同期比較，△P＜0.05。

組 別 時間空白對照組 1 d（n＝40） 3 d 7 d MMP-2（mg/L） FN（ng/mL） TGF-β1（ng/L）VEGF（ng/mL）1.85±0.17 121.53±10.50 10.12±1.02 36.04±2.69 1.81±0.14 123.07±8.67 10.73±1.23 35.37±2.02 1.87±0.18 121.91±10.52 10.15±1.14 34.76±3.24 14 d 1.86±0.15 122.92±9.47 10.24±1.12 36.12±1.59模型組 1 d 5.97±0.41 67.42±5.91△ 5.31±0.62△ 22.71±2.68△（n＝40） 3 d 7.11±0.65 52.27±5.74△ 5.06±0.81△ 17.78±1.24△7 d 10.15±1.41△ 50.24±4.59△ 2.72±0.65△ 10.82±1.48△14 d 8.54±0.72△ 40.81±5.02△ 1.24±0.23△ 6.75±0.48△實驗組 1 d 5.76±0.62 68.53±7.05 5.75±0.96 21.32±1.25（n＝40） 3 d 5.10±0.40 70.15±5.23 5.91±0.67 18.57±10.51 7 d 2.16±0.17* 89.71±7.25* 7.34±0.52* 26.24±3.72*14 d 1.90±0.16* 117.47±10.50* 9.27±1.07* 37.32±5.11*

2.2 各組組大鼠PU治療效果比較 見表2。模型組大鼠PU顯效和愈合時間延長、愈合率低、愈合速度緩慢。與模型組比，實驗組大鼠PU顯效和愈合時間較模型組明顯縮短、愈合速度較模型組明顯增快、創(chuàng)面愈合率明顯高于模型組（P＜0.05）。

表2 兩組大鼠PU顯效、愈合時間及愈合速度、愈合率比較（±s）

表2 兩組大鼠PU顯效、愈合時間及愈合速度、愈合率比較（±s）

與模型組比較，△P＜0.05。

組 別 愈合速度（mm/d）創(chuàng)面愈合率（%）模型組 0.09±0.04 35.48±4.17實驗組 0.31±0.08△ 87.54±1.57△n 40 40愈合時間（d） 顯效時間（d）12.73±2.91 9.25±1.54 9.36±2.53△ 6.98±1.26△

3 討 論

FN主要由纖維母細(xì)胞和血管上皮細(xì)胞產(chǎn)生，是一種能維持表皮細(xì)胞完整性及防御功能的膠原蛋白。FN廣泛存在于基膜與相鄰細(xì)胞間、細(xì)胞表面及結(jié)締組織中，其與膠原纖維、纖維蛋白原結(jié)合后形成基層膠原纖維-纖維蛋白復(fù)合物，這種復(fù)合物可促進壓瘡創(chuàng)緣上皮細(xì)胞增殖并提高防御功能，因此，F(xiàn)N在創(chuàng)面修復(fù)愈合過程中起重要作用［8］。TGF-β1促進膠原蛋白合成，并可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖，在創(chuàng)面高濃度的TGF-β1會促進膠原蛋白沉積及表皮纖維化的形成，因此，在組織損傷修復(fù)過程中，TGF-β1短暫的增加有利于損傷組織的修復(fù)。當(dāng)組織損傷時TGF-β1被激活而釋放出來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，通過抑制蛋白酶和基質(zhì)酶的活性，促進胞外基質(zhì)沉積，促進前膠原蛋白I及纖維素結(jié)合素合成，從而增加膜受體、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，驅(qū)使炎性因子向損傷部位移動，進而誘導(dǎo)新生肉芽組織生成，加速組織的修復(fù)［9］。MMP-2 屬明膠酶，是 MMP家族中重要組成成員，MMP-2在細(xì)胞基質(zhì)降解中發(fā)揮重要作用，大量存在MMP-2會降解纖維蛋白及細(xì)胞基質(zhì)，加重破損及炎癥組織上炎性細(xì)胞浸潤浸潤，造成壓瘡愈合減緩［10］。

正常表皮組織上僅有少量MMP-2表達，而TGF-β1、FN和VEGF相對較多，這在空白對照組中檢測結(jié)果得以證實，而在PU形成后，MMP-2會大量分泌，這可能是炎癥刺激造成的，MMP-2表達增多又會進一步加劇炎癥反應(yīng)，造成PU表皮形成潰瘍，模型組在治療3、7、14 d 時，MMP-2 升高，F(xiàn)N、TGF-β1 及 VEGF 均降低，且在7 d時MMP-2含量升高達峰值，在第14日時FN、TGF-β1及VEGF含量降低達高峰，與空白對照組同期比較差異顯著，提示在PU的病理進程中，MMP-2、FN、TGF-β1及VEGF等均參與其中，提示PU本身會促進MMP-2分泌，抑制FN、TGF-β1及VEGF分泌，并且形成這種惡性循環(huán)，這應(yīng)是PU形成后經(jīng)久不愈的病理基礎(chǔ)。

在本實驗中，實驗組PU潰瘍皮膚經(jīng)涂敷玫及乳膏治療，在第7日時MMP-2含量降低達低峰值，在第14日時FN、TGF-β1及VEGF含量最高且達高峰值，顯效和愈合時間均較模型組縮短，愈合速度和愈合率均較模型組提高，提示玫及乳膏治療大鼠Ⅲ期壓瘡效果顯著。實驗用玫及乳膏主要配方中有中藥丹參、當(dāng)歸、黃連、白及、黃芪，油性物質(zhì)有乳化硅油、霍霍巴油、甘油及輔料十二烷基硫酸鈉、氮酮、碳酸二辛酯、羥苯乙酯等，具有消腫排膿、養(yǎng)血排毒、生肌斂瘡、祛腐生肌等功效，臨床用于治療PU［11］。實驗組在使用玫及乳膏后，可能首先抑制MMP-2分泌，使PU潰瘍面纖維蛋白增多，抑制創(chuàng)面纖連蛋白及細(xì)胞基質(zhì)的降解，這可減輕其對創(chuàng)面完整性的破壞，有利于創(chuàng)面愈合。實驗組在第14日時FN、TGF-β1及VEGF含量最高且達峰值，提示玫及乳膏吸收后還能促進FN、TGF-β1及VEGF合成及分泌。VEGF及TGF-β1能促進血管內(nèi)皮及成纖維細(xì)胞生長，F(xiàn)N可促進PU創(chuàng)緣上皮細(xì)胞增殖，在其共同作用下加速PU局部創(chuàng)面微血管及肉芽組織新生，加速PU修復(fù)［12-14］。另外，玫及乳膏中的輔料如油性物質(zhì)乳化硅油、霍霍巴油、甘油及輔料十二烷基硫酸鈉、氮酮、碳酸二辛酯、羥苯乙酯等也具有保濕作用，促使表皮壞死組織軟化、溶解，還可吸收創(chuàng)面滲液、促進肉芽組織生長的作用，符合PU“濕性愈合”的理論［15］。

綜上所述，玫及乳膏可能通過抑制MMP-2合成來降低創(chuàng)面細(xì)胞基質(zhì)及纖連蛋白的降解，增加FN、TGF-β1及VEGF的表達，進而促進間質(zhì)細(xì)胞的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，促進PU潰瘍面血管內(nèi)皮及肉芽組織新生、改善PU潰瘍面微循環(huán)、提高創(chuàng)面愈合率和愈合速度，從而加速壓瘡潰瘍面組織修復(fù)。

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