神經(jīng)干細(xì)胞移植及人參川芎嗪注射液干預(yù)對(duì)腦梗死大鼠BDNF蛋白表達(dá)的影響

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隨著我國(guó)生活水平的升高，而忽略了科學(xué)的生活習(xí)慣，是導(dǎo)致我國(guó)現(xiàn)階段腦梗死發(fā)病率逐年升高的最主要的原因。腦梗死的高致殘率嚴(yán)重影響了人類的生活質(zhì)量，而以我國(guó)的形勢(shì)最為嚴(yán)峻[1]。雖然溶栓治療對(duì)部分急性腦梗死病人的康復(fù)有明顯效果，但因有時(shí)效限制，且有誘發(fā)腦出血潛在危險(xiǎn)，故無(wú)法惠及所有病人[2]，目前種類繁多的神經(jīng)保護(hù)藥物臨床應(yīng)用療效欠佳[3]。因此腦梗死的有效治療仍是現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)。

腦梗死發(fā)生后神經(jīng)細(xì)胞因缺血導(dǎo)致?lián)p傷或凋亡，損傷的神經(jīng)細(xì)胞膜通透性增加，炎性細(xì)胞聚集，有害的細(xì)胞因子表達(dá)升高，神經(jīng)細(xì)胞自我修復(fù)能力下降[4]。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)有強(qiáng)大的增殖能力，并能分化成為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，且來(lái)源廣泛[5]，Li 等[6]研究顯示，神經(jīng)干細(xì)胞移植可觀察到腦梗死動(dòng)物模型有新生的神經(jīng)細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞被認(rèn)為是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病有確切療效作用的最佳干細(xì)胞[7-8]。

人參川芎嗪注射液有效成分為人參、川芎嗪，兩者聯(lián)合可達(dá)到益氣活血之療效，有研究顯示，人參川芎嗪注射液可以正面干預(yù)大鼠缺血性腦梗死[9]。本研究通過(guò)人參川芎嗪注射液聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠腦梗死模型的干預(yù)，檢測(cè)NSCs的遷移情況，觀察神經(jīng)功能的變化，檢測(cè)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)基因以及BDNF蛋白的表達(dá)水平，來(lái)綜合評(píng)價(jià)其治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 純系成年清潔SD大鼠60只，2月～3月齡，體重170 g～220 g，孕14 d～16 d的SD大鼠2只，均購(gòu)于河北醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(冀)20140009。飼養(yǎng)溫度20 ℃～25 ℃，相對(duì)濕度(57±3)%，正常飼養(yǎng)，以動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處置。

1.2 主要試劑及設(shè)備 人參川芎嗪注射液，天洋(安徽)藥業(yè)生產(chǎn)；IMDM、BrdU、BrdU一抗、Brdu二抗，購(gòu)自美國(guó)Bachem公司；Trizol試劑盒，購(gòu)自Cytoskeleton公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、羊抗兔二抗，購(gòu)自海泰克生物技術(shù)有限公司；引物序列，購(gòu)自成都法瑪基因科技有限公司；紫外透射儀，購(gòu)自美國(guó)UVP公司；熒光顯微鏡，購(gòu)自上海研潤(rùn)光機(jī)科技有限公司；PVDF膜，購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司；ECL試劑盒，購(gòu)自福建博特生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NSCs的分離培養(yǎng) 取孕14 d～16 d的SD大鼠1只，10 g/L巴比妥鈉注射液以35 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射，75%酒精浸泡10 min后經(jīng)腹部切口切開(kāi)顯露子宮，剪開(kāi)子宮將胎鼠取出，將胎鼠的大腦開(kāi)顱暴露，精細(xì)剝除腦膜及血管組織，小心摘取胎鼠的端腦組織。將所得腦組織切碎成小顆粒并用200目篩網(wǎng)分散過(guò)濾，移入盛有標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的細(xì)胞離心管內(nèi)，輕輕吹打制成單細(xì)胞懸液，將濃度調(diào)整為1×106/mL，接種細(xì)胞至Corning培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置入37 ℃，5%二氧化碳(CO2)設(shè)定的培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，隔天更換1次培養(yǎng)液，2.5 g/L胰蛋白酶和0.02% EDTA混勻后將聚集的干細(xì)胞消化成單細(xì)胞，進(jìn)行離心后更換為新鮮的培養(yǎng)液仍如上條件下培養(yǎng)。每4 d進(jìn)行1次換液，每7 d傳代1次，繼續(xù)培養(yǎng)至12 d。于移植前1 d加入10 mg/L的Brdu至培養(yǎng)液進(jìn)行標(biāo)記，靜置1 d后以IMDM洗滌3次，再進(jìn)行消化、離心，以生理鹽水將細(xì)胞懸液調(diào)配成1.6×108/mL，轉(zhuǎn)至EP管中備用。應(yīng)用免疫熒光法于熒光顯微鏡下對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.3.2 動(dòng)物模型的建立 采用Zea Longa線栓法[10]制作急性腦梗死大鼠模型。6%水合氯醛腹腔注射(5 mL/kg)麻醉，將大鼠固定在操作臺(tái)，取頸正中偏右切口分離大鼠的右頸總動(dòng)脈，將頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處游離，于遠(yuǎn)端結(jié)扎頸外動(dòng)脈。頸總動(dòng)脈分叉下方切一小口，迅速將0.2 mm的鈍頭尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，進(jìn)線至分叉處約2 cm感受到輕度阻力后固定尼龍線，保留1 h后拔出縫合血管并逐層關(guān)閉傷口。大鼠出現(xiàn)動(dòng)脈閉塞對(duì)側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙可認(rèn)定造模成功。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 大鼠腦梗死模型制備成功術(shù)后第3天，將進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的大鼠隨機(jī)分為NSCs移植組、聯(lián)合組和模型組。將BrdU標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/L，NSCs移植組和聯(lián)合組經(jīng)尾靜脈注射10 μL NSCs，模型組則注射10 μL生理鹽水。各組動(dòng)物于術(shù)后第6天開(kāi)始，聯(lián)合組經(jīng)腹腔注射人參川芎嗪注射液以10 mg/kg劑量每日給藥一次，連續(xù)給藥15 d，NSCs移植組和模型組則以相同體積生理鹽水經(jīng)尾靜脈注射。

1.3.4 免疫熒光法檢測(cè)各組梗死區(qū)BrdU標(biāo)記 NSCs的數(shù)目及遷移趨勢(shì) 移植術(shù)后4周，采取免疫熒光檢測(cè)方法[11]觀測(cè)各組梗死區(qū)BrdU標(biāo)記 NSCs 的數(shù)目及遷移情況。每組隨機(jī)選取6只大鼠麻醉下處死，取大鼠梗死區(qū)腦組織制作5 μm切片，經(jīng)脫蠟后放入梯度酒精中水化。PBS沖洗3次，置入2 mol/L的HCl中冰上孵育10 min，室溫下繼續(xù)孵育10 min，再于37 ℃下孵育20 min，放入硼酸中和。PBS沖洗后加入BrdU一抗(1∶50)，37 ℃避光孵育1 h后再放入4 ℃保溫箱孵育過(guò)夜，經(jīng)12 h后滴加熒光二抗，室溫下避光1 h晾干，在高倍鏡(×200)下于切片內(nèi)滿意視野中隨機(jī)選取10個(gè)進(jìn)行觀測(cè)，對(duì)每個(gè)視野內(nèi)的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，所得數(shù)據(jù)取其均值。

1.3.5 通過(guò)BBB評(píng)分觀察各組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 3組大鼠均于移植及移植后的1周、2周、3周進(jìn)行相關(guān)神經(jīng)行為評(píng)定。以BBB評(píng)分(Basso，Beattie，and Bresnahan Locomotor Rating Scale，BBB Scale)[12]為觀測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，患側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)功能總分21分，患側(cè)后肢全癱為0分，功能完全正常者為21分，觀測(cè)項(xiàng)目：關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍、負(fù)重程度、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性、肢體與尾部活動(dòng)狀態(tài)等。評(píng)分均固定于每日09：00于空曠安靜的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)由2位非本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)組專業(yè)人員進(jìn)行。取兩名人員評(píng)分的均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)梗死組織BDNF基因的表達(dá) 依照參考文獻(xiàn)[13]方法，移植后2周，應(yīng)用Trizol試劑使用說(shuō)明分別提取3組細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)驗(yàn)引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)重復(fù)操作3次，擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s；57 ℃退火5 s；72 ℃延伸55 s；72 ℃反應(yīng)10 min；共36個(gè)循環(huán)。PCR所得產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，應(yīng)用紫外透射儀進(jìn)行觀測(cè)并記錄結(jié)果。用BDNF/GAPDH比值代表BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.7 采用WesternBlot法檢測(cè)梗死組織BDNF蛋白的表達(dá) 依據(jù)參照文獻(xiàn)[14]步驟方法，取各組的梗死組織懸液經(jīng)細(xì)胞裂解液反應(yīng)后以離心半徑16 cm，1 500 r/min離心15 min，取上清，每組分別取8.2 μg蛋白，以Bradford法進(jìn)行總的蛋白濃度測(cè)量。5%濃縮膠40 V衡壓1 h，10%分離膠恒壓60 V，3.5 h，濕轉(zhuǎn)14 V恒壓14 h，37 ℃搖床封閉2 h，洗膜10 min，3次，兔抗鼠抗體BDNF于4 ℃ 過(guò)夜；抗鼠GAPDH(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜。TBST 洗膜5 min×4次，山羊抗兔抗體1∶700，37 ℃搖床孵育1.5 h，TBST洗膜5 min×4次。再次運(yùn)用TBS洗膜10 min后ECL顯色 ，按Quantity one圖像進(jìn)行分析研究，BDNF與GAPDH的灰度積分的比值進(jìn)行分析，作為BDNF蛋白表達(dá)的量。

2 結(jié) 果

2.1 NSCs的形態(tài)觀察 細(xì)胞提純前光鏡下可見(jiàn) NSCs呈球狀，形態(tài)規(guī)則，懸浮生長(zhǎng)，折光性較強(qiáng)，細(xì)胞球中細(xì)胞數(shù)目從數(shù)十個(gè)到數(shù)百個(gè)不等，接種24 h后，大部分細(xì)胞呈貼壁(見(jiàn)圖1A)，3 d時(shí)可見(jiàn)啞鈴形細(xì)胞分裂相(見(jiàn)圖1B)，4 d時(shí)形成的神經(jīng)干細(xì)胞球增多，大小不均一，形狀不規(guī)則，7 d后可見(jiàn)懸浮的神經(jīng)球，形狀規(guī)則，呈球形，球體中間細(xì)胞密集，細(xì)胞界限不清(見(jiàn)圖1C)。神經(jīng)干細(xì)胞Nestin免疫熒光化學(xué)染色呈綠色球形。詳見(jiàn)圖1。

圖1體外分離培養(yǎng)大鼠的NSCs(倒置顯微鏡，×200)

2.2 免疫熒光法檢測(cè)各組梗死側(cè)BrdU標(biāo)記NSCs的數(shù)目及遷移趨勢(shì) 免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，BrdU熒光染色在鏡下表現(xiàn)為紅色，細(xì)胞呈神經(jīng)元形態(tài)，BrdU 分布于胞漿及胞核。腦梗死組僅有少量的 BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)，而NSCs移植組有較多的 BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)(P<0.01)。與腦梗死組、NSCs移植組相比，聯(lián)合組BrdU 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量最多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組BrdU標(biāo)記 NSCs的數(shù)目比較見(jiàn)圖2。從圖2C中還可以看出，聯(lián)合組BrdU標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞較腦梗死組及NSCs移植組更廣泛地分布于病灶遷移的路徑上。提示人參川芎嗪注射液干預(yù)更好地提高了腦梗死后NSCs 的增殖及遷移能力。

圖2 BDNF蛋白的相對(duì)表達(dá)量(×200)

2.3 BBB神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果 移植前各組大鼠的神經(jīng)學(xué)功能評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，移植后1周、2周、3周，聯(lián)合組的BBB神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯高于腦梗死組及NSCs移植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

2.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)BDNF基因表達(dá)結(jié)果 移植后2周，聯(lián)合組BDNF mRNA表達(dá)水平明顯高于腦梗死組及 NSCs移植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3、圖3。

組別nBDNFmRNA腦梗死組200．42±0．08NSCs移植組200．82±0．071)聯(lián)合組201．75±0．091)2) 與腦梗死組同時(shí)間比較，1)P<0．05；與NSCs移植組同時(shí)間比較，2)P<0．05。

圖3各組BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.5 Western Blot檢測(cè)BDNF蛋白表達(dá)結(jié)果 聯(lián)合組BDNF蛋白表達(dá)水平明顯高于腦梗死組及NSCs移植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表4、圖4。

組別n BDNF蛋白腦梗死組200．43±0．01NSCs移植組200．82±0．051)聯(lián)合組201．65±0．021)2) 與腦梗死組同時(shí)間比較，1)P<0．05；與NSCs移植組同時(shí)間比較，2)P<0．05。

圖4各組BDNF蛋白表達(dá)

3 討 論

腦梗死后神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡，多位學(xué)者認(rèn)為梗死灶周圍的“缺血半暗帶”是關(guān)系到神經(jīng)功能恢復(fù)程度的關(guān)鍵部位，故治療重點(diǎn)應(yīng)是盡量保存該區(qū)有活性的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量[15-16]。長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)是無(wú)再生性的，但近年不斷對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及干細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞具有再生能力，對(duì)腦梗死后的神經(jīng)恢復(fù)有明顯促進(jìn)作用[17-18]。

干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞與成體干細(xì)胞，具備強(qiáng)大的自我增殖和分化潛能，是高度未分化細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞包括神經(jīng)干細(xì)胞和骨髓造血干細(xì)胞，而神經(jīng)干細(xì)胞可以在一定時(shí)間內(nèi)在靶區(qū)向神經(jīng)系統(tǒng)多類細(xì)胞定向分化，并有明確的治療效果[19]。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)免疫應(yīng)答的反應(yīng)非常微弱，可以有較多的存活細(xì)胞到達(dá)缺血半暗帶區(qū)[20-21]。Mei等[22]研究顯示，神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過(guò)移植到缺血區(qū)腦組織，可以明確縮小腦梗死面積，實(shí)驗(yàn)大鼠的神經(jīng)功能障礙有明顯改善。Savitz等[23]將腦梗死后遺留神經(jīng)功能缺陷的病人進(jìn)行豬胎兒來(lái)源的干細(xì)胞移植，經(jīng)移植術(shù)后數(shù)個(gè)月檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，部分病人的肢體活動(dòng)及語(yǔ)言障礙有改善，影像學(xué)檢查亦提示移植區(qū)出現(xiàn)了信號(hào)增強(qiáng)。

前人研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)尾靜脈注射神經(jīng)干細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)鼠后，神經(jīng)干細(xì)胞可以定向遷移至腦梗死區(qū)[24-26]，其具體機(jī)制：急性腦梗死后的血腦屏障通透性增加，神經(jīng)干細(xì)胞可以較輕易地穿過(guò)血腦屏障遷移至壞死病灶周圍；細(xì)胞表面某些黏附因子誘導(dǎo)干細(xì)胞的定向遷移[26-27]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了經(jīng)尾靜脈注射干細(xì)胞的移植方法，而放棄了有創(chuàng)的定向移植手術(shù)，這樣既簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，又可以減少因手術(shù)導(dǎo)致的炎性反應(yīng)及穿刺出血致使移植失敗的概率，對(duì)臨床應(yīng)用更有實(shí)際意義。

有實(shí)驗(yàn)表明，川芎嗪可以在一定程度上保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[28]，其有效成分川芎可以有效透過(guò)血腦屏障，經(jīng)過(guò)促血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的刺激，可以對(duì)缺血性腦組織損傷的動(dòng)物模型在干細(xì)胞移植后起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和改善微循環(huán)的作用[29]。川芎嗪在體內(nèi)有類似鈣離子通道阻滯劑作用，川芎嗪以抑制細(xì)胞膜的鈣離子通道形式，增加了細(xì)胞內(nèi)的鈣離子負(fù)荷超載障礙[30]。Fan等[31]的研究提示川芎嗪可以強(qiáng)化神經(jīng)元細(xì)胞的抗氧化能力，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，清除神經(jīng)細(xì)胞的氧自由基，從而減輕神經(jīng)細(xì)胞的功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪有誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的作用，撒亞蓮等[32]經(jīng)過(guò)川芎嗪干預(yù)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后，干細(xì)胞逐步分化演變?yōu)樯窠?jīng)元樣結(jié)構(gòu)，并且各細(xì)胞存在軸突間的連接。人參組分對(duì)缺血性腦血管病的影響已有較多研究，其作用機(jī)制可能是改善缺血區(qū)腦組織的血液循環(huán)，降低腦水腫嚴(yán)重程度[33-34]，改善血液流變學(xué)狀態(tài)以及抑制血小板作用[35]。

為提高移植干細(xì)胞的存活率及向神經(jīng)細(xì)胞的定向分化率，兼顧改善干細(xì)胞靶點(diǎn)的微環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)采用了人參川芎嗪注射液聯(lián)合NSCs移植的方法。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖與分化[36]，促進(jìn)神經(jīng)元的代謝，并對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用[37]。通過(guò)觀察大鼠神經(jīng)功能的變化以及BDNF基因及蛋白的表達(dá)水平變化，評(píng)價(jià)人參川芎嗪注射液與NSCs移植聯(lián)合干預(yù)大鼠急性腦梗死模型的療效。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組NSCs數(shù)目較單純NSCs移植明顯增多，神經(jīng)功能各項(xiàng)指標(biāo)以聯(lián)合組表現(xiàn)最優(yōu)，而NSCs移植組明顯優(yōu)于腦梗死組；BDNF基因及蛋白的表達(dá)水平，聯(lián)合組明顯高于腦梗死組及 NSCs移植組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示神經(jīng)干細(xì)胞移植及人參川芎嗪注射液聯(lián)合干預(yù)能夠促進(jìn)大鼠腦梗死后BDNF基因與蛋白的表達(dá)，并能明顯改善腦梗死后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。

綜上所述，人參川芎嗪配合神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合治療大鼠腦梗死后模型，比單純神經(jīng)干細(xì)胞移植能從更多途徑促使神經(jīng)功能有效恢復(fù)。進(jìn)一步探討神經(jīng)干細(xì)胞與人參川芎嗪等協(xié)同干預(yù)具體的作用機(jī)制，以及如何增加神經(jīng)干細(xì)胞的存活率和定向分化程度，需要更多的實(shí)驗(yàn)研究豐富實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療腦梗死使神經(jīng)功能有效恢復(fù)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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